Molekulární mechanismy anti-melanogenního geduninu odvozené od stromu Neem
Mar 28, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Hwang-Ju Jeon 1, Kyeongnam Kim 1, Chaeeun Kim 2, Myoung-Jin Kim 1, Tae-Oh Kim 3,4,5,† a Sung-Eun Lee 1,2,*,†
Abstraktní:Melanogeneze představuje řadu procesů, které produkují melanin, ochranný pigment kůže (proti ultrafialovým paprskům), a určují barvu lidské kůže. Chemické látky snižující produkci melaninu byly na kosmetickém trhu vždy žádané kvůli zájmům péče o pleť, jako je bělení. Hlavním mechanismem inhibice produkce melaninu je inhibice tyrosinázy (TYR), klíčového enzymu pro melanogenezi. Zde jsme hodnotili pravý (Ged), reprezentativní limonoid, pro jeho antimelanogenetický účinek. Produkce melaninu in vitro byla stimulována hormonem stimulujícím alfa-melanocyty (-MSH) v buňkách myšího melanomu B16F10. Ged snížil produkci melaninu stimulovanou MSH, inhiboval aktivitu TYR a množství proteinu. Tento výsledek jsme potvrdili in vivo na modelu zebřičky pro melanogenezi. Během vývoje ve všech ošetřených koncentracích nebyly zjištěny žádné známky toxicity a malformace zebrafishembryí. Ged snížil počet produkovaných embryí zebřiček a obsah melaninu v embryích. Vysoce aktivní koncentrace Ged (100 uM) byla mnohem nižší než pozitivní kontrola, kyselina kojová (8 mM). Ged by tedy mohl být fascinujícím kandidátem na antimelanogenetická činidla.
Klíčová slova: MITF; transkripční faktor spojený s mikroftalmií; TYR; tyrosináza; DQ; dopachinon; TRP-1; protein 1 související s tyrosinázou; TRP-2; protein 2 související s tyrosinázou; MC1R; receptor melanokortinu 1; -MSH; - hormon stimulující melanocyty; ACTH; adrenokortikotropní hormon; ASP; agoutisignální protein; tábor; cyklický adenosinmonofosfát; CREB; cAMP prvek odezvy
1. Úvod
Melanin je syntetizován v melanosomu, lysozomu podobných organelách melanocytu. V melanosomu je melanin produkován ve dvou pigmentech, eumelaninu a pheomelaninu, které představují hnědočernou a červenožlutou [1]. Syntéza těchto melaninových pigmentů začíná z prekurzoru L-tyrosinu oxidační reakcí L-tyrosinu na sloučeninu zvanou dopachinon (DQ) a L-DOPA [2]. V tomto oxidačním kroku působí tyrosináza (TYR) jako enzym omezující rychlost celkové dráhy biosyntézy melaninu [2,3]. TRP-1a TRP{12}}, blízce příbuzné proteinům melanogeneze, katalyzují dráhu biosyntézy eumelaninu a stabilizují a indukují aktivitu TYR [1]. Proces produkce melaninových pigmentů (tzv. melanogeneze) probíhá v melanosomu melanocytů, v místě syntézy formylaninu a ukládání [4]. V signální dráze melanogeneze je receptor melanokortinu1 (MC1R) členem receptorů spřažených s G-proteinem. MCIR je výchozím bodem pro signalizaci melanogeneze a je aktivován agonisty MC1R, jako je hormon stimulující melanocyty (-MSH), adrenokortikotropní hormon (ACTH) a signalizační protein agouti (ASP) [1,2]. Aktivace signální dráhy -MSH-MC1R zvyšuje koncentraci cyklického adenosinemonofosfátu (cAMP) a fosforyluje prvek odpovědi cAMP (CREB). Fosforylovaný CREB indukuje hladinu proteinu transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF), transkripčního faktoru regulujícího geny související se syntézou melaninu, TYR, protein související s tyrosinázou-1 (TRP-1) a protein související s tyrosinázou -2 (TRP-2)navázáním M-boxu těchto genů [1,5,6]. Mezi pěti melanokortinovými receptory má MC1R nejhojnější melanocyty. Primárně reguluje produkci eumelaninu (černohnědý pigment) aktivací MC1R, když jsou agonisté tohoto receptoru, jako je a-MSH a ACTH, převedeni na tento receptor [2,4,7].
I když existují rozdíly mezi savci a rybami, zebřičky mají extrakopii MC5R a MC3R, kterou pufferfish nemají [7], a tato signální dráha stále existuje u zebřiček a funguje přesně jako v melanocytech savců [7]. počet studií o inhibici tvorby melaninového pigmentu se zvýšil díky jeho výzkumným výhodám, jako je rychlý vývoj u embryí v raném stádiu a snadné pozorování [8–11]. V těchto jevech mnoho předchozích studií zjistilo, že inhibice této signální dráhy snižuje produkci melaninu a objevilo několik inhibitorů, včetně bisabolol-Angelone, 4-hydroxy-3-methoxy cinnamaldehydu a difenyl-methylen-hydrazinkarbothiaminu [12 –14].
Gedunin (Ged), známý inhibitor proteinu tepelného šoku 90, je limonoid, který se nachází v rodech rostliny Meliaceae. Tento limonoid se hojně vyskytuje především v oplodí mladých plodů neemu indického (Azadirachta indica) a má různé biologické aktivity, včetně protirakovinných, antimalarických, protizánětlivých, antidiabetických, antialergických, insekticidních, herbicidních a antifungálních [15–18]. Neexistuje žádná zpráva o mechanismu antimelanogenního účinku Ged.
Jako kandidát na léčivé nebo kosmetické činidlo k léčbě onemocnění souvisejících s melaninem nebo barevných změn kůže může mít Ged výhody díky svým bezpečným, přirozeně se vyskytujícím rostlinným vlastnostem [19]. Anti-melanogenní účinek Ged byl hodnocen in vitro a in vivo pomocí buněk myšího melanomu B16F10 a embryí zebřičky, aby se našel vhodný kandidát na tresky bezvousé, jedna z největších částí komerčního kosmetického trhu. byl také proveden test, aby se ukázalo, jak Ged možná působí na zvířata.
2. Materiál a metody
2.1. Chemikálie a činidla
Ged byl zakoupen od Microsource Discovery Systems, Inc. (Gayloardville, CT, USA). Stimulátor melanogeneze, -MSH, antimelanogenní sloučenina a kyselina kojová byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Všechna ostatní činidla byla vyšší než molekulárně biologický stupeň.
2.2. Buněčná kultura
Myší buněčná linie melanomu a karcinomu, B16F10, byla získána z American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) a kultivována s 10% fetálním bovinním sérem (v/v) a penicilinem dodaným Dulbeccem modifikovaným Eagleovým médiem (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. Buňky byly kultivovány, dokud konfluence nedosáhla 80 procent, a rozděleny třikrát týdně s dělicím poměrem 1:8. Buňky byly pozorovány každých 12 hodin a byly kontrolovány morfologické změny. Počet pasáží použitých buněk byl udržován malý.
2.3. Test buněčné životaschopnosti
K vyhodnocení proliferačního účinku Ged na buněčnou linii myšího melanomu B16F10 byl test MTS proveden podle dříve popsaného protokolu [20] s použitím soupravy CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Stručně řečeno, 1 x 103 buněk bylo nasazeno do každé jamky 96-jamkové destičky a inkubováno po dobu 24 hodin pro získání. Po inkubaci byl Ged ošetřen různými koncentracemi: 0, 3,12, 6,25, 12.5 25, 50 a 75 uM. Po 48 hodinách bylo přidáno 20 ul testovacího roztoku MTS do každé jamky obsahující 100- ul média s Ged a bez Ged. Po další inkubaci po dobu 4 hodin byla měřena absorbance při 490 nm pomocí spektrofotometru Multiskan GO (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Údaje o absorbanci byly normalizovány s kontrolou a reprezentovány jako procento inhibičního poměru.
2.4. Stanovení obsahu melaninu
Extracelulární a intracelulární obsah melaninu byl stanoven podle modifikované metody dříve popsané [21]. -MSH (200 nM) předem ošetřené melanomové buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin s a bez kyseliny kojové (200 uM) a Ged (25 a 50 uM). Po inkubaci byla shromážděna kultivační média bez fenolové červeně a kultivované buňky byly sklizeny pomocí RIPA lyzačního pufru. Sklizené buňky byly centrifugovány při 4 °C, 13, 000 rpm po dobu 15 minut a pelety byly rozpuštěny v 1 M NaOH, 10% roztoku DMSO při 95 °C po dobu 2 hodin. Absorbance odebraného média a rozpuštěného melaninu byla měřena při 470 nm pomocí spektrofotometru. Všechny vzorky byly normalizovány s koncentrací proteinu stanovenou podle BCA metody.
2.5. Test intracelulární tyrosinázové aktivity
Aktivita buněčné tyrosinázy byla stanovena měřením rychlosti oxidace L-dihydroxyfenylalaninu (L-DOPA), jak bylo uvedeno dříve, s mírnými modifikacemi [22]. Myší melanomové buňky B16F10 byly předem ošetřeny 200 nM -MSH po dobu 1 hodiny a následně ošetření 200 uM kyselina kojová, s Ged a bez Ged (25 a 50 uM) a inkubována po dobu 72 hodin. Po inkubaci byly buňky sklizeny s lyzačním pufrem obsahujícím inhibitor proteinázy a vzorek byl centrifugován při 13,000xg, 4 °C po dobu 15 minut. Supernatant byl přenesen do nové zkumavky. Každý vzorek (20 ul) a 80 ul 40 mM L-DOPA byly smíchány v 96-jamkové destičce a inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin. Absorbance při 475 nm oxidovanou L-DOPA byla stanovena pomocí čtečky mikrodestiček. Hodnota absorbance byla normalizována s koncentrací proteinu každého vzorku.
Přínos extraktu z cistanche: inhibuje expresi tyrosinázy.
2.6. Izolace RNA a qRT-PCR
Izolace celkové RNA a qRT-PCR byly provedeny podle metody dříve popsané v [18]. Celková RNA byla krátce extrahována z každého vzorku pomocí činidla Trizol (Ambion, Austin, TX, USA). Koncentrace extrahované celkové RNA byla stanovena absorbancí při 260 nm a kvalita celkové RNA byla kontrolována s poměrem absorbance 260:280 a 260:230 nm pomocí čtečky mikrodestiček Multiskan GO (Thermo Scientific). TotalRNA (5 ug) byla syntetizována na cDNA pomocí Maxima soupravy pro syntézu prvního vlákna cDNA (Thermo Scientific) a syntetizované cDNA. Hladiny exprese mRNA Mitf, Tyr, Trp-1 a Trp-2 byly stanoveny pomocí Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a nástroje QuantStudio 3 Real-Time PCR ( Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) podle protokolu instruktora. Úroveň exprese genů byla normalizována pomocí glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH).
2.7. Imunoblotová analýza
Imunoblotová analýza byla provedena podle metod popsaných dříve [23]. Proteiny buněk B16f10 byly odebrány pomocí Ceti lyzačního pufru (Translab, Daejeon, Korea) a koncentrace byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů Pierce BCA (Thermo Scientific). Stejné množství proteinů (30 ug) každého vzorku bylo naneseno na gel dodecylsulfát-polyakrylamid sodný a podrobeno elektroforéze. Po separaci byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu a membrána byla blokována v 10% roztoku odtučněného mléka po dobu 2 hodin. Blokované membrány byly inkubovány s primární protilátkou přes noc při 4 °C, následovala další inkubace se sekundární protilátkou při 26 °C po dobu 2 hodin. Primární a sekundární protilátky byly zředěny v poměru 1:1000 a 1:3000, v daném pořadí. Nakonec byly blotované membrány dokumentovány pomocí ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) s ECL činidlem (SuperSignal, Thermo Scientific). Primární a sekundární protilátky byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).
2.8. Test embryí zebrafish
Wild-type zebrafish were thankfully obtained from Professor Tae-Lin Huh, the School of Life Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea. The strain was kept for more than eight generations in a laboratory condition of 26 ◦C ± 1 ◦C, and a day-to-night ratio of 8:16. General fish care and breeding conditions, as previously described, were followed [24]. Ten groups of zebrafish were mated to obtain embryos with a mating ratio (male: female, 1:2), and among obtained embryos, healthy embryos had >80% míra oplodnění a byly vybrány a použity pro experiment. Dvanáct zdravých embryí v každé ošetřené skupině bylo umístěno v každé jamce 96-jamkové destičky s a bez Ged (25, 50, 75 a 100 uM) a kyseliny kojové (8 mM) v E3 médiu ve stádiu štítu. 24 hodin po oplodnění (h/pf) byla embrya zbavena chorionů a abnormalita byla kontrolována každých 24 hodin až do 72 hodin/pf. Fenotyp embryí byl vyfotografován v laterálním a dorzálním pohledu, aby se porovnaly rozdíly mezi skupinami pomocí vzpřímeného mikroskopu BX53 s DP80CCD (Olympus Life Science Solutions, Waltham, MA, USA). Po zobrazení byla embrya homogenizována lyzačním pufrem Ceti (TransLab) a bylo provedeno stanovení koncentrace melaninu, která se rovnala stanovení obsahu melaninu v buňce B16F10.
2.9. Statistická analýza
Všechny statistické analýzy prezentované v této studii byly provedeny pomocí GraphPad Prismv.8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Pro vícenásobná srovnání byla použita jednocestná ANOVA s Tukeyho testem. Všechny údaje jsou uvedeny jako průměr ± standardní odchylky. Významné rozdíly byly považovány za statisticky významné při p <>
3. Výsledky
3.1. Cytotoxický účinek pipelonguminu na buňky B16F10
Před zkoumáním antimelanogenního účinku Ged jsme provedli test životaschopnosti v buněčné linii B16F10, abychom v této studii nastavili rozmezí dávek. V rozmezí koncentrací od 3,12 do 50 uM buňky nevykazovaly žádný inhibiční účinek na růst a jejich relativní proliferace byla od 91,0 procenta do 118,7 procenta (obrázek 1). Na rozdíl od toho, i když existovala nostatistická významnost, skupiny ošetřené 75 uM měly svůj růst mírně inhibovaný (89,3 procent; obrázek 1). Proto byla nejvyšší koncentrace nastavena na 50 uM ve zbývajících experimentech s buněčnou linií.
Obrázek 1. Cytotoxicita geduninu (Ged) v buňkách B16F10
3.2. Gedunin inhibuje produkci melaninu a intracelulární aktivitu tyrosinázy v buňkách myšího melanomu B16F10
Hodnotili jsme antimelanogenní účinek Ged v myších melanomových buňkách B16F10. Agonista MC1R, -MSH, účinně indukoval intracelulární a extracelulární produkci melaninu (obrázek 2a–c). Barva shromážděného média byla tmavá s -MSH (obrázek 2a). Barva vybledla přidáním Ged a účinek byl závislý na dávce (obrázek 2a). Ve výsledcích celkového obsahu melaninu, -MSH zvýšil produkci melaninu v melanocytech přibližně sedmkrát vyšší než kontrolní skupina a stimuloval snížení melaninu přidáním kyseliny kojové, dobře známé pozitivní kontroly v melanogenezi (obrázek 2d). Ged také zkrátil stimuly indukující produkci melaninu v melanocytech ve všech koncentracích testovaných v této studii (obrázek 2d). Navíc v testu tyrosinázové aktivity Ged ukázal silný inhibiční účinek na enzym omezující rychlost, tyrosinázu, v melanogenezi (obrázek 2e). Relativní aktivita tyrosinázy ve skupině léčené 50 uM Ged se snížila o 20 procent a 12,24 procent ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinou stimulovanou a-MSH, v daném pořadí.
Obrázek 2. Antimelanogenní účinek pravého (Ged) na produkci melaninu stimulovanou alfa-melanocyty stimulujícím hormonem (-MSH) v buňkách B16F10.
3.3. Gedunin snižuje genovou expresi související s melanogenezí indukovanou MSH
-MSH (200nM) indukovaná hladina mRNA Mitf; melanogenetický transkripční faktor; a cílové geny Tyr, Trp-1 a Trp-2 (obrázek 3). Léčba Ged snížila hladinu mRNA všech genů způsobem závislým na dávce při koncentraci 25 a 50 uM (obrázek 3). Ve srovnání s pozitivní kontrolou, kyselinou kojovou (200 uM), byl Ged účinnější při snižování mRNA hladina genů souvisejících s melanogenezí v buňkách B16F10. Kromě toho se hladina Mitfand Tyr snížila o 0.10- a 0{16}}krát nižší než u buněk indukovaných -MSH, v tomto pořadí, při koncentraci 50 uM (obrázek 3a,b). Down-regulované hladiny mRNA těchto genů zpomalily hladinu Tyr a snížily množství produkce melaninu TYR méně než kontrolní skupina.
Obrázek 3. Účinek redukce na geny související s melanogenezí.
3.4. Gedunin snížená částka TYR a TYR-1
TYR hraje klíčovou roli v melanogenezi a hladina proteinu tohoto enzymu přímo ovlivňuje melanogenezi. Pokusili jsme se potvrdit změnu množství proteinu, TYR, způsobenou sníženou hladinou mRNA pomocí imunoblotové analýzy. TYR byla znatelně snížena ve srovnání s kontrolou a -MSH byl léčen v závislosti na dávce (obrázek 4a). Navíc TRP-1, základní transkripční faktor TYR, byl mírně snížen (obrázek 4a). Výsledky byly patrnější, když byl každý proteinový pás normalizován pomocí provozního proteinu GAPDH (obrázek 4b,c).
Obrázek 4. Western blotování buněk B16F10 indukovaných alfa-melanocyty stimulujícím hormonem (-MSH) se skutečnou léčbou.
3.5. Toxicita Geduninu proti zebřičce v rané fázi vývoje
Toxikologické hodnocení Ged na zebřičkách v raném stádiu vývoje bylo provedeno před vyhodnocením antimelanogenního testu Ged in vivo. Morfologická abnormalita embryí zebřiček nebyla pozorována v žádné ošetřené koncentraci Ged (obrázek 5a). Testované koncentrace Ged, 25, 50, 75 a 100 uM, míra přežití skupin ošetřených Ged neměla žádné významné rozdíly v 72 h období chemického ošetření (obrázek 5b).
Obrázek 5. Toxicita pravého (Ged) na zebřičky v raném stádiu vývoje.
3.6. Gedunin snížil obsah melaninu v embryích zebrafish
Protože Ged nemá žádnou vývojovou toxicitu u embryí zebřičky, zkoumali jsme antimelanogenní účinek v sérii koncentrací Ged, 25, 50, 75 a 100 uM. Při optickém pozorování jsme zkontrolovali tečky pigmentových zebřiček; pohled shora na embrya zebřiček je znázorněn na obrázku 5a. Kyselina kojová má inhibiční účinek na produkci pigmentu embryí zebřičky. Embrya zebrafish ošetřená Ged měla také méně pigmentových teček na hlavě (obrázek 6a). Kromě toho se celkový obsah melaninu extrahovaný z celého těla embryí zebrafish snížil po expozici Ged po dobu 72 hodin jak ve skupinách s kyselinou kojovou, pozitivní kontrolou, tak ve skupinách léčených Ged (obrázek 6b, c)
Obrázek 6. Vliv pravého na produkci melaninu in vivo.
4. Diskuze
V této studii byly hodnoceny inhibiční vlastnosti Ged proti produkci melaninu. Na základě našich zjištění byla inhibiční schopnost Ged přibližně 11.98-krát vyšší než u kyseliny kojové (obrázek 2) a koncentrace Ged ( 50 uM) byla nižší než u kyseliny kojové (200 uM), pozitivní kontroly. Bylo to v souladu s oslabenou aktivitou intracelulární tyrosinázy, enzymu, který přeměňuje L-Dopa na DQ, primární prekurzor eumelaninu a feomelaninu. Snížená aktivita Tyr znamená zpomalení celého procesu produkce melaninu a nedostatek obou konečných produktů, eumelaninu a feomelaninu [1–3]. Hladiny transkriptu a TYR byly regulovány řadou transkripčních faktorů: Mitf, Trp-1 a Trp-2 [1,2]. Snížené množství proteinu a hladiny mRNA znamená aktivovaný MC1R prostřednictvím signální osy -MSH–MC1R–PKA–CREB pomocí -MSH byl downregulován ošetřením Ged v koncentraci 25 a 50 µM, v závislosti na dávce v kvantitativní PCR i Western blotting. Jak bylo popsáno dříve, snížení množství MITF vede k nedostatku Tyr, Trp-1 a Trp-2 prostřednictvím menší vazby na promotorovou oblast těchto genů [25–27]. Snížení těchto transkripčních faktorů vede k nižší úrovni TYR a inhibuje produkci melaninového pigmentu v buňkách B16F10. Současné výsledky navíc ukazují inhibiční účinek Ged na TYR, což je další kritický bod produkce melaninu v melanocytech. Ged také prokázal inhibiční účinek na produkci pigmentu během raného stádia vývoje zebřičky v modelech in vitro a in vivo. Naše výsledky ukázaly, že léčba Gedem po dobu 72 hodin výrazně snížila embryopigmentaci zebřičky. Celkový obsah melaninu a hladiny mRNA příbuzných genů byly sníženy přítomností Ged a tendence těchto výsledků silně podporovala in vitro antimelanogenezní vlastnosti Ged.
Navíc inhibiční schopnost Ged byla mnohem silnější než u kyseliny kojové, jedné z nejběžněji známých sloučenin jako bělícího činidla v kosmetickém průmyslu [6,28]. Koncentrace, při které Ged působil, byla relativně nižší než u kyseliny kojové. Kromě toho předchozí zpráva ukázala, že další běžné bělící činidlo, arbutin, mělo podobný antimelanogenní účinek jako kyselina kojová [2]. Proto by měl být Ged považován za bělící činidlo nahrazující v současnosti používaný arbutin nebo kyselinu kojovou a jako antimelanomadrotikum s ohledem na jeho slibné vlastnosti.
Antimelanogenní vlastnosti Ged byly navrženy již dříve [29,30], ale tyto studie nebyly zaměřeny na specifické mechanismy účinku a pouze pozorovaly změnu cytotoxických účinků a množství produkce melaninu in vitro, zatímco antiproliferativní aktivita a inhibiční účinky na Exprese HSP 90 byla zvýrazněna [31–33]. Byla hlášena možnost použití Ged jako antimelanogenetické látky; tyto studie však nebyly zaměřeny na specifické mechanismy účinku a pouze pozorovaly změnu cytotoxických účinků a množství produkce melaninu in vitro. Pokusili jsme se určit mechanismus buněčné úrovně potvrzením hladiny mRNA a množství proteinu genů souvisejících s produkcí melaninu. Spolu s předchozími zprávami tato studie ukázala nový pohled na Gedas jako složku kosmetických přísad pro dva přínosy, vynikající protirakovinnou a antimelanogenezi, které lze aplikovat jak na melanom vyvolaný UV zářením, tak zejména na akumulaci pigmentu současně.
prášek z extraktu cistanche: čistí volné radikály
5. Závěry
Závěrem lze říci, že všechny tyto výsledky ukázaly, že nová sloučenina, Ged, může být použita jako adepigmentační činidlo pro biosyntézu melaninu, což zkrátilo downstream proteiny TYR, TRP-1 a TRP-2 o snížené množství ve srovnání s hlavním regulační protein MITF v systémech in vitro i in vivo modelu zebřičky.
cistanche tablety
