Mitochondriální proteiny odhalují mechanismus, kterým fyzické cvičení zlepšuje paměť, učení a motorickou aktivitu u potkaního modelu hypoxické ischemické encefalopatie, část 3

4. Materiály a metody

4.1. Zvířata a experimentální skupiny

Pro tuto studii bylo použito 36 krys Sprague-Dawley. Zvířata byla chována při 22 ± 1 °C s cykly světlo/tma 12 hodin a měla volný přístup k potravě a vodě. Experimentální postupy byly prováděny se souhlasem Etického institucionálního výboru pro péči o zvířata a výzkum univerzity Zhengzhou.

Temný cyklus označuje období, kdy lidé v noci spí, a úzce souvisí s pamětí. Pro většinu lidí dobrý spánek zlepšuje fyzické zdraví a mozkové funkce. Spánek přitom souvisí i s procesem paměti v mozku.

Když spíme, naše těla vstoupí do různých fází spánku, včetně spánku s rychlým pohybem očí (REM) a spánku bez rychlého pohybu očí (NREM). Tyto fáze hrají důležitou roli při regulaci integrace informací mozku a konsolidaci paměti.

Většina lidí pociťuje pozitivní účinky spánku na koncentraci a paměť. Výzkumy ukazují, že spánek nám může pomoci upevnit a posílit naše vzpomínky a dokonce zlepšit naši schopnost učit se. Během spánku mozek integruje nové informace se stávajícími znalostmi, čímž zvyšuje schopnost ukládat a používat paměť.

Naopak nedostatek dostatečného spánku může vést ke ztrátě paměti a problémům s učením. Dlouhodobá nespavost může způsobit různé problémy v těle a mozku, které ovlivňují každodenní život a funkčnost. Správná spánková strategie a rozumný životní styl jsou proto klíčové pro udržení dobré paměti.

Celkově existuje souvislost mezi temnými cykly a pamětí. Adekvátní spánek může podporovat integraci mozkových informací a konsolidaci paměti, zatímco dlouhodobé poruchy spánku mohou ovlivnit mozkové funkce a paměť. Proto bychom měli věnovat pozornost kvalitě spánku v našem každodenním životě a udržovat zdravý životní styl, abychom účinně podporovali a zlepšovali naši paměť a schopnosti učení. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola dokáže výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola dokáže regulovat i rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche deserticola také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostává dostatek živin a energie, a tím zlepšuje mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Bylo vynaloženo veškeré úsilí ke snížení počtu zvířat a minimalizaci utrpení zvířat během experimentů. Zvířata byla náhodně rozdělena do čtyř skupin (obrázek 8). (1) HIE, NT (skupina hypoxia-ischemiaencefalopatie bez tréninku na cvičení) sestávala ze zvířat, která byla modelována pro hypoxicko-ischemickou encefalopatii 7. den po narození anestetizací mláďat isofluranem (5% indukce, 1,5% udržování).

Levá společná krční tepna byla poté trvale podvázána a mláďata byla umístěna na teplé zotavovací lehátko na 30 minut, než byla přenesena do hypoxické komory s kontinuálním průtokem hypoxické směsi plynu 92 % N2 a 8 % O2 po dobu 90 minut a poté se vrátili do klecí až do 10. týdne, aniž by je podrobili plaveckému cvičení. (2) HIE, T (skupina s hypoxicko-ischemickou encefalopatií s cvičebním tréninkem) se skládala ze zvířat, která byla modelována pro hypoxicko-ischemickou encefalopatii jako v (1) a vrátila se do klecí až do 6. týdne života a poté byla vystavena 90 min. plavání denně po dobu pěti dnů s 2 dny odpočinku týdně po dobu 4 týdnů, (3) SHAM, NT (kontrolní skupina) zahrnovala zvířata, která nebyla podrobena žádné léčbě, ale žila normální život v klecích od 1. do 10. cvičební trénink a (4) SHAM, T sestával ze zvířat, která nebyla podrobena žádné léčbě, ale žila normálním životem v klecích od postnatálního dne1 až do 6 týdnů, poté byla vystavena plaveckému cvičení po dobu 4 týdnů.

Mozky zvířat z různých skupin byly poté odebrány a připraveny pro western blotting (hipokampus a mozková kůra) a imunofluorescenci (motorická kůra).

4.2. Paradigma cvičení

Zvířata byla chována s potravou a vodou ad libitum a udržována v 12-cyklu světlo/tma. Byli rozděleni do dvou skupin: zvířata se sedavým zaměstnáním (HIE, NT a SHAM, NT) a zvířata cvičící (HIE, T a SHAM, T). Cvičící zvířata byla po 6. týdnu po porodu po dobu 4 týdnů vystavena plaveckému cvičení; byli vystaveni plaveckému cvičení po dobu 5 dnů v týdnu s 2 dny odpočinku. Každé plavání trvalo 90 minut. Bazén byl naplněn do hloubky 50 cm, aby se zvířata nedotýkala dna nádrže.

Zvířata byla ponechána volně plavat, bez jakékoli další zátěže, a byla během plavání jemně stimulována. Potkani byli po cvičení pečlivě vysušeni a vráceni do klecí.

4.3. Vertica! Test pólového motoru

Zvířata v každé skupině byla jedno po druhém umístěna lícem nahoru na tyč potaženou látkou (průměr 3.0 cm a délka 150 cm), která byla držena ve vodorovné poloze, poté byla postupně zvednuta do vertikální poloze a doba, po kterou krysa zůstala na tyči, byla zaznamenávána maximálně 2 minuty (120 s). V tomto testu zvíře s deficitem motorické koordinace a rovnováhy spadne z tyče.

4.4. Morrisův test vodního bludiště (MWM)

Potkani (ve věku 10 týdnů) byli podrobeni MWM po 4 týdnech cvičebního protokolu (SHAM, 'T a HlE, T). Všechna data vodního bludiště byla zaznamenána pomocí video sledovacího systému Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Čína). MWM bylo použito tak, jak je popsáno v 132]. Stručně řečeno, krysy používaly vizuální podněty umístěné na okraji bazénu, aby dosáhly skryté plošiny a unikli z vody. Učení bylo hodnoceno během 7 dnů. Před hodnocením učení byly krysy zavedeny do bazénu, který obsahoval čistou vodu a viditelnou plošinu. Během výcviku byla krysám poskytnuta zkušební plavecká cvičení, aby se s tímto úkolem seznámila.

Během fáze učení byly krysy potřeny černým barvivem pro snadné sledování videa a platforma byla ponořena. Každá krysa byla podrobena čtyřem pokusům z různých výchozích bodů (kvadrantů). Latence neboli doba potřebná k dosažení platformy byla denně zaznamenávána systémem Panlab SMART Video Tracking System. Poslední den experimentu byla plošina odstraněna a každá krysa byla znovu zavedena do vody, kolikrát zvířata překročila místo skryté plošiny v kvadrantu, který dříve obsahoval plošinu (cílový kvadrant).

4.5. Western blotting

Šest krys bylo náhodně vybráno z každé skupiny pro experiment na úrovni proteinu. Proteiny byly extrahovány z hippocampu a kortexu a homogenizovány v RIPA činidle (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) a rozděleny na cytoplazmatické a jaderné proteiny. Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí testu bicinchoninicacid (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) a celkem 20 g proteinu bylo separováno elektroforézou na univerzálních SDS-PAGE gelech (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Čína.

Proteiny byly poté přeneseny na polyvinylidenfluoridové membrány (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA). Membrány byly blokovány po dobu 2 hodin 5% hovězím sérovým albuminem (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Peking, Čína) při pokojové teplotě a inkubované s následujícími primárními protilátkami od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): AIF (D39D2, 1:1000), Cytochrom C (136F3, 1:1000), štěpená kaspáza{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) a OPA1 (D7C1A,1:1000).

GAPDH od Servicebio, Wuhan, Čína (GB11002, 1:2000) a H3 od Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) při 4 ◦C přes noc a následně sekundární protilátka SA konjugovaná s HRP00001-2 od Proteintect (1:5000) inkubace po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Proteinové pásy byly vizualizovány pomocí vylepšené chemiluminiscenční soupravy #KF005 od Affinity Biosciences a zobrazeny systémem Bio-Image Analysis System (Zhengzhou University, Zhengzhou, Čína). Poměry intenzit proteinových pásů k GAPDH (cytoplazmatické proteiny) a H3 (jaderné proteiny) jako interní reference byly stanoveny pomocí ImageJ.

4.6. Imunofluorescence

{{0}}}µm koronální řezy mozkové tkáně byly získány pomocí mrazícího mikrotomu (Leica, Německo) pro imunofluorescenci. Sklíčka byla blokována po dobu 2 hodin PBS s 10% fetálním bovinním sérem, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Peking, Čína) a 0,3% Triton ×-100,Amresco 0694, Biosharp, Estonsko při pokojové teplotě a poté inkubované s primárními protilátkami od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): anti-AIF, D39D2 (ředění 1:400), anti-cytochrom C, 136F3 (ředění 1:200), anti-štěpená kaspáza-3 Asp175 (ředění 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (ředění 1:200) a anti-OPA1, D7C1A (ředění 1:400) přes noc při 4 °C.

Poté byla sklíčka 3x promyta, vždy 10 minut v PBS, a poté inkubována se sekundárními protilátkami (ab150077 od Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě ve tmě. DAPI,#C0065 od Solarbio Life Sciences, Peking, Čína (1:100 PBS) bylo přidáno na 5 minut a slito, promyto v PBS po dobu 3x po dobu 5 minut, vysušeno, bylo přidáno činidlo proti zhášení (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), sklo sklíčka byla fixována na sklíčka a vzorky byly skladovány při -20 ◦C po dobu 2 hodin a odebrány pro mikroskopické zobrazení. Snímky tkáně byly zachyceny pomocí konfokálního fluorescenčního mikroskopu (Ni-U942877, Nikon, Tokio, Japonsko) a snímky představující proteiny v motorickém kortexu byly poté kvantifikovány pomocí FIJI-ImageJ, jak je popsáno v [33].

4.7. Statistická analýza

Pro všechny analýzy byl použit GraphPad Prism verze 8.0.0 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). K měření statistické významnosti byla použita jednocestná ANOVA následovaná Dunnettovými post hoc testy. Výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SEM a p < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

5. Závěry

Tato studie ukazuje, že plavecké cvičení zlepšilo motorickou aktivitu, paměť a učení spojené s HIE potlačením mitochondriální apoptózy prostřednictvím signálních drah Cyto.C/štěpená kaspáza-3 a AIF. Navíc bylo prokázáno, že intervence při plavání stabilizuje mitochondriální kristy a membránový potenciál, jak je znázorněno reverzí Smac/Diablo a OPA1 u potkanů ​​s HIE. Výsledkem je, že se jedná o atraktivní a životaschopný základ pro další výzkum k dešifrování více molekulárních drah, které by mohly být manipulovány tak, aby účinně zvládaly HIE a výsledné deficity. Zatímco tato studie úspěšně prokázala roli cvičení při zvrácení strukturálních a funkčních deficitů v mitochondriích způsobených HIE nevyčerpal všechny možné metody pro stanovení, jak jsou mitochondriální kristy stabilizovány; to je zásadní pro budoucí výzkum na toto téma.

Autorské příspěvky: Konceptualizace, FG, FP, YW a CC; zpracování dat, FG, FP, YW, HL a JF; formální analýza, FG, HL a CC; získávání finančních prostředků, CC; vyšetřování, FG, FP, YW, HL a JF; metodologie, FG, FP, YW a CC; administrace projektu, FG, YW a CC; zdroje, CC; software, FG, FP, JF a CC; dohled, CC; validace, FG, FP, YW, HL a CC; vizualizace, FG, FP, YW, HL a JF; psaní – originální návrh, FG a YW; psaní – recenze a úpravy FG a HL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování: Tato studie je podporována projektem vědeckého a technologického výzkumu odboru vědy a technologie provincie Henan (č. grantu 212102310217) a grantem z fondů Čínské národní nadace pro přírodní vědy (grant č. 81401015).

Prohlášení Institutional Review Board: Studie byla provedena v souladu s pokyny Výboru pro péči o výzkumná zvířata Univerzity Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Nelze použít.

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Brain-imunitní interakce u perinatálního hypoxicko-ischemického poškození mozku. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hypoxicko-ischemická encefalopatie: Přehled pro lékaře. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Černý, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al. Globální, regionální a národní příčiny dětské úmrtnosti v roce 2008: Systematická analýza. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakologické neuroprotektivní strategie u novorozeneckého poranění mozku. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Role faktoru indukujícího apoptózu v perinatálním hypoxicko-ischemickém poškození mozku. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Cvičení na běžeckém pásu a cvičení na kole zlepšují motorické funkce potlačením apoptotické smrti neuronových buněk u potkanů ​​se zánětem mozku. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Vodní cvičení pro děti s dětskou mozkovou obrnou. Dev. Med. Dítě. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG laktát a BDNF: Klíčové mediátory cvičením indukované neuroplasticity?J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cvičení Cotman, CW působí proti klesající funkci hipokampu při stárnutí a Alzheimerově chorobě. Neurobiol.Dis. 2013; v tisku. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. Blokáda BDNF receptoru brání prospěšným účinkům cvičení na potkaním modelu Parkinsonovy choroby. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com