[6]-Gingerol usnadňuje sekreci CXCL8 a produkci ROS v primárních lidských neutrofilech tím, že se zaměřuje na kanál TRPV1, část 1

1. Úvod

Identifikace složek potravin s imunomodulačními vlastnostmi spolu s jejich příslušnými molekulárními cíli přitahuje v posledních letech zvýšený zájem. Vzhledem k jejich vysoké diverzitě ligandů představuje superrodina iontových kanálů s přechodným receptorovým potenciálem (TRP kanály) velmi zajímavou třídu potenciálních cílových struktur.

Molekulární cíl je specifická molekula, na kterou léčivo působí v těle. Imunita označuje sílu schopnosti těla odolávat nemocem.

Mezi molekulárními cíli a imunitou existuje úzký vztah. Účinky léků často ovlivňují obranyschopnost organismu. Některá léčiva mohou například léčit určitá chronická onemocnění zasahováním do funkce imunitního systému organismu. Léčba nádorů navíc často využívá cílenou terapii, tedy zacílení určitých molekulárních cílů k napadení rakovinných buněk, čímž se zlepšuje schopnost imunity bojovat proti rakovinným buňkám.

Navíc síla imunity ovlivní i účinek léků. Lidé s oslabeným imunitním systémem mohou při užívání zaznamenat vedlejší účinky nebo méně účinné léky, protože imunitní systém léky dobře neabsorbuje, což má za následek méně účinnou léčbu. Proto je udržování zdravého imunitního systému pro medikamentózní terapii velmi důležité.

Závěrem lze říci, že mezi molekulárními cíli a imunitou existuje úzká souvislost a plné pochopení tohoto vztahu má velký význam pro racionální užívání léků. Imunitu bychom měli aktivně zlepšovat, správně užívat léky dle rady lékaře a cílenou terapií zlepšovat imunitu, abychom lépe chránili své zdraví. Z tohoto pohledu musíme zlepšit imunitu. Cistanche dokáže výrazně zlepšit imunitu, protože Cistanche má také antivirové a protirakovinné účinky, které mohou posílit schopnost imunitního systému bojovat a zlepšit obranyschopnost organismu.

Klikněte na zdravotní přínosy cistanche

Nadrodina savčích TRP kanálů zahrnuje šest příbuzných proteinových rodin, jmenovitě ankyrinovou (TRPA), kanonickou (TRPC), melastatinovou (TRPM), mukolipinovou (TRPML), polycystinovou (TRPP) a vaniloidní (TRPV) rodinu, všechny typicky sdílejí šest transmembránových segmentů, které se skládají jako tetramery a vytvářejí póry propustné pro kationty s různou selektivitou kationtů.[1] Kanál TRPV1 může být zdaleka nejintenzivněji zkoumaným členem superrodiny TRP. TRPV1 byl původně identifikován jako receptor pro kapsaicin, štiplavou složku chilli papriček.[2] Později se také ukázalo, že štiplavé přísady ze zázvoru, gingeroly, aktivují TRPV1.[3]

Biologická role TRPV1 v neneuronálních typech buněk je stále předmětem rozsáhlého zkoumání, přesto dostupné výsledky naznačují, že funkce daleko přesahují smyslové a tepelné vnímání. Například 12-týdenní intervence s denní dávkou 0,15 mg agonisty TRPV1 nonivamidu, strukturního analogu kapsaicinu, zabránila dietou indukovanému nárůstu tělesného tuku a zvýšila plazmatický serotonin úrovně u zdravých jedinců s nadváhou.[4]

V adipocytech 3T3-L1 aktivace TRPV1 nonivamidem snížila akumulaci lipidů během diferenciace a zrání potlačením exprese PPAR𝛾.[5] V makrofázích kapsaicin a nonivamid zeslabily LPS-indukované uvolňování prozánětlivých cytokinů, jako je IL6, CXCL8 a TNF-alfa, v závislosti na TRPV1-.[6] Přesto konkrétní funkce TRPV1 v lidských krevních leukocytech zůstávají nejasné. V lidských NK buňkách vyvolalo 10 a 50 μM kapsaicinu zvýšení intracelulárních koncentrací Ca2 plus, což ukazuje na funkční kanál TRPV1.[7]

Tlumené efektorové funkce NK buněk, jako je cytotoxická degranulace a sekrece cytokinů, vyvolané předúpravou buněk kapsaicinem po dobu 1 hodiny v koncentračním rozmezí 10–100 μM, však byly do značné míry nezávislé na TRPV1.[7] ] U T buněk bylo prokázáno, že TRPV1 se účastní procesů signalizace receptorů T buněk, proliferace a diferenciace T buněk a také produkce cytokinů.[8] Předchozí práce naší skupiny také prokázaly funkční expresi TRPV1 v lidských primárních T buňkách.[9] Dále analýzy závislosti odpovědi na dávce v koncentracích od 0,03 do 300 μmol L−1 odhalily, že [6]-gingerol inhibuje sekreci cytokinů primárními lidskými leukocyty s hodnotou IC50 82,2 μmol L−1.

Kvantifikace [6]-gingerolu ve vzorcích plazmy zdravých subjektů však odhalila průměrnou maximální plazmatickou koncentraci pouze 42.0 ± 16,3 nmol L−1 po požití 1 l zázvorového čaje. Vzhledem k tomu, že tyto koncentrace [6]-gingerolu neměly v předchozích studiích žádný významný vliv na sekreci cytokinů,[9] není jasné, zda je dieteticky relevantní koncentrace 50 nmol L−1 v krevní plazmě dosaženo po konzumaci 1 l zázvoru. čaj, je dostatečný k modulaci buněčných imunitních odpovědí v jiných lidských primárních leukocytech.

U lidských neutrofilů jsou znalosti o funkční úloze TRPV1 omezené. Zatímco Köse a Nazıroglu˘ [10] prokázali, že toky Ca2 plus v neutrofilech v reakci na 10 μM kapsaicin jsou sníženy antagonistou TRPV1 kapsazepinem, jiné výsledky neprokázaly, že by kapsaicin indukoval tok Ca2 plus při testování v rozmezí koncentrací 1 –100 μM, navzdory detekovatelné expresi TRPV1 RNA.[11]

Neutrofily jsou nejhojnější leukocyty v lidské krvi a tvoří 60–70 procent všech cirkulujících bílých krvinek. Jsou to první imunitní buňky, které se rekrutují do míst infekce; bývají proto označovány jako první linie obrany.[12] Nábor neutrofilů je spouštěn mimo jiné bakteriálním nebo z mitochondrií odvozeným peptidem N-formylmethionin-leucyl-fenylalaninem (fMLF) nebo chemokiny, jako je CXCL8 (IL-8).[13]

Mezi obranné mechanismy neutrofilů patří fagocytóza,[14] uvolňování antimikrobiálních enzymů degranulací,[15] tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS)[16] a tvorba extracelulárních pastí neutrofilů.[17] Kromě těchto přímých obranných mechanismů neutrofily dále přispívají k následným imunitním odpovědím prostřednictvím uvolňování různých cytokinů a chemokinů.[18] Neutrofily také mohou podstoupit proces aktivace, který jim umožní silněji reagovat na následnou plnou aktivaci.[16b]

V posledních letech přibylo důkazů, že přísady z potravin a/nebo léčivých rostlin mohou modifikovat jednu nebo více z uvedených obranných reakcí lidských neutrofilů. Tyto modifikace zahrnují zvýšenou fagocytotickou aktivitu[19] a tvorbu ROS[20], rozšířenou chemotaxi směrem k fMLF[21] a tvorbu neutrofilních extracelulárních pastí[20]. Avšak aktivní sloučenina (sloučeniny) nebyla identifikována. Složky z Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranyl aceton a isobornyl acetát) desenzibilizovaly neutrofily na fMLF- a CXCL8- indukovaný příliv Ca2 plus a inhibovaly fMLF indukovanou chemotaxi, přičemž aceton-ger vyvolal indukované účinky byly zprostředkovány prostřednictvím TRPV1.[22]

Na základě dostupných údajů jsme předpokládali, že ligandem indukovaná aktivace TRPV1 [6]-gingerolem může ovlivnit obecné funkce neutrofilů, a to buď přímo, nebo zvýšením jejich reakcí na aktivační stimuly. V rámci této hypotézy jsme se zaměřili zejména na objasnění, zda ověřená nutričně relevantní koncentrace postačuje k modulaci buněčných imunitních odpovědí u lidských primárních neutrofilů jako součásti populace leukocytů. '

Dále jsme se snažili porovnat hladiny exprese RNA všech členů savčí superrodiny TRP v pěti nejvýznamnějších typech buněk v lidské krvi, abychom získali kvalitativně a kvantitativně komplexní přehled exprese TRP kanálu v lidských leukocytech.

2. Výsledky

2.1. Hojnost a relativní transkriptové hladiny TRP kanálů v lidských leukocytech

Pro hodnocení exprese RNA kanálu TRP v krevních leukocytech bylo izolováno pět nejvýznamnějších typů leukocytových buněk z krve zdravých dárců a exprese RNA kanálů TRP byla analyzována pomocí kvantitativní RT-PCR (obrázek 1).

Specifické transkripty TRPV i TRPM rodiny byly detekovány s vysokou frekvencí 75–10} procent ve všech analyzovaných typech buněk. Průměrná celková frekvence s ohledem na všechny typy buněk byla 96 procent pro rodinu TRPV a 98 procent pro rodinu TRPM. Transkripty specifické pro TRPC byly mnohem méně hojné, v rozmezí od 0 procent v monocytech, NK buňkách, T buňkách a B buňkách do 100 procent v NK buňkách a T buňkách s celkovou průměrnou frekvencí pouze 53 procent (obrázek 1A). TRPC5-specifický transkript byl detekován pouze v neutrofilech, s frekvencí 70 procent.

Také TRPA1-specifický transkript obecně odhalil poměrně nízkou hojnost v analyzovaných typech buněk s frekvencí 100 procent v neutrofilech, 25 procent v monocytech, 80 procent v NK buňkách, 100 procent v T buňkách a 60 procent procent v B buňkách. Podobně TRPML3-specifický transkript ukázal nízkou frekvenci v neutrofilech (50 procent), monocytech (25 procent), NK buňkách (40 procent) a B buňkách (20 procent), ale frekvenci 100 procent v T buňky. TRPV1-specifický transkript byl detekován ve všech typech buněk, vykazující frekvenci 100 procent v monocytech, NK buňkách a T buňkách a frekvenci 90 procent v neutrofilech a 80 procent v B buňkách.

Co se týče relativní exprese RNA, ve srovnání s příslušnými frekvencemi, kanály TRP odhalily více typ exprese specifické pro buněčný typ, jak je zřejmé ze srovnání příslušných hodnot Act v různých analyzovaných typech buněk (obrázek 1B). Například TRPP3 byl detekován s frekvencí 100 procent ve všech typech buněk, ale nejvyšší úroveň exprese byla zjištěna v monocytech.

Naproti tomu kanál TRPV2 byl detekován ve všech zkoumaných typech buněk, se srovnatelně vysokou hladinou exprese RNA a také vysokou frekvencí. Podobně byly hladiny transkriptů TRPV1 podobné ve všech zkoumaných typech buněk (obrázek 1B).

2.2. Povrchová exprese TRPV1 na neutrofilech

Současné poznatky o funkci TRPV1 v lidských neutrofilech jsou stále nejasné. Abychom dále prozkoumali role TRPV1 v lidských neutrofilech, dále jsme zkoumali, zda je kanál TRPV1 exprimován na povrchu primárních lidských neutrofilů pomocí průtokové cytometrie živých buněk (obrázek 2).

Izolované neutrofily byly obarveny na CD15 jako povrchový marker pro neutrofily (obrázek 2A, B) a současně byly obarveny buď protilátkou vytvořenou proti epitopu v první extracelulární smyčce proteinu TRPV1 (obrázek 2B) nebo příslušnou izotypovou kontrolou, tj. poslední slouží jako náhrada pro měření nespecifické vazby (obrázek 2A). V populaci CD15 plus byla analyzována intenzita fluorescence pro FITC. Barvení neutrofilů protilátkou TRPV1 vedlo k odlišitelnému fluorescenčnímu signálu ve srovnání s izotypovou kontrolou, čímž se potvrdila povrchová exprese TRPV1 v primárních lidských neutrofilech (obrázek 2C). Analýza neutrofilů od čtyř jednotlivých dárců odhalila srovnatelnou povrchovou expresi TRPV1 (obrázek 2D).

2.3. [6]-Gingerolem indukované zvýšení intracelulárního Ca2 plus

Protože ligandem indukovaná aktivace TRPV1 bude mít za následek příliv Ca2 plus [23], intracelulární koncentrace Ca2 plus neutrofilů byly stanoveny pomocí barviva Fura -2 citlivého na Ca2 plus. Na základě našich předchozích zjištění[9] byla zvolena koncentrace 50 nM dobře známého ligandu TRPV1 [6]-gingerolu a inkubační doba 2 hodiny. Analýzy ukázaly, že inkubace neutrofilů s 50 nM [6]-gingerolem vedla ke zvýšeným intracelulárním koncentracím Ca2 plus, které byly v průměru 18,4 procenta ± 1,0 procenta maximální hodnoty, jak bylo stanoveno aplikací 1 μM ionoforového ionomycinu. Zvýšení vyvolané DMSO bylo 4,7 procenta ± 1,2 procenta (obrázek 3).

2.4. Vliv [6]-Gingerolu na expresi TRPV1

Dále jsme se zaměřili na analýzu dopadu stimulace TRPV1 [6]-gingerolem na expresi TRPV1 na úrovni transkriptu prostřednictvím q-RTPCR a také na úrovni povrchového proteinu prostřednictvím barvení živých buněk. Pro tento účel byly lidské neutrofily inkubovány s 50 nM [6]-gingerolem po dobu 2 hodin a byly kvantifikovány příslušné úrovně exprese.

Tato 2h inkubace neovlivnila ani transkript TRPV1, ani hladiny proteinu (obrázek 4) a také nezměnila, s výjimkou IL6, IL17A, IL24, C5 a GDF5, RNA expresi společných zkoumaných genů pro cytokiny a chemokiny (obrázek S1, tabulka S2, Podpůrné informace).

2.5. Vliv [6]-Gingerolu na expresi neutrofilních povrchových markerů

V této sadě experimentů jsme se ptali, zda má [6]-gingerol vliv na expresi běžných povrchových markerů pro neutrofily. Zjistili jsme, že exprese markerů CD11b a CD66b byla zvýšena po 2 hodinách inkubace s [6]-gingerolem ve srovnání s rozpouštědlovou kontrolou, zatímco CD62L nebyl ovlivněn (obrázek 5). Kromě toho byla povrchová exprese fMLF receptoru FPR1 významně zvýšena po ošetření buněk 50 nM [6]-gingerolem ve srovnání s kontrolou s rozpouštědlem.

For more information:1950477648nn@gmail.com