MiR-199-3p zlepšuje regeneraci svalů a zmírňuje stárnoucí svaly a svalovou dystrofii
Sep 22, 2022
Další informace vám poskytne oscar.xiao@wecistanche.com
Experimenty s parabiózou naznačují, že v krvi cirkulují molekulární faktory související s omlazením a stárnutím. Zde ukazujeme, že miR-199-3p, který cirkuluje v krvi jako bezbuněčná miRNA, je v krvi starých myší výrazně nižší než u mladých myší; a miR{2}}p má schopnost k posílení myogenní diferenciace a regenerace svalů. Podávání miR-199 napodobenin, které dodávají miR-199-3p, starým myším vedlo k hypertrofii svalových vláken a opožděné ztrátě svalové síly. Systémové podávání miR-199 napodobenin mdx myším, dobře známého zvířecího modelu Duchennovy svalové dystrofie (DMD), výrazně zlepšilo svalovou sílu myší. Celkově vzato, bezbuněčný miR-199-3p v krvi může mít účinek proti stárnutí, jako je ahypertrofický účinek na stárnoucí svalová vlákna, a mohl by mít potenciál jako nové RNA terapeutikum pro DMD a také nemoci související s věkem. Zjištění nám poskytují nový pohled na miRNA cirkulující v krvi jako molekuly související s věkem.
Životní funkce, jako je svalová síla, činnost nervové soustavy, dýchací funkce, obrana proti infekci a odolnost proti nemocem, se stárnutím klesají. Nemoci a dysfunkce spojené s takovým funkčním poklesem narůstají a stávají se hlavními problémy ve stárnoucích společnostech. Se stárnutím dochází v těle k různým změnám, jako jsou metabolické změny a změny genové regulace-3; a studium takových změn může pomoci porozumět stárnutí a poskytnout strategie pro řešení problémů, kterým stárnoucí společnosti čelí. Biomolekuly (včetně genů) související se stárnutím byly identifikovány a mohou být užitečné při výzkumu stárnutí; např. exprese -galaktosidázy a plolnk4a souvisí s buněčným stárnutím4-6 a myší model postrádající gen klotho je znám jako model stárnutí s řadou fenotypů, které se podobají lidskému předčasnému stárnutí.
Parabióza je spojení mezi dvěma jedinci, kteří sdílejí společný cévní systém, a může být vytvořena experimentálně chirurgickým zákrokem8. Experimenty s parabiózou, při kterých byli mladí a staří hlodavci spojeni, aby sdíleli společný cévní systém, ukázaly, že proces stárnutí u mladých zvířat se urychlil, zatímco stará zvířata byla omlazena9-12. Zjištění silně naznačují, že určité faktory související s omlazením a stárnutím jsou přítomny a cirkulují s krví v cévním systému; tyto cirkulační faktory však nejsou dosud plně pochopeny13.
Cistanche může proti stárnutí
MikroRNA (miRNA) jsou 21-23-nukleotidové malé nekódující RNA, které jsou zpracovávány z delších transkriptů (primárních miRNA) trávením, s mikroprocesorovým komplexem v jádře a Dicerem v cytoplazmě a začleněny do RNA-indukovaný silencing complex (RISC)14,15.MiRNA v RISC funguje jako mediátor při umlčování genů, kde je inhibována translace messengerových RNA (mRNA), které mají částečnou komplementaritu k miRNA, nebo jsou mRNA nesoucí téměř komplementární sekvence k miRNA digestedl4,15.Cistanche Extract Anti RadiationMiRNA tedy hrají důležitou roli v genové regulaci prostřednictvím potlačení jejich cílové genové exprese. U zvířat a rostlin byly nalezeny tisíce miRNA genů [viz databáze microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Byl zkoumán profil exprese miRNA a byla zjištěna exprese miRNA specifická pro tkáňovou a vývojovou fázi a exprese miRNA související s onemocněním6-21. Genová regulace zahrnující miRNA úzce souvisí s různými životními funkcemi a životními jevy, včetně nemocí14,16,21-24
MiRNA jsou přítomny vně i uvnitř buněk25. Například miRNA jsou přítomny v krvi jako bezbuněčné nukleotidy a cirkulují v cévním systému2627. Takové bezbuněčné miRNA (cf-miRNA) jsou inkorporovány do malých vezikul nazývaných extracelulární vezikuly nebo asociované s proteiny, čímž získávají ochranu před extracelulárními nukleázami25,28. Přítomnost některých cf-miRNA může být významná; například byly zjištěny významné asociace mezi cf-miRNA a určitými nemocemi26,27,29-31. Cf-miRNA mohou odrážet změny ve fyzickém stavu; takové miRNA tedy mohou být potenciálními biomarkery pro monitorování systémů udržování života, stejně jako nemocí.
Tato studie byla provedena za účelem prozkoumání asociací mezi cf-miRNA a stárnutím a byly zkoumány cf-miRNA v krvi mladých a starých myší. Výsledky odhalily změny v cf-miRNA mezi krví mladých a starých myší. Mezi takovými miRNA byla miR-199-3p výrazně snížena ve staré krvi ve srovnání s mladou krví. Je zajímavé, že miR-19-3p má schopnost zlepšit svalovou diferenciaci a regeneraci a jeho podávání starým myším vedlo k expanzi svalových vláken. Když byl miR-199-3p zaveden do mdx myší, zvířecího modelu Duchennovy svalové dystrofie (DMD), svalová síla myší se výrazně zlepšila. Tato studie poskytuje nový pohled na cf-miRNA v krevním oběhu z hlediska stárnutí, latentní schopnosti a lékařských aplikací.
Výsledek
Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-měsíc staré) myši C57BL/6J pomocí DNA microarray k identifikaci rozdílů souvisejících s věkem. Profil cf-miRNA vykazoval výrazné rozdíly mezi mladými a starými myšmi, tj. byly detekovány cf-miRNA, které jsou zaměřeny na krev mladých a starých myší (tabulka 1). Z takových miRNA byly myogenní miRNA (např. miR-1 a miR-133)1833 přítomny ve skupině miRNA, která je hojná v mladé krvi; jinými slovy, myogenní miRNA byly výrazně méně ve staré krvi (tabulka 1).cistanche herbaRozdíl v miRNA mezi mladou a stárnoucí krví byl potvrzen kvantitativní reverzní transkripčně-polymerázovou řetězovou reakcí (qRT-PCR; obr. la) a dále reprodukován pomocí zdrojů RNA extrahovaných z malých váčků, tzv. exozomů, izolovaných z plazmy ( Doplňkový obr.1).
Experimenty s buněčnými kulturami na druhé straně odhalily, že sérum mladých myší mělo schopnost indukovat myogenní diferenciaci a tato schopnost byla silnější než u starých myší (obr. 1b). Byl zkoumán inzulinu podobný růstový faktor I (IGF-I), který je hlavním faktorem schopným indukovat myogenní diferenciaci v krvi34,35; nebyl však pozorován žádný významný rozdíl mezi krví mladé a staré krve (obr. lc). Na myogenní diferenciaci se tedy mohou podílet jiné faktory než IGF-I v mladé krvi.
miR-199-3p je schopen silně indukovat myogenní diferenciaci. Zkoumali jsme účinky miRNA hojných v mladé krvi na myogenní diferenciaci. Syntetická mimika miRNA byla zavedena do buněk C2C12, myší myoblastové buněčné linie, a byla zkoumána exprese myogenních diferenciačních markerů, genů myogeninu (Myog) a těžkého řetězce myosinu 1 (Myh1). Výsledky byly neočekávané a zaujaly nás: miR-199-3p, která byla předpovězena jako negativní miRNA kvůli malým informacím o myogenní diferenciaci, výrazně indukovala expresi Myog a Myh1 (obr. 2a, b). Kromě toho byla indukce miR-199-3p silnější než u konvenčních myogenních miRNA: exprese těžkého řetězce myosinu v přítomnosti miR-199-3p byla zvláště pozoruhodná (obr. 2b, c).
Abychom objasnili vztah mezi miR-199-3p a myogenní diferenciací, zkoumali jsme buněčnou a extracelulární (exosomální) miR-199-3p během myogenní diferenciace a také účinky inhibitorů miR{3}}p na diferenciaci. Exprese endogenního (celulárního) miR-199-3p byla upregulována po zahájení diferenciace. Exosomální miR-19-3p byl zvýšen jednou a poté snížen (doplňkový obrázek 2a). Léčba inhibitorem potlačila expresi myogenních diferenciačních markerů, Myog, Myh1 a kreatinkinázy (Ckm) (doplňkový obrázek 2b).cistanche růst penisuZjištění tedy naznačují, že miR-199-3p se účastní myogenní diferenciace.
Navrhování miR-199 napodobenin. Napodobili jsme miR-199 mimikry tak, aby tyto mimikry mohly účinně produkovat miR-199-3p jako funkční mediátor (vodicí vlákno) při umlčování genů. Navržená mimika miRNA byla podrobena screeningu a miR199#4 byla vybrána jako kompetentní miR-199 mimika (doplňkový obrázek 3). Následně byl miR199#4 použit v experimentech in vivo i in vitro.
Cílové geny miR-199-3p v myogenní diferenciaci. Abychom identifikovali cílové geny pro miR-199-3p pod myogenní diferenciací, hledali jsme kandidátní geny z databáze TargetScan a zaměřili jsme se na geny Lin28b a Suz12, z nichž oba jsou exprimovány v myoblastech C2C12. Lin28b a Suz12 mají putativní miR-199-3p vazebné sekvence ve své 3'nepřekládané oblasti (UTR; obr. 3a). Prokázali jsme, že domnělé sekvence jsou autentická vazebná místa pro miR-19-3p, pomocí luciferázových reportérových genů nesoucích vazebné sekvence a odpovídající nesprávně spárované sekvence (obr. 3a, b). Luciferázové geny nesoucí domnělé vazebné sekvence byly významně potlačeny miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) a pSuz12-(973)], zatímco nesprávně spárované sekvence, které mají mutace substituce bází v oblasti semene [pLin28b-(81)mut, zrušily jeho supresivní účinek [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut a Když byly mimikry miR-199 zavedeny do buněk C2Cl2, exprese Lin28b a Suz12 byla konzistentně suprimována (obr. 3c). Chcete-li posoudit, zda suprese Lin28b a/ nebo Suz12 přímo přispívá k myogenní diferenciaci, specifická inhibice Lin28b a Suz12 byla provedena umlčením genu, s použitím RNA interference (RNAi; Obr. 3d, e). Jak se očekávalo, exprese myo-genických diferenciačních markerů, jako jsou Ckm, Myh1 a Myog, byla upregulována při umlčování genů Lin28b a Suz12 (obr. 3f, g).
Protože Lin28b je protein vázající RNA zapojený do zpracování miRNAs3637, zkoumali jsme účinky miR-19 napodobenin prostřednictvím Lin28b na myogenní zpracování miRNA. Hladina miR-1, hlavní myogenní miRNA, byla zkoumána, protože zpracování jejího prekurzoru je regulováno Lin28b37. Zralá miR-1 byla významně zvýšena miR-199 mimikou (obr. 3h), což naznačuje, že miR-199-3p může regulovat funkční expresi miR-1 prostřednictvím suprese svého cíle Lin28b. Celkově vzato, zjištění naznačují, že miR-199-3p se podílí na myogenní diferenciaci prostřednictvím suprese svých cílových genů, Lin28b a Suz12.
Zlepšení svalové regenerace pomocí miR199#4 u myší se svalovým poraněním.výhody cistanche salsyZkoumali jsme účinky miR-199 mimika (miR199#4) in vivo pomocí modelů svalového poranění (obr. 4a, b). Osmitýdenní myši C57BL/6J byly injikovány BaClz do tibialis anterior (TA) k vyvolání svalového poranění a miR19#4 byl podán do poškozených míst o 24 hodin později. Dva dny po podání miR199#4 byla zkoumána exprese myogenních markerových genů. Exprese myog byla významně zvýšena a myogenní diferenciace 1 (Myod1) a myogenní faktor 5 (Myf5) byly také upregulovány podáváním miR199#4 (obr. 4c). Údaje jsou v souladu s výsledky in vitro popsanými výše (obr. 2).
Imunohistochemická analýza regenerujících svalů byla provedena 9 dní po podání miR199#4. Byly zkoumány oblasti průřezu regenerujících svalových vláken (myofibers), charakterizovaných centrálními jádry (obr. 4b). Průměrná plocha průřezu regenerujících svalových vláken ošetřených miR199#4 byla větší než plocha kontrolních svalových vláken ošetřených neumlčujícím kontrolním RNA duplexem (nsCont; Obr. 4d), s rozdílem blížící se statistické významnosti. Kromě střední plochy průřezu, velikostně rozdělený histogram oblasti průřezu ukázal nárůst zvětšených myovláknů v přítomnosti miR199#4 (obr. 4e).
Hypertrofický účinek miR199#4 na stárnoucí svalová vlákna. Zkoumali jsme účinky miR199#4 na staré myši (~24 měsíců staré). Starší myši vykazovaly významný pokles svalové miR-199-3p (obr. 5a), stejně jako cf-miR{10}}p v krevním oběhu, ve srovnání s mladými myšmi. Podali jsme miR199#4 do svalů TA starých myší a o 2 dny později byly svaly TA vyšetřeny imunohistochemickou analýzou (obr. 5b). Průměrná plocha průřezu svalových vláken ošetřených miR199#4 byla významně větší než plocha kontrolních svalových vláken ošetřených nsCont (obr. 5c). V souladu s tím analýza histogramu s rozdělením podle velikosti odhalila výrazné zvýšení zvětšených svalových vláken v přítomnosti miR199#4 (obr. 5d).
Protože krevní oběh cf-miR-199-3p je u starých myší snížen, zavedli jsme miR199#4 do cirkulující krve starých myší přes ocasní marnost. Po intravenózním podání miR19#4 byla zkoumána a analyzována plocha průřezu svalových vláken, jak je popsáno výše. Výsledky, jak je znázorněno na obr. 5e, jsou konzistentní s výsledky lokálního podávání miR199#4 do starých svalů (obr. 5c, d).
Je třeba poznamenat, že existuje rozdíl ve zvětšených svalových vláknech mezi modelem svalového poranění a starými myšmi. Centrální jádra jsou vidět v regenerujících svalových vláknech (obr. 4b), ale taková svalová vlákna byla stěží detekována u starých myší léčených miR199#4 (obr. 5b). To naznačuje, že již existující svalová vlákna se mohou u starých myší po léčbě miR199#4 zvětšit. Předpokládali jsme, že na zvětšení myovlákna u starých myší by se mohl podílet jiný mechanismus odlišný od regenerace svalů, a navrhli jsme zapojení dráhy svalové atrofie.cistanche tubulosa dávkování redditGeny Atroginl a MuRFI úzce souvisejí se svalovou atrofií38 a hladiny jejich exprese jsou významně zvýšené ve starých svalech ve srovnání se svaly mladými (obr. 6a). Zkoumali jsme hladinu Atroginlu a MuRFI ve svalech starých myší po systémovém podání miR199#4. Atroginl a MuRFI byly výrazně sníženy v různých svalech podáváním miR19#4 (obr. 6b), což naznačuje, že potlačení dráhy svalové atrofie pomocí miR199#4 může způsobit expanzi svalových vláken u starých myší.
MiR199#4 oddaluje ztrátu svalové síly u starých myší. Zajímavý je účinek miR199#4 na svalovou funkci u starých myší. Test síly stisku byl proveden na starých myších před a po systémovém podání miR199#4. Experiment byl proveden dvojitě zaslepeným způsobem; injekce RNA a test 100% přilnavosti byly provedeny různými experimentátory bez sdílení informací. Samci myší C57BL/6 (80-týdenní) byli testováni na úchop, poté o 1 týden později jim byly intravenózně podány miR199#4 a nsCont a znovu testovány na úchop. Změna svalové síly po injekci miR199#4 byla MiR199#4 zlepšuje svalovou sílu mdx myší. Protože miR199#4 má pozitivní dopad na svaly, provedli jsme experiment, abychom vyhodnotili účinek podávání miR199#4 u mdx myší, dobře známého zvířecího modelu DMD32. Osmitýdenním mdx myším byla intravenózně podána injekce miR199#4 (1,6 mg/kg) dvakrát (1 týdenní interval) a test úchopu byl proveden 1 týden po posledním podání. Experiment byl proveden dvojitě zaslepeným způsobem, jak je znázorněno na obr.7. Výsledky (obr. 8a) ukazují významné zlepšení svalové síly u mdx myší léčených miR199#4 ve srovnání s mdx myší léčených nsCont. Kromě toho bylo v krvi mdx myší léčených miR199#4 (obr. 8b, c) pozorováno významné snížení aktivity kreatinkinázy (CK) a bezbuněčného miR-1, což jsou možné příznaky onemocnění zlepšení.
Jako činidlo pro dodávání léčiv je atelokolagen viskózní a obtížně se s ním manipuluje a zdálo se, že myši léčené atelokolagenem trpí negativními účinky v důsledku vehikula. Hledali jsme tedy alternativy k atelokolagenu, abychom zlepšili náš systém dodávání léčiv (DDS) a našli jsme kationtové lipozomy DC-CHOL/DOPE jako nové činidlo DDS, které je stejné nebo lepší než atelokolagen (doplňkový obrázek 4). Distribuce léčiva miR199#4 s kationtovými lipozomy ukázala, že podaný miR19#4 byl dodán do svalu a konzistentně přijímán ve velkých množstvích v játrech (doplňkový obrázek 5). Extracelulární miR199#4 dodaný do svalu může fungovat jako mediátor při umlčování genů a přispívat ke genové regulaci podílející se na zlepšení svalové síly.
Pokusili jsme se identifikovat biomolekuly související se zlepšením po podání miR199#4. Různé polypeptidy související s DMD byly zkoumány westernovým přenosem, avšak odlišné signály související se zlepšením nebyly v této studii detekovány (doplňkový obr. 6). Tento bod dále probereme v následující části.
Diskuse
Biomolekuly se se stárnutím kvalitativně i kvantitativně mění--3. Zachycení takových změn a jejich studium jsou zásadní pro pochopení stárnutí a mohou odhalit strategie pro řešení problémů ve stárnoucích společnostech. Studie parabiózy, ve kterých jsou mladá a stará zvířata spojena, aby sdíleli společný cévní systém, poskytly důležité poznatky o stárnutí a omlazení9-l2. Zjištění silně naznačují, že existují omlazující a stárnoucí faktory v cirkulující krvi mladých a starších lidí. Předchozí studie uváděly různé molekuly jako kandidáty související s omlazením a stárnutím, ale výsledky jsou kontroverzní3.
Naše experimenty s buněčnými kulturami in vitro s použitím mladých a starých sér jsou podobné experimentům s parabiózou (obr. lb) a našli jsme miR-199-3p, který se mění s věkem, v cirkulující krvi; bylo zjištěno, že miRNA významně klesá ve stárnoucí krvi (tabulka 1 a obr. la). Navíc exprese svalového (buněčného) miR-199-3p výrazně klesá ve starých svalech ve srovnání se svaly mladými (obr. 5a); takže cf-miR-199-3p v krvi může korelovat se svalovým miR-199-3p. Snížení exprese miR-199-3p se stárnutím je také pozorováno u mezenchymálních kmenových buněk pocházejících z kostní dřeně makaka rhesus39. Exprese buněčné miR-19-3p proto může být pod kontrolou související s věkem. Na rozdíl od miR-19-3p zůstává exprese buněčných myogenních miRNA, jako je miR-1 a miR-133, nezměněna u mladých a starých svalů (obr. 5a), ale úroveň jejich extracelulárních miRNA v krvi je u starých myší výrazně snížen (obr. la). Rozdíl mezi miR-199-3p a myogenními miRNA (miR-1 a-133) může odrážet rozdíl ve zpracování cf-miRNA a/nebo ve věkové kontrole cf-miRNA mezi nimi . K objasnění tohoto rozdílu je třeba v budoucnu provést další studie.
Předchozí studie naznačovaly, že miR-199-3p se účastní různých buněčných funkcí a životně důležitých jevů prostřednictvím suprese svých cílových genů; např. miRNA může podporovat proliferaci a migraci endoteliálních buněk a modulovat nástup puberty prostřednictvím downregulace cíleného genu semaforinu-3A40 a prostřednictvím suprese cílových genů (Cdc42, Map3k2, Map3k4 a Taok1) zapojený do dráhy p38MAPK41. Tato studie zjistila, že miR-19-3p se podílí na myogenní diferenciaci prostřednictvím suprese svých cílových genů Lin28b a Suz12 (obr. 3). Lin28b je protein vázající RNA a inhibuje zrání miRNA, včetně miR-1, což je svalově specifická miRNA a podporuje myogenezi37. Potlačení Lin28b pomocí miR-19-3p způsobuje zvýšení zralého miR-1 (obr. 3), což může umožnit pokračování myogenní diferenciace.
Suzl2 je základní podjednotka polycomb represivního komplexu 2 (PRC2), který se podílí na potlačení chromatinu42. Genová regulace PRC2 se účastní udržování kmenových buněk, embryonálního vývoje, buněčné proliferace a diferenciace, včetně myogenní diferenciace42. PRC2 je přítomen v tichých svalově specifických lokusech, jako je Myog a svalová kreatinkináza (MCK) v nediferencovaných myoblastech, ale je disociován z takových lokusů v diferencovaných myotubech43. Umlčení genu proti Suz12 pomocí RNAi způsobuje zvýšení exprese myogenního genu (obr. 3). Potlačení zesilovače proteinu zeste homolog 2 (Ezh2), další jádrové podjednotky PRC2, také způsobuje myogenní diferenciaci44. Tato zjištění naznačují, že inhibice tvorby PRC2 v důsledku suprese jeho jádrových podjednotek může vyvolat vytvoření genomového stavu pro svalovou diferenciaci. Potlačení Suz12 pomocí miR-199-3p tedy může vyvolat myogenní diferenciaci. Celkově vzato může miR-19-3p hrát důležitou roli v myogenní diferenciaci prostřednictvím inhibice dvou nezávislých drah zahrnujících Lin28b a Suzl2, z nichž každá se podílí na udržování nediferencovaného stavu myoblastů.
Vliv miR-199-3p na myogenní diferenciaci byl také prokázán in vivo (obr. 4). Poškození svalů spouští buněčnou proliferaci a diferenciaci v důsledku svalové regenerace. Zavedení miR199#4, který dodává miR-199-3p do poškozených míst, zvýšilo regeneraci svalů a rozšířilo regenerační svalová vlákna (obr. 4). Exprese myogenního genu byla při léčbě miR199#4 konzistentně upregulována (obr. 4). Z praktického hlediska může být miR199#4 účinný a užitečný pro chirurgické léčby.
Když byl miR199#4 podáván starým myším bez miR-199-3p v krevním oběhu, myši vykazovaly výrazně rozšířená svalová vlákna (obr. 5) a opožděnou ztrátu svalové síly se stárnutím (obr. 7). Expandovaná svalová vlákna u starých myší se liší od regenerujících se svalových vláken, která jsou zvětšená v přítomnosti miR199#4; první je odvozen od již existujících svalových vláken a druhý je odvozen od neo-myovlákna (novorozených svalových vláken). Ve zvětšování svalových vláken tedy existují různé, nezávislé mechanismy. Naše studie naznačuje, že (i) v prvním případě inhibice svalové atrofie v důsledku suprese Atroginlu a MuRFI léčbou miR199#4 způsobuje zvětšení starých svalových vláken a (ii) v druhém případě potlačení cílových genů, Lin28b a Suz12, způsobuje zvětšení regeneračních svalových vláken. Celkově se na svalové hypertrofii v různých situacích mohou podílet různé (vícenásobné) geny regulované miR-19-3p. Zjištění také naznačují, že miR-199-3p může mít přinejmenším antiagingový účinek na svaly a že miR199#4 dodávající miR-199-3p může mít potenciál jako nový RNA lék na svalová onemocnění související s věkem, jako je sarkopenie.
Na základě vysoké účinnosti miR199#4 na svaly jsme podali miR199#4 myším mdx, dobře známý model DMD, a získali pozoruhodné výsledky: systémové podávání miR199#4 zlepšilo svalovou sílu u myší o ~20 procent ( obr. 8a). Abychom pochopili mechanismus obnovy svalové síly, pokusili jsme se identifikovat biomolekuly, které byly zlepšeny (nebo ovlivněny) miR-199-3p. S výjimkou zlepšení krevní CK a cf-miR-1 (obr. 8b, c) jsme však nebyli schopni detekovat taková zlepšení na molekulární úrovni. Tato obtížnost detekce může být způsobena komplexní buněčnou populací, která se skládá ze směsi regenerujících a narušujících svalových buněk u mdx myší. I když miR199#4 povede ke zlepšení, vysoký šum pozadí způsobený komplexní buněčnou populací by maskoval důkazy o zlepšení. K vyřešení tohoto problému je třeba provést rozsáhlejší studie využívající homogenní populaci svalových buněk odvozenou od mdx myší nebo zaměřené na různé tkáně, včetně svalů.
Ačkoli molekulární mechanismus obnovy svalové síly pomocí miR199#4 zůstává neznámý, dávka miR19#4 pro zlepšení svalové síly je pozoruhodná. Dvojnásobné podání ~1,6 mg/kg miR199#4 zlepšilo svalovou sílu u mdx myší. Zdá se, že účinná dávka je nižší než u antisense oligonukleotidů pro přeskočení exonu proti mutantním dystrofinovým genům in vivo45-47. Důvod, proč je miR199#4 schopen zlepšit svalovou sílu při tak nižších dávkách, může být způsoben jeho odlišným mechanismem účinku ve srovnání s antisense oligonukleotidy. Mechanismus účinku miR19#4 je katalytické umlčování genu. Naproti tomu mechanismus antisense oligonukleotidů je založen na fyzikální hybridizaci. Rozdíly ve vhodných dávkách k prokázání účinnosti léku lze proto připsat různým mechanismům účinku.
Mechanismus, kterým orgány, tkáně nebo buňky uvolňují miRNA do cirkulující krve, není dosud plně objasněn a regulace uvolňování takových miRNA související s věkem je také nejasná. Tato studie ukázala, že myogenní cf-miR-NA, včetně cf-miR-199-3p cirkulují s krví v cévním systému a s věkem se snižují. Takové cf-miRNA mohou být přítomny v exozomech, tj. jsou to exosomální miRNA.
Myogenní miRNA se účastní myogenní diferenciace, svalové regenerace a udržování svalové homeostázy33. Předchozí studie uváděly, že bylo pozorováno, že myogenní miRNA, jako je miR-1 a miR-133, přibývá v krvi v reakci na fyzické cvičení4849. Na základě těchto zpráv mohou aktivní mladé myši uvolňovat do krve více myogenních miRNA než staré pomalu se pohybující myši a takové extracelulární miRNA, včetně cf-miR-199-3p, mohou přispívat k udržení svalové homeostázy u mladých myší prostřednictvím autokrinního působení . Hladina extracelulární (exosomální) miRNA však ne vždy koreluje s hladinou buněčné miRNA a byly pozorovány rozdíly v myogenních miRNA a miR-199-3p mezi mladými a starými myšmi (obr. la a 5a) a během myogenní diferenciace (doplňkový obr. 2a). Jako další možnost je tedy možné si představit, že regulace tvorby exosomů související s věkem a diferenciací může ovlivnit produkci cf-miRNA; konkrétně mohou existovat rozdíly v tvorbě exosomů mezi mladými a starými myšmi. V kontextu těchto hypotéz je zapotřebí další studie k objasnění uvolňování myogenních miRNA do krve související s věkem.
Kromě mechanismu uvolňování, kdy mladé myogenní cf-miRNA obsahující cf-miR-199-3p proudí do starého krevního oběhového systému z mladého cévního systému parabiózou, mohou cf-miRNA vyvolat svalovou aktivaci a inhibici svalů atrofie na straně věku; tento koncept je podpořen důkazy od starých myší, kterým byl v této studii intravenózně injikován miR19#4 (obr. 5-7). Cf-miRNA v krvi mohou souviset s homeostatickou funkcí související s věkem a mohly by představovat změněnou homeostázu. Pokud jsou takové cf-miRNA přítomny ektopicky, například když jsou cf-miRNA v mladé krvi přeneseny do stárnoucího krevního oběhového systému, některé cf-miRNA mohou vykazovat omlazující účinky na starší straně, tj. mohou mít účinky proti stárnutí. Naproti tomu cf-miRNA ve stárnoucí krvi mohou představovat změněnou homeostázu stárnutím. Když jsou takové cf-miRNA přeneseny do systému krevního oběhu mladých lidí, některé cf-miRNA mohou vyvolat zhoršení související se stárnutím a mohou způsobit předčasné stárnutí na straně mladých. Cf-miRNA, které jsou významně zvýšené ve stárnoucí krvi, představují kandidáty, kteří budou vyžadovat podrobnou mechanickou analýzu k pochopení a prevenci stárnutí.
Závěrem lze říci, že naše současná studie poskytla nový pohled na cf-miRNA jako molekuly související s věkem a odhalila nový směr výzkumu k objasnění vztahu mezi stárnutím a funkčními RNA bez buněk, včetně cf-miRNA.
Tento článek je převzat z COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio
