Mitofágie u mozkové ischemie a ischemického/reperfuzního poraněníⅠ

ischemická cévní mozková příhoda je závažné cerebrovaskulární onemocnění s vysokou mortalitou a morbiditou. V posledních letech jsou reperfuzní léčby založené na trombolytické a trombektomii hlavní léčbou pacientů s ischemickou cévní mozkovou příhodou a časové okno rekanalizace bylo prodlouženo na více než 24 hodin. S prodloužením časového okna se však riziko ischemicko/reperfuzního (I/R) poškození po reperfuzní terapii stává velkou výzvou pro výsledky pacientů. Poškození I/R vede k neuronální smrti v důsledku nerovnováhy v metabolické nabídce a poptávce, která obvykle souvisí s mitochondriální dysfunkcí. Mitofagie je typ selektivní autofagie označující proces specifické autofagické eliminace poškozených nebo dysfunkčních mitochondrií, aby se zabránilo tvorbě nadměrného množství reaktivních forem kyslíku (ROS) a následné buněčné smrti. Nedávné pokroky ukázaly, že ochranná role mitofagie v mozkové ischemii je spojena hlavně s jejími neuroprotektivními účinky při I/R poškození. Tento přehled pojednává o zapojení dynamiky mitochondrií a mitofágie do patofyziologie ischemické cévní mozkové příhody a zejména I/R poranění se zaměřením na terapeutický potenciál regulace mitofágie a možnost využití intervencí souvisejících s mitofágií jako doplňkového přístupu pro prodloužení neuroprotektivního časového okna po ischemické cévní mozkové příhodě.

Kliknutím zkontrolujete dávku cistanche pro ischemickou cévní mozkovou příhodu

Klíčová slova: mitofagie, mitochondriální dysfunkce, ischemická cévní mozková příhoda, ischemické/reperfuzní poranění (I/R poranění), rekanalizační terapie, terapeutické okno

VÚVOD

Cévní mozková příhoda je náhlý nástup poruch cerebrálního krevního oběhu způsobený mozkovým infarktem nebo krvácením (Shi et al., 2021). V závislosti na postižené oblasti mozku se u pacientů mohou projevit různé příznaky, z nichž nejčastějšími jsou akutní nástup slabosti na jedné straně těla a snížená schopnost mluvit (Nor et al., 2005). Cévní mozková příhoda je podle American Heart Association (AHA) pátou nejčastější příčinou úmrtí. Přibližně 795000 lidí každý rok trpí buď novými, nebo opakujícími se mozkovými příhodami (Virani Salim et al., 2020). Existují dva hlavní typy mrtvice: ischemická mrtvice a hemoragická mrtvice. Při ischemické mrtvici je průtok krve blokován trombózou vytvořenou kolem prasklých aterosklerotických plátů v tepně, zatímco hemoragická mrtvice je obvykle výsledkem krvácení vyvolaného prasknutím krevní cévy.

Ischemická mrtvice představuje asi 87 procent všech případů mrtvice. Proto je ve výzkumu a klinické praxi věnována velká pozornost. Blokovaný průtok krve vede k nedostatku kyslíku a živin, což spouští ischemickou kaskádu v mozku. Byla by narušena produkce adenosintrifosfátu (ATP), což je často smrtelná situace pro zranitelné mozkové buňky, které jsou vysoce energeticky závislé. Podrobně, selhání při generování ATP může mít za následek oslabenou aktivitu iontových kanálů závislých na ATP, včetně sodíkových kanálů, což způsobuje intracelulární hyperosmolaritu (Deb et al., 2010). Také zvýšené anaerobní dýchání během ischemie produkuje vedlejší produkt kyselinu mléčnou, což vede k metabolické acidóze. Závažné změny v iontové rovnováze mohou způsobit cytotoxický edém a narušit aktivitu glutamátového receptoru, což nakonec poškodí DNA a strukturální proteiny nebo dokonce vede k buněčné smrti (Nishizawa, 2001; Deb et al., 2010). Ireverzibilní neuropatologické změny v neuronech se obvykle vyskytují během 20–30 minut po ischemii (Ordy et al., 1993).

Reperfuzní léčba, která je zaměřena na obnovení průtoku krve a kyslíku v ischemické oblasti před poškozením neuronů, je primární léčbou pacientů s ischemickou mrtvicí na klinice. Intravenózní tkáňový aktivátor plasminogenu (IV tPA) je jediným trombolytickým činidlem schváleným FDA pro léčbu akutní mrtvice. Předchozí důkazy naznačují, že vykazuje významné klinické zlepšení pouze při podání do 3 hodin po ischemii (Kwiatkowski et al., 1999). Další randomizovaná studie provedená v roce 2017 ukázala, že intravenózní terapie do 6 hodin stále prospívá nad bezpečnostními obavami (Berkhemer et al., 2014). Mechanická trombektomie, chirurgický zákrok k odstranění trombózy z tepen, je další běžně používanou reperfuzní terapií. Trombektomie je účinná při snižování invalidity po cévní mozkové příhodě, i když její účinnost a bezpečnost lze zajistit pouze do 8 hodin po nástupu cévní mozkové příhody (Jovin et al., 2015). V posledních letech dvě vysoce kvalitní klinické studie zaměřené na opožděnou rekanalizaci naznačují, že reperfuzní léčba podaná za 24 hodin nebo dokonce později po propuknutí cévní mozkové příhody stále vykazuje u vybraných pacientů lepší prognózu, čímž se terapeutické okno rozšiřuje na 24 hodin u specifických populací pacientů. (Ragoschke-Schumm a Walter, 2018).

Všechny současné způsoby léčby však mají hlavní omezení spočívající ve zvýšení rizika intrakraniálního krvácení (ICH) při podávání mimo terapeutické okno, které může dále poškodit mozkovou tkáň. Toto následné poškození po reperfuzní terapii se nazývá ischemicko/reperfuzní (I/R) poškození, proces, který zahrnuje reoxygenací indukovanou produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), přetížení vápníkem a poškození tkáně. Prodloužení reperfuzního časového okna po ischemické cévní mozkové příhodě při současném zajištění neuroprotekce je proto extrémně důležité pro léčbu onemocnění. Autofagie je přirozený proces, který degraduje nepotřebné nebo poškozené organely a proteiny k udržení buněčné homeostázy. Autofagie může být aktivována po ischemické mrtvici, kdy jsou mozkové buňky vystaveny riziku nedostatku kyslíku a živin. Přesněji řečeno, nedostatek kyslíku a glukózy stimuluje zvýšení poměru AMP/ATP, což je aktivátor pro dráhu AMPK (Oakhill et al., 2011; Jiang et al., 2018). Upregulace dráhy AMPK tak může iniciovat autofagii prostřednictvím přímé aktivace komplexu ULK prostřednictvím fosforylace Ser 317 a Ser 777 nebo nepřímé aktivace ULK prostřednictvím inhibice aktivity mTOR, protože mTOR potlačuje aktivaci Ulk1 fosforylací Ulk1 Ser 757 a narušením interakce mezi Ulk1 a AMPK (Egan et al., 2011; Kim J. et al., 2011).

Předchozí výzkumy ukazují kontroverzní výsledky týkající se role autofagie po ischemické cévní mozkové příhodě. Některé studie ukazují, že autofagie poskytuje neuroprotekci a zlepšuje klinické výsledky tím, že významně snižuje ischemické poškození neuronů, glií a endoteliálních buněk (Papadakis et al., 2013; Jiang et al., 2015; Dai et al., 2017). Mezitím další zjištění naznačují, že nadměrná autofagie může být škodlivá pro mozkové buňky (Li et al., 2017; Mo et al., 2020). Abychom to shrnuli, navzdory kontroverzním důkazům se obecně souhlasí, že mírná autofagie je ochranná, zatímco nadměrná autofagie může přispívat k buněčné smrti během ischemie (Mo et al., 2020).

Ischemická preconditioning (IPC), strategie, která využívá krátká období vaskulární okluze a reperfuze k prevenci fetálních ischemických příhod a rekanalizaci, může aktivovat neuroprotektivní program v mozku spuštěním adaptivní autofagie zaměřené na poškozené organely a zmírněním oxidačního stresu při akutní ischemické mrtvici ( Yang a kol., 2020; Ajoolabady a kol., 2021). Navíc postkondicionování mozkové ischemie, které snižuje maladaptivní autofagii aplikací krátkých období reperfuze přerušené ischemií na začátku rekanalizace, bylo indukováno k potlačení reperfuzního poškození, což naznačuje jeho ochrannou roli při léčbě ischemické cévní mozkové příhody (VintenJohansen, 2017; Ajoolabady et al. ., 2021). Mitofágie, typ selektivní autofagie, může odstranit dysfunkční mitochondrie. Mitochondrie hrají ústřední roli v produkci buněčné energie, udržování homeostázy vápníku a regulaci ROS. Mitochondriální dysfunkce může zvýšit oxidační stres a poškození buněk (Liu, 1999; Indo et al., 2007).

Mitofágie funguje hlavně jako kontrola mitochondriální kvality prostřednictvím odstraňování poškozených mitochondrií. U savců mohou být dysfunkční mitochondrie vyčištěny buď prostřednictvím PINK1- Parkin-dependentní ubikvitinační dráhy, nebo prostřednictvím aktivace mitofágových receptorů, čímž se sníží tvorba ROS z mitochondrií (Lemasters, 2005) a buňky se ochrání před nepříznivými niky (Huang et al. ., 2011).

Za stavu ischemické cévní mozkové příhody, nesprávně fungující mitochondrie zvyšují uvolňování proapoptotických faktorů včetně cytochromu c, aby indukovaly buněčnou smrt v postižené oblasti (Jürgensmeier et al., 1998; Lemasters, 2005). Stojí za zmínku, že mitofagie může mít různé účinky během první ischemické fáze a později reperfuzní fáze. Studie ukázaly, že mitofagie uplatňuje svou ochrannou roli hlavně během reperfuzní fáze (Kumar et al., 2016).

V posledních letech byla rozsáhle studována role mitofágie u akutní cévní mozkové příhody. Většina studií ukazuje na neuroprotektivní roli mitofágie při zmírňování reperfuzního poškození prostřednictvím mnoha mechanismů. Tento přehled shrnuje roli mitofagie u ischemické cévní mozkové příhody a I/R poranění a navrhuje intervence související s mitofagií jako doplňkový přístup k léčbě ischemické cévní mozkové příhody. Diskutovány byly také aktualizace týkající se opožděné rekanalizace a potenciálního zapojení mitofágie do ní.

MITOCHONDRIA A MITOFAGIE

Mitochondrie jsou důležité organely, které jsou zodpovědné hlavně za produkci energie. Poškozené mitochondrie však uvolňují škodlivé ROS a další oxidanty, jako je H2O2 a peroxynitrit, do cytoplazmy a způsobují poškození proteinů, jaderné kyseliny a membrán (Zhou et al., 2011). A co je horší, cytochrom c, mitochondriální intermembránový prostorový protein, se uvolní při vážném poškození mitochondrií, což spustí kaskádu kaspáz a nakonec apoptózu (Ott et al., 2002).

Proto je pro přežití buněk nezbytná rychlá degradace poškozených mitochondrií. Mitofagie je proces, během kterého jsou poškozené nebo stárnoucí mitochondrie selektivně obaleny fagofory a podléhají lysozomální degradaci, aby se udržela buněčná homeostáza a zabránilo se buněčné apoptóze. Mitofágie začíná tvorbou fagoforu, membránové struktury izolované z endoplazmatického retikula. Fagofor pak rozpozná poškozené mitochondrie prostřednictvím LC3 adaptérů nebo LC3 receptorů a pohltí poškozené mitochondrie pro autozomální degradaci. V současné době se mitofágové dráhy skládají ze dvou hlavních typů: dráha zprostředkovaná ubikvitinem a dráha zprostředkovaná receptorem (obrázek 1).

Ubiquitinem zprostředkovaná cesta

PTEN-indukovaný putativní kinázový protein 1 (PINK1) a Parkinem zprostředkovaná ubikvitinační dráha jsou některé z nejlépe charakterizovaných mitofagických mechanismů. Ve zdravých mitochondriích je PINK1, serin/threonin kináza, importována z cytoplazmy kontinuálně a podléhá štěpení mitochondriálními proteázami mitochondriálně zpracovávající peptidázou (MPP) a kosočtvercovým typem asociovaným s presenilinem (PARL) (Greene et al., 2012). Při ischemické cévní mozkové příhodě dochází k depolarizaci membrány mitochondrií, což zabraňuje importu PINK1 a vede k akumulaci PINK1 na mitochondriální membráně. V důsledku toho kinázová aktivita PINK1 plné délky indukuje fosforylaci E3 ligázy Parkin, která aktivuje enzymatickou funkci Parkinu a vede k ubikvitinaci několika mitochondriálních proteinů (Kazlauskaite et al., 2015). Mezitím PINK1 fosforyluje ubikvitin a vede k vazbě fosforylovaného ubikvitinu a Parkinu, kde se aktivita ligázy dále zlepšuje (Koyano et al., 2014; Kazlauskaite et al., 2015).

Jakmile je Parkin aktivován, konjuguje ubikvitinové skupiny na proteiny OMM, a tím je indukována mitofágie. Některé ubikvitinované mitochondriální proteiny, jako je MFN1, jsou degradovány, což je nezbytné pro mitochondriální štěpení a mitofágii (Tanaka et al., 2010). Jiné ubikvitinované proteiny rekrutují autofagické adaptorové proteiny, jako je optineurin (OPTN) a nukleární dot protein 52 (NDP52), který ukotvuje označené mitochondrie k autofagozomu svými motivy LC3- interagující oblasti (LIR), čímž je iniciována mitofágie (Lazarou a kol., 2015). PINK1 navíc může získávat OPTN a NDP52 nezávisle na parkinu, což následně rekrutuje několik faktorů iniciace autofagie, jako je unc{8}}jako autofagie aktivující kinázu 1 (ULK1), pro zprostředkování syntézy a prodlužování fagoforů (Wong a Holzbaur, 2014; Lazarou a kol., 2015). Bylo také objeveno několik dalších E3 ligáz, které iniciují mitofágii. Některé mechanismy souvisejí s mitofágií zprostředkovanou PINK1/Parkinem a některé jsou nezávislé na Parkinovi. Například nadměrná exprese mitochondriální ubikvitin ligázy 1 (MUL1) zprostředkovává degradaci mitofusinu ubikvitinací, která zachraňuje mutantní fenotyp PINK1/parkin (Yun et al., 2014).

Ve zralých neuronech je MUL1 také důležitý pro kontakt ER a mitochondrií a jeho absence narušuje homeostázu Ca2 plus v mitochondriích a snižuje příjem Ca2 plus z ER. To vede k aktivaci kalcineurinu, který aktivuje Drp1 a tím indukuje štěpení mitochondrií. Fragmentované mitochondrie ztrácejí svůj membránový potenciál a je indukována mitofágie zprostředkovaná PINK1/Parkinem (Puri et al., 2019). Další E3 ligáza, sedm homologů v nepřítomnosti (SIAH)-1, je rekrutována synfilinem-1, když je přítomen PINK1 plné délky. SIAH-1 podporuje mitofágii prostřednictvím ubikvitinace mitochondriálních proteinů nezávisle na Parkinovi (Szargel et al., 2016). Kromě výhod PINK1-ubikvitinace zprostředkované Parkinem jsou deubikvitinázy nezbytné pro správnou mitofágii. Deubikvitinace Parkinu se provádí přímo ubikvitinově specifickou peptidázou 8 (USP8) (Durcan et al., 2014), zatímco USP15 deubikvitinuje substráty Parkinu za účelem inhibice mitofágie (Cornelissen et al., 2014). Několik dalších deubikvitináz, jako je USP30, USP35 a USP33 (Bingol a kol., 2014; Wang Y. a kol., 2015; Niu a kol., 2020), působí proti mitofágii zprostředkované ubikvitinem odstraněním ubikvitinových řetězců z mitochondriální membrány. . Proto je pro regulaci mitofágie vytvořena vyladěná rovnováha mezi ubikvitinací a deubikvitinací.

Cesta zprostředkovaná receptory

Alternativní cestou mitofágie je signalizace mitofágových receptorů. V savčích buňkách je v současné době identifikováno více mitofágových receptorů (Ren et al., 2018), které obsahují alespoň jeden LIR pro přímou vazbu autofagického mediátoru LC3 a následné pohlcení fagozomů. Kritickým receptorem při přeměně mitochondrií v erytrocytech je OMM protein nazvaný BCL2 interagující protein 3-like (BINP3-L, také známý jako NIX) (Sandoval et al., 2008). Je transkripčně upregulován během zrání erytrocytů k vyčištění mitochondrií. V podmínkách hypoxie je BINP3-L indukován spolu s jeho homologem, BNIP3, což podporuje mitofágii prostřednictvím rozkladu OPA1 a náboru DRP1, který je transkripčně regulován forkhead boxem O3 (FOXO3) a hypoxií indukovatelným faktorem (HIF) , čímž indukuje mitochondriální štěpení a inhibuje mitochondriální fúzi (Sowter et al., 2001; Mammucari et al., 2007).

Navíc je jeho vazebná afinita k LC3 dále zlepšena fosforylací LIR za stresových podmínek (Rogov et al., 2017). Dalším nezbytným mitofagickým receptorem je doména FUN14 obsahující 1 (FUNDC1), která zprostředkovává mitofágii za hypoxických podmínek (Liu et al., 2012). Aktivita FUNDC1 je regulována stavem fosforylace. V nestresových podmínkách je potlačován fosforylací Src na Tyr18 a kaseinkinázy II (CK2) na Ser13 (Chen et al., 2014). Při hypoxii PGAM5 fosfatáza defosforyluje FUNDC1, což aktivuje motiv LIR na FUNDC1 a indukuje mitofágii. Navíc FUNDC1 rekrutuje Drp1 a narušuje jeho fyzickou asociaci s OPA1 ve stresu (důležité pro dynamiku mitochondrií), čímž indukuje mitochondriální štěpení a inhibuje mitochondriální fúzi (Chen et al., 2016).

Kromě toho existuje mnoho dalších mitofágových receptorů. Na vnější mitochondriální membráně se ukázalo, že BCL 2 Like 13 (BCL2L13) a FKBP prolylisomeráza 8 (FKBP8) zprostředkovávají mitofágii vazbou LC3 prostřednictvím motivu LIR nezávisle na Parkinovi (Murakawa et al., 2015; Bhujabal et al., 2017). Některé receptory se také nacházejí v IMM, jako například prohibitin 2 (PHB2) a kardiolipin. Jakmile je OMM depolarizována nebo poškozena, PHB2 bude interagovat s LC3 a přímo podporovat mitofágii (Wei et al., 2017). Deplece PHB2 po prasknutí OMM však destabilizuje PINK1 prostřednictvím aktivace PARL, a proto vede ke štěpení PGAM5 plné délky (Yan et al., 2020). Tím se ruší stabilizace PINK1 související s PGAM{19}, a tím inhibuje PINK1/Parkindependentní mitofágie. Nedávno byl také identifikován kardiolipin, fosfolipid, jako mitofágový receptor, jehož primární syntéza probíhá v IMM. Při ruptuře OMM se kardiolipin uvolní do OMM a interaguje s LC3, čímž spustí signální kaskádu, která vede k pohlcení mitochondrií (Chu et al., 2013).

Dynamika mitochondrií a její vztah k mitofágii

Aby se mitochondrie přizpůsobily vnějšímu prostředí, spojí vnitřní a vnější membránu nebo podstoupí štěpení a rozdělí se na několik mitochondrií. Tyto dva základní procesy v dynamice mitochondrií se nazývají fúze a štěpení. Při konfrontaci s buněčným stresem je podporována fúze, aby se zajistila produkce energie opravou částečně poškozených mitochondrií (Youle a van der Bliek, 2012). Na druhou stranu je štěpení pro mitofágii nezbytné, protože umožňuje oddělení depolarizovaných mitochondrií, což umožňuje zachování "zdravá část" v mitochondriích a snížení zbytečných ztrát během mitofágie. V závislosti na kvalitě mitochondrií bude aktivována buď fúze nebo štěpení spolu s inhibicí té druhé (Twig et al., 2008).

V savčích buňkách MFN1, MFN2 a OPA1, což jsou GTPázy, zprostředkovávají fúzi mitochondrií (Wu et al., 2019). Tyto proteiny jsou často post-transkripčně modifikovány pro kontrolu jejich účinnosti. V případě MFN1 jej může extracelulárně regulovaná kináza (ERK) fosforylovat na Thr562 k potlačení fúze. MFN1 může být také ubikvitinován do 5. března pro degradaci (Park et al., 2014). Mitogenem aktivovaná proteinkináza 8 (MAPK8, také známá jako JNK) fosforyluje MFN2 na Ser27 pod stresem pro následnou ubikvitinaci E3 ligázami Parkin (Gegg et al., 2010), HUWE1 (Leboucher et al., 2012) a mitochondriální ubikvitin ligázou s membránou asociovaný RING-CH (5. BŘEZEN) (Sugiura et al., 2013). MFN1 a MFN2 mohou být deubikvitinovány pomocí USP30, kde jejich inhibice povede k nedegradativní ubikvitinaci MFN1/2 (Yue et al., 2014).

U OPA1 je regulován změnami v proteázové aktivitě YME1L a OMA1, která reaguje na intramitochondriální signály (Griparic et al., 2007; Head et al., 2009). Mitochondriální štěpení je regulováno hlavně cytosolovým proteinem, DRP1, jehož nábor je zprostředkován mitochondriálními štěpnými faktory, jako je MFF. DRP1 může být fosforylován proteinkinázou A na Ser637 a Ser656, která inhibuje jeho aktivitu. Defosforylace DRP1 je zprostředkována kalcineurinem kalcineurinem kalciové proteinové fosfatázy nebo proteinovou fosfatázou 2A (PP2A) pro zvýšenou fragmentaci při stresu (Chang a Blackstone, 2007; Cribbs a Strack, 2007).

Navíc energeticky snímající adenosinmonofosfát (AMP)-aktivovaná proteinkináza (AMPK) fosforyluje MFF při energetickém stresu, který rekrutuje Drp1 a urychluje mitochondriální štěpení (Toyama et al., 2016). Mitofagie je úzce propojena s mitochondriální dynamikou, protože bylo zjištěno, že více mitofágových proteinů podporuje štěpení a usnadňuje mitofágii. Fosforylovaný Parkin může například ubikvitinovat MFN1 a MFN2 pro degradaci, což snižuje mitochondriální fúzi a zvyšuje fragmentaci, což vede k iniciaci mitofágie (Tanaka et al., 2010). Během mitofagie je MFN2 také fosforylován PINK1, aby získal Parkina pro další mitofágii (Chen a Dorn, 2013).

Neuroprotektivní účinek Cistanche

Cistanche je rostlinný extrakt známý pro své neuroprotektivní vlastnosti a předpokládá se, že jeho mechanismus účinku zahrnuje antioxidační, protizánětlivé a antiapoptotické účinky. Existuje několik relevantních testů a případů aplikace souvisejících s neuroprotektivními účinky Cistanche, které zahrnují:

1. Studie in vitro: Studie in vitro ukázaly, že extrakt z Cistanche chrání neurony před poškozením vyvolaným stresem tím, že snižuje oxidační stres a zánět.

2. Studie na zvířatech: Studie na zvířatech prokázaly, že Cistanche může chránit před poškozením neuronů způsobeným cerebrální ischemií, traumatickým poraněním mozku a expozicí neurotoxinům.

3. Studie na lidech: Existují omezené klinické důkazy o neuroprotektivních účincích Cistanche u lidí, ale některé studie naznačují, že může zlepšit kognitivní funkce a snížit pokles paměti související s věkem.

Luoan Shen1†, Qinyi Gan1†, Youcheng Yang1, Cesar Reis2, Zheng Zhang1, Shanshan Xu3, Tongyu Zhang4 * a Chengmei Sun1,3 *

1 Zhejiang University-University of Edinburgh Institute, School of Medicine, Zhejiang University, Haining, Čína,

2 VA Loma Linda Healthcare System, Loma Linda University, Loma Linda, CA, Spojené státy americké,

3 Institut pro pokročilé studium, Univerzita Shenzhen, Shenzhen, Čína, 4 Neurochirurgické oddělení, nemocnice Xuanwu, Capital Medical University, Peking, Čína