Modulace signální dráhy receptoru Aryl Hydrocarbon Dopady na replikaci viru Junín, část 2

3. Výsledky a diskuse

3.1. Cesta AHR je během infekce JUNV nadměrně zastoupena

Játra jsou jedním z hlavních cílů během infekce JUNV [22]. Abychom objasnili molekulární mechanismy zapojené do infekce hepatocytů, provedli jsme screening mikročipů Affymetrix, abychom určili odlišně exprimované geny v lidských buňkách HepG2 derivovaných z jater infikovaných JUNV IV4454 po dobu 24 nebo 48 hodin.

Použili jsme software Transcriptome Analysis Console od ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA k vyhodnocení odlišně exprimovaných genů v buňkách infikovaných JUNV ve srovnání s kontrolou (obrázek 1a, b). Celkem 266 a 313 odlišně exprimovaných genů bylo detekováno po 24 a 48 h pi (obrázek la,b).

Test Affymetrix microarray (n=3 nezávislých experimentů na podmínku). Hostitelské geny vykazující alespoň 1.{2}}násobnou změnu v expresi a 95procentní pravděpodobnost, že budou exprimovány odlišně (p=0,05), byly zváženy pro další analýzu. Geny zobrazené červeně byly up-regulovány, geny zobrazené zeleně byly regulovány směrem dolů a geny v šedé nevykazovaly žádnou změnu v expresi ve srovnání s neinfikovanými buňkami HepG2. (b) Diferenciálně exprimované geny mezi falešně infikovanými a JUNV infikovanými buňkami HepG2 po 48 hodinách pi. (c) Analýza genové ontologie odlišně exprimovaných genů v buňkách HepG2 infikovaných JUNV po 48 hodinách pi. (d) Analýza nadměrného zastoupení dráhy buněk HepG2 infikovaných JUNV ve srovnání s buňkami falešně infikovanými, které ukazují hlavní signální dráhy ovlivněné během infekce. Červený pruh zvýrazňuje dráhu AHR. Přerušovaná modrá čára označuje p=0.05. Hodnoty p byly určeny softwarem WebGestalt (http://www.webgestalt.org, přístupný 3. července 2020).

Mezi hostitelskými geny a imunitou existuje úzký vztah. Hostitelské geny do značné míry určují vývoj a funkci imunitního systému člověka a mohou ovlivnit odolnost člověka vůči různým patogenům.

Několik studií ukázalo, že určité genové mutace mohou vést k nerovnováze v imunitním systému. Někteří lidé mohou například trpět chorobami, při kterých imunitní systém přehnaně reaguje, což způsobuje, že imunitní systém napadá tělesné tkáně, jako je revmatoidní onemocnění, systémový lupus erythematodes a další onemocnění. Kromě toho je odolnost vůči patogenům, jako jsou bakterie, viry a paraziti, také spojena s genetickými rozdíly. Někteří lidé se rodí s účinnějším imunitním systémem, který rychleji a úplněji odstraňuje patogeny.

Výzkum vztahu mezi hostitelskými geny a imunitou nám umožnil hlouběji porozumět obranným mechanismům těla a také nám pomohl lépe porozumět reakci těla na různá onemocnění. To má velký význam pro prevenci a léčbu nemocí.

Proto bychom měli věnovat pozornost významu genetického testování a učit se a chápat rozdíly v lidských genech, abychom lépe chránili náš imunitní systém, posílili naši postavu a budovali silné tělo. Z tohoto pohledu musíme zlepšit imunitu. Cistanche dokáže výrazně zlepšit imunitu, protože Cistanche je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály a snižovat oxidační stres. Stimulovat a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Click cistanche tubulosa výhody

K dalšímu studiu dopadu JUNV na buněčnou krajinu jsme použili software WebGestalt (http://www.webgestalt.org, přístupný 3. července 2020), který využívá databázi Wikipathways jako úložiště pro provádění analýzy genové ontologie ( Obrázek 1c) a určit, které signální dráhy byly rozdílně změněny ve srovnání s kontrolou (obrázek 1d).

Pokud jde o analýzu genové ontologie z odlišně exprimovaných genů, došlo k závěru, že infekce JUNV ovlivňuje expresi genů souvisejících s metabolismem RNA, hostitelskými kinázami a metabolismem lipidů (obrázek 1c). Stojí za zmínku, že bylo hlášeno, že tyto biologické procesy a molekulární funkce jsou cílem JUNV během jeho replikačního cyklu [23].

Kromě toho analýza nadměrného zastoupení dráhy odhalila, že infekce JUNV obohacuje signální dráhu AHR po 48 h pi (obrázek 1d) mezi mnoha dalšími cestami (p < 0,05). Zejména jsme detekovali zvýšenou expresi AHR cílového genu CYP1B1, což svědčí o zvýšené aktivitě AHR dráhy.

Během několika posledních let několik studií odhalilo důležitost AHR jako terapeutického cíle během různých patologických scénářů; tak byla vyvinuta široká škála malých sloučenin pro modulaci její aktivity. Rozhodli jsme se dále studovat vliv modulace AHR během in vitro infekce JUNV.

3.2. Farmakologická modulace AHR ovlivňuje replikaci viru

Abychom objasnili roli, kterou hraje AHR v infekcích JUNV, rozhodli jsme se otestovat účinky známých ligandů AHR CH223191 (antagonista) a kynureninu (agonista) na infekce in vitro se dvěma různými kmeny oslabenými JUNV: IV4454 a Candid#1. Léčba a infekce byly prováděny pomocí buněk Huh-7 a Vero. Protože tato poslední buněčná linie nemůže exprimovat a vylučovat interferon typu I (IFN-I), její použití umožňuje určit důležitost exprese IFN-I v potenciální souhře hostitel-virus zprostředkované AHR.

Nejprve byla hodnocena cytotoxicita různých koncentrací jak CH223291, tak kynureninu pomocí MTT testu (obrázek 2a,b) a pozorování pomocí optické mikroskopie (obrázek 2c,d).

Pokud jde o CH223191, pokles viability buněk a morfologické změny spojené s cytotoxickými účinky byly detekovány pouze při koncentracích 80 uM (obrázek 2a,c). Na druhou stranu, kynurenin neindukoval cytotoxické účinky v žádné testované koncentraci (obrázek 2b,d).

Aby se prozkoumal účinek farmakologické modulace AHR během infekce JUNV, byly buněčné kultury ošetřeny vehikulem (DMSO), CH223191 nebo kynureninem a poté infikovány JUNV po dobu 48 hodin, aby se stanovil výtěžek viru. Stručně, Vero a Huh-7 buňky byly ošetřeny vehikulem nebo ošetřeny různými koncentracemi malé molekuly CH223191 (2,5, 5 uM, 10 uM a 20 uM) nebo kynureninu (5 uM, 10 uM, 20 uM a 40 uM) před a po infekci JUNV s IV4454 a Candid#1 při MOI 0,5. Po 48 hodinách byly supernatanty sklizeny a použity k infekci Vero buněk pro test PFU (obrázek 3).

Blokáda AHR významně snížila produkci virových částic v závislosti na dávce, a to i při nejnižší testované koncentraci CH223191. Důležité je, že tento výsledek byl pozorován nejen s použitím obou JUNV-atenuovaných kmenů, ale také v obou infikovaných buněčných liniích (Vero a Huh7). Ošetření buněk Vero a Huh-7 infikovaných JUNV CH223191 snížilo počet virových plaků o 93 procent, respektive o 97 procent (obrázek 3a,b). Tyto výsledky silně naznačují, že signální dráha AHR je důležitým buněčným faktorem během infekce JUNV (obrázek 3a,b). Na druhé straně podávání kynureninu před a po inokulaci JUNV významně nezměnilo získaný virový titr ve srovnání s virovou kontrolou (obrázek 3c,d).

Celkově vzato, výsledky poprvé prokázaly, že AHR je důležitým buněčným faktorem během infekce JUNV in vitro, což naznačuje provirovou roli usnadněním cyklu replikace viru.

3.3. Modulace AHR má vliv na expresi proteinů JUNV

Abychom dále studovali účinky modulace AHR na infekci JUNV, provedli jsme nepřímý imunofluorescenční test. JUNV NP protein je nejhojnější strukturní a funkční protein v rodině Arenaviridae. NP byl tedy vybrán jako zajímavý cíl barvení vzhledem k tomu, že pouze několik studií uvedlo profil exprese NP různých kmenů oslabených JUNV. Naším prvním krokem bylo určit distribuci NP obou kmenů JUNV v našich buněčných modelech, abychom porovnali permisivitu různých buněčných linií a virové šíření obou atenuovaných kmenů v těchto buněčných kulturách (obrázek 4).

Lokalizace NP byla výhradně cytoplazmatická a vykazovala homogenní vzor velké tečkovité akumulace, podobný pro oba kmeny v buněčných liniích Vero a Huh{0}} (obrázek 4).

Dále jsme pomocí imunofluorescence hodnotili dopad farmakologické modulace AHR na expresi NP v buněčných kulturách infikovaných JUNV.

Ve stručnosti, buňky byly naočkovány přes skleněná krycí sklíčka, předem ošetřeny buď vehikulem (DMSOCH223191 (10 uM) nebo kynureninem (40 uM), a poté byly falešně infikovány nebo infikovány JUNV po dobu 48 h. Poté byly buňky fixovány a zpracovány pomocí imunofluorescence test (obrázek 5).

Podání CH223191 výrazně snížilo počet NP-pozitivních buněk v obou buněčných kulturách a pro oba kmeny JUNV (obrázek 5). Tato pozorování korelují s předchozími výsledky znázorněnými na obrázku 3a,b. Blokáda AHR snížila nejen procento buněk infikovaných JUNV, ale také velikost virových ložisek. Buněčné kultury Vero předem ošetřené CH223191 a infikované buď IV4454 nebo Candid#1 vykazovaly 57,14 procent (SD ± 7,98) a 41,17 procent (SD ± 9,05) snížení velikosti ohnisek, v daném pořadí. Kromě toho buněčné kultury Huh-7 předem ošetřené antagonistou a infikované buď IV4454 nebo Candid#1 vykázaly 28,57 procenta (SD ± 8,70) a 12,50 procenta (SD ± 9,30) snížení velikosti ohnisek, v daném pořadí. Na druhé straně bylo pozorováno, že ošetření kynureninem nezměnilo procento NP-pozitivních buněk (obrázek 5) nebo velikost ložisek (nezobrazeno) ve srovnání s neošetřenými infikovanými buňkami.

Podrobnější mikroskopická kontrola navíc ukázala, že virová ložiska byla větší v infikovaných buněčných kulturách Vero ve srovnání s buněčnými kulturami infikovanými Huh-7-. Pozorovali jsme, že průměr Vero buněk infikovaných JUNV na ohnisko sestával z 35 buněk, zatímco průměr buněk Huh-7 infikovaných JUNV na ohnisko sestával ze 6 buněk. Toto očekávané pozorování je v souladu s omezeným virovým prostředím, které buňky kompetentní IFN vnutily množení JUNV [24].

3.4. Potlačení AHR snižuje hladiny viru JUNV

Nakonec, aby se vyhodnotilo, zda blokáda AHR ovlivňuje hladiny JUNV RNA, byly buňky Vero a Huh{0}} ošetřeny buď vehikulem, CH223191 (10 µM) nebo kynureninem (40 µM), a poté byly simulovány nebo infikovány JUNV 48 hod. Poté byly buněčné monovrstvy sklizeny a zpracovány pro RT-qPCR pro monitorování hladin ahr, cyp1a1 a np RNA (obrázek 6).

Bylo pozorováno, že buňky ošetřené CH223191- a buňky infikované JUNV vykazovaly trend směrem k nižším hladinám ahr mRNA ve srovnání se vzorky ošetřenými vehikulem – vzorky infikované JUNV (obrázek 6a,b). Naopak podávání kynureninu vykazovalo trend ke zvýšení hladin ahr mRNA v buňkách infikovaných JUNV ve srovnání se vzorky infikovanými JUNV ošetřenými vehikulem (obrázek 6a, b). V souladu s těmito výsledky ukázala léčba CH223191 trend ke snížení hladin cyp1a1 mRNA v Huh-7 buňkách, zatímco léčba kynureninem vykazovala opačné účinky (obrázek 6c). Pokud jde o hladinu JUNV RNA, bylo pozorováno, že léčba antagonistou AHR CH223191 snížila hladiny virové RNA v infikovaných buňkách ve srovnání se vzorky ošetřenými vehikulem – vzorky infikované JUNV, zatímco buňky ošetřené kynureninem a buňky infikované JUNV měly tendenci zvyšovat Hladiny RNA (obrázek 6d,e).

V této práci jsme poprvé ukázali, že in vitro infekce JUNV indukuje aktivaci signální dráhy AHR v buněčných kulturách získaných z jater. Data mikročipové analýzy ukázala, že signální dráha AHR je nadměrně exprimována v buněčných kulturách infikovaných JUNV po 48 h pi.

Několik studií uvádí, že aktivace AHR může mít různé účinky na buněčnou fyziologii, což ovlivňuje proliferaci a vrozené imunitní odpovědi [6,25]. Ve skutečnosti bylo v posledním desetiletí popsáno, že aktivace AHR má modulační účinky IFN na sekreci cytokinů [26,27]. Důležité je, že upregulační signalizace AHR může snížit antivirovou imunitní odpověď IFN-I [28]. S ohledem na to jsme hodnotili dopad modulace signální dráhy AHR na nekompetentní a kompetentní buněčné kultury IFN, jako jsou buněčné modely Vero a Huh-7, pomocí malých komerčních molekul antagonistů a agonistů AHR během infekce JUNV in vitro dva různé atenuované kmeny.

Prostřednictvím různých přístupů bylo potvrzeno, že negativní modulace AHR prostřednictvím farmakologické inhibice pomocí CH223191 měla antivirovou aktivitu proti JUNV. Po blokádě AHR byla zjištěna inhibice infekce JUNV in vitro. Významné snížení exprese virového proteinu bylo pozorováno v buněčných kulturách infikovaných JUNV ošetřených antagonistou AHR. Kromě toho blokáda AHR snížila produkci extracelulárních infekčních virových částic u oslabených kmenů IV4454 a Candid#1 JUNV studovaných v této práci. Navíc byl pozorován trend k poklesu hladin virové RNA v buňkách ošetřených CH223191-. Je zajímavé, že tyto nálezy byly pozorovány v buněčných liniích Huh-7 i Vero a vykazovaly ekvivalentní rozsah, což naznačuje, že provirová role AHR během infekce JUNV může být nezávislá na signální dráze IFN-I. Tyto výsledky jsou v souladu s našimi předchozími pozorováními u jiných virových modelů [13]. K objasnění, který krok replikačního cyklu JUNV je blokádou AHR ovlivněn, bude zapotřebí více studií.

Studie ukazující aktivaci AHR antropogenními ligandy získaly zvláštní zájem kvůli rostoucímu povědomí o nesprávném využívání životního prostředí a jeho souhře se závažností virové infekce [2]. Všimněte si, že oblast stanoviště pokrytá vektorovými hlodavci JUNV zahrnuje velké území; v současnosti však AHF postihuje pouze omezený a omezený region, kde se provádějí převážně venkovské činnosti [29]. Zemědělští pracovníci jsou navíc hlavní populací ohroženou vážnými projevy onemocnění AHF. Naše současná práce naznačuje, že expozice hlodavců/člověka agonistům AHR může mít dopad na výsledek infekce JUNV.

Přestože bylo v posledních desetiletích věnováno intenzivní úsilí antivirovému výzkumu proti arenavirům [30], v současnosti není k dispozici žádná specifická antivirová chemoterapie pro léčbu ASZ a lidských onemocnění způsobených jinými patogenními členy Arenaviridae. Zejména virus Lassa (LASV) je původcem horečky Lassa (LF), která představuje vážnou lidskou hrozbu v oblastech západní Afriky s velmi vysokou úmrtností [31]. V současnosti je jedinou alternativní léčbou proti LF off-label použití guanosinového analogu ribavirinu, u kterého byla prokázána částečná účinnost u pacientů s LF pouze tehdy, je-li jeho podávání zahájeno do 6 dnů od nástupu symptomů [32,33]. Kromě toho může ribavirin vyvolat nežádoucí vedlejší účinky omezující doporučení jeho podávání pouze pacientům s vysokým rizikem. Pak je reálná poptávka po nových účinných antivirotikech pro terapii arenavirových hemoragických horeček. AHR představuje nový cíl hostitele, který je třeba vzít v úvahu. Ve skutečnosti existuje několik probíhajících klinických studií zahrnujících inhibitory AHR (BAY2416964, IK-175 a HP163) v léčbě různých druhů rakoviny. Tyto studie jsou však v raných fázích a žádná se nezaměřuje na antivirový potenciál farmakologického cílení AHR. Je pozoruhodné, že léky zaměřené na buněčné faktory potřebné v cyklu množení virů znovu získaly zájem o vývoj antivirotik, protože dostali šanci získat širokospektrální inhibitor ovlivňující cíl hostitele společný několika lidským patogenům [34,35], což je rys spojený s AHR.

Závěrem lze říci, že kombinované výsledky této studie zdůrazňují význam modulace signální dráhy AHR jako potenciálního terapeutického cíle proti JUNV. Budoucí studie budou nutné k implementaci AHR cílených terapií k překonání důležitých problémů, jako je dodání ligandů AHR do požadovaných tkání a buněk, aby se minimalizovaly možné účinky modulace AHR mimo cíl.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, CCG; metodologie, MAP, AEADL a ABM; software, FG; validace, MAP a FG; formální analýza, MAP a MFT; vyšetřování, MAP a MFT; zdroje, EBD a CCG; zpracování dat, FG; psaní – příprava původního návrhu, MAP a MFT; psaní – recenze a editace, EBD a CCG; dohled, CCG; administrace projektů, CCG; získávání finančních prostředků, EBD a CCG Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Tato práce byla financována Universidad de Buenos Aires (UBA) (číslo grantu 20020170100363BA) a Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (číslo grantu PIP11220170100171CO). EBD a CCG jsou členy Research Career od CONICET; MFT, AEADL a ABM jsou kolegové z CONICET. MAP je kolega z UBA.

Prohlášení institucionální revizní komise:

Nelze použít.

Prohlášení o informovaném souhlasu:

Nelze použít.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Údaje, které podporují zjištění této studie, jsou na přiměřenou žádost k dispozici od odpovídajícího autora.

Poděkování:

Děkujeme všem zúčastněným členům laboratoří za užitečné rady a diskuse.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů. Investoři nehráli při návrhu studie žádnou roli; při shromažďování, analýzách nebo interpretaci dat; při psaní rukopisu; nebo v rozhodnutí o zveřejnění výsledků.

Reference

1. Head, JL; Lawrence, BP Arylový uhlovodíkový receptor je modulátorem antivirové imunity. Biochem. Pharmacol. 2009, 77, 642–653. [PubMed]

2. Torti, MF; Giovannoni, F.; Quintana, FJ; García, CC Arylový uhlovodíkový receptor jako modulátor antivirové imunity. Přední. Immunol. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Shinde, R.; McGaha, TL Aryl Hydrocarbon Receptor: Propojení imunity s mikroprostředím. Trends Immunol. 2018, 39, 1005–1020. [PubMed]

4. Stockinger, B.; Hirota, K.; Duarte, J.; Veldhoen, M. Vnější vlivy na imunitní systém prostřednictvím aktivace receptoru arylového uhlovodíku. Semin. Immunol. 2011, 23, 99–105.

5. Rothhammer, V.; Borucki, DM; Tjon, EC; Takenaka, MC; Chao, CC; Ardura-Fabregat, A.; de Lima, KA; Gutiérrez-Vázquez, C.; Hewson, P.; Staszewski, O.; a kol. Mikrogliální kontrola astrocytů v reakci na mikrobiální metabolity. Příroda 2018, 557, 724–728. [CrossRef]

6. Quintana, FJ; Basso, AS; Iglesias, AH; Korn, T.; Farez, MF; Bettelli, E.; Caccamo, M.; Oukka, M.; Weiner, HL Kontrola diferenciace buněk Treg a TH17 pomocí receptoru Aryl Hydrocarbon. Příroda 2008, 453, 65–71. [CrossRef]

7. Marshall, NB; Kerkvliet, NI Dioxin a imunitní regulace: vznikající role arylového uhlovodíkového receptoru při tvorbě regulačních T buněk. Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1183, 25–37.

8. Vogel, CFA; Khan, EM; Leung, PSC; Gershwin, ME; Chang, WLW; Wu, D.; Haarmann-Stemmann, T.; Hoffmann, A.; Denison, MS Cross-Talk mezi Aryl Hydrocarbon Receptor a zánětlivou reakcí: Role pro nukleární faktor-KB. J. Biol. Chem. 2014, 289, 1866–1875. [CrossRef]

9. Bankoti, J.; Rase, B.; Simones, T.; Shepherd, DM Funkční a fenotypové účinky aktivace AhR v zánětlivých dendritických buňkách. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 246, 18–28. [CrossRef]

10. Vogel, CFA; Goth, SR; Dong, B.; Pessah, IN; Matsumura, F. Signalizace arylového uhlovodíkového receptoru zprostředkovává expresi indoleaminu 2,3-dioxygenázy. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 375, 331–335. [CrossRef]

11. Jin, GB; Moore, AJ; Head, JL; Neumiller, JJ; Lawrence, BP Aktivace receptoru aryl uhlovodíku snižuje funkci dendritických buněk během infekce virem chřipky. Toxicol. Sci. 2010, 116, 514–522. [CrossRef]

12. Giovannoni, F.; Bosch, I.; Polonio, CM; Torti, MF; Wheeler, MA; Li, Z.; Romorini, L.; Rodriguez Varela, MS; Rothhammer, V.; Barroso, A.; a kol. AHR je hostitelský faktor viru Zika a kandidátský cíl pro antivirovou terapii. Nat. Neurosci. 2020, 23, 939–951. [CrossRef]

13. Giovannoni, F.; Li, Z.; Remeš-Leničov, F.; Dávola, ME; Elizalde, M.; Paletta, A.; Ashkar, AA; Mossman, KL; Dugour, AV; Figueroa, JM; a kol. Signalizace AHR je indukována infekcí koronaviry. Nat. Commun. 2021, 12, 5148. [CrossRef]

14. Buchmeier, MJ; de La Torre, JC; Peters, CJ Arenaviridae: Viry a jejich replikace. In Fields Virology, 4. vydání; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, USA, 2013; s. 1283–1303.

15. Enria, DA; Briggiler, AM; Sánchez, Z. Léčba argentinské hemoragické horečky. Antivir. Res. 2008, 78, 132–139. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com