Studie o mikrobiálních enzymech produkovaných během kombinované bakteriální fermentace a jejich biologických aktivity ⅲ

Kapitola 3 Studie o antioxidační aktivitě enzymů

 

Ukázalo se, že mnoho lidských chorob souvisíaktivní kyslík a volné radikály, jako jezánět, arterioskleróza,stárnutí, Diabetes, rakovinaatd.Nadměrné volné radikályV těle může způsobit denaturace proteinu, poškození buněk a smrt a dokonce i patologické změny v těle. Mnoho studií doma i v zahraničí proto hledá potraviny bohaté na přírodní antioxidační složky, aby se zabránilo a regulovalo onemocnění způsobené volnými radikály prostřednictvím stravy. Dnes, se zvyšující se životní úroveň, lidé postupně přesouvají své zaměření na vlastní těla, takže se stále více a více zdravotnických produktů objevuje v nekonečném proudu. Není však snadné být opravdu užitečný. Enzymy jsou druh jídla, které můžete sami vyrobit v životě lidí. Náklady nejsou příliš vysoké a existuje mnoho výhod.
Mikrobiální enzymy mají řadu zdravotních funkcí, jako je antibakteriální a protizánětlivé, podporující metabolismus, zlepšení imunity, bělení a proti stárnutí, detoxikace a protirakovinu. V současné době existuje relativně málo studií o antioxidačních vlastnostech mikrobiálních enzymů doma i v zahraničí, takže plánujeme provést hloubkový výzkum. Tento článek bere enzym Apple jako výzkumný objekt a používá celkový obsah fenolu, snižuje výkon, DPPH · volný radikál, · Oh volný radikál, superoxid volný radikál a schopnost volného radikálu vychytávání volných radikálů, jak indexuje pro provádění komplexního a systematického zkoumání enzymu jablek po fermentaci. Byla studována složení a obsah antioxidačních aktivních složek a jeho antioxidační aktivita byla pochopena.

Nové bylinky cistanche s mnohem více antioxidační síly než fermentace bakterií

Podpůrná služba Wecistanche-největšího vývozce Cistanche v Číně:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materiály a metody

3.1.1 Materiály

(1) Experimentální materiály
Umyjte čerstvá jablka sterilní vodou za sterilních podmínek, přirozeně je vysušte do sterilního operačního stolu, loupá je a nakrájíme na pozdější použití. Přidejte bílý cukr a jablka do sterilizované skleněné nádoby při hmotnostním poměru 1: 1. Aktivujte bakterie potřebné pro experiment a naočoute je do enzymu podle optimálního schématu (tento operační krok je vynechán v kontrolní skupině), utěsněte je a umístěte na chladné a suché místo. Po 3 měsících fermentace teploty místnosti si vezměte vzorek a získejte celou enzymovou kapalinu obsahující buničinu a filtrujte ji. Vezměte supernatant jako experimentální vzorek a před stanovením příslušných údajů odstřeďujte vzorek při 10000 ot / min po dobu 15 minut ve vysokorychlostní odstředivce. Stojí za zmínku, že v procesu výroby enzymů, aby se zabránilo zbytečné kontaminaci, jsou všechny naše operace prováděny za sterilních podmínek.

(2) Hlavní nástroje
Spektrofotometr: V -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Konstantní teplotní vodní lázeň: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Jiné nástroje jsou stejné jako 2.1.3.

3.1.2 Metody

(1) Stanovení celkového obsahu fenolu [53]
① Příprava standardní křivky:
Přesně zvážte {{{0}}. 123 g kyseliny galkové, rozpusťte ji v malém množství destilované vody a přeneste ji na 5 0 0 Ml Volumetric Brack, aby se vytvořila. Take 8 clean 1{{10}} mL volumetric flasks, add 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, and 1.4 mL of gallic acid standard solution, respectively, dilute to the mark with distilled water, add 1 mL of Folin reagent and 2 mL of 20% NaCO3 to each, heat in a boiling water bath for 1 Min, chladné a zředěné na 20 ml a umístěte při pokojové teplotě po dobu 30 minut. K měření absorbance A při vlnové délce 650 nm použijte spektrofotometr a nakreslete standardní křivku s absorbancí A jako horizontální osa a koncentraci vzorku jako svislé ose. ② Detekce
Přidejte destilovanou vodu na 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl a 500 μl vzorkovacích roztoků do 46 ml, poté přidejte 1 ml folin-fenolového činidla, promíchejte rovnoměrně, reagujte na 3min a poté přidejte 3 ml 20% naco3, protřepejte se 25 stupňových teplotních lázní po dobu 2H, protřepejte a oživujte a oživujte a oživujte a oživujte a oživujte na a odařte a ohonnou délku a při přidaní odací a odolku na a odařte v a přidané odolku s a odací a přidaní a odařuje a přidává odařování a ohonnou délku a při přidávání odolku na a odařuje a přidává s odařováním v a přidané odolku s a odařováním a přidanou odolku s a přidanou odací a odařováním a odařováním a přidáním A při a ožive. spektrofotometr. Celkový obsah fenolu je exprimován jako ekvivalenty kyseliny galové a celkový obsah fenolu se počítá podle rovnice standardní křivky.

(2) Redukční test [54]
Přidejte 1 0 0 μl, 2 0 0μl, 300 μl a 500 μl vzorku na 2,5 ml fosfátu pufru s 1%a reagovat na 1%, a při pH a reagovat na 1%a) A při pH AT a REAM AT A při reagujícím A při reagujícím A při reagujícím a v hodnotě 1%a) A při reagujícím a v hodnotě 1%, a při pH a přidává se a v hodnotě 1%a) a při pH a přidává se s hmotností s hmotností a přidává se s pH s pH a přidává 2,5 ml. 50 stupňů po dobu 30 minut. Poté přidejte 2,5 ml trichloroctové kyseliny (hm./obj.) S hmotnostní koncentrací 10%a odstředivé při 3000 ot/min po dobu 10 minut ve vysokorychlostní odstředivce. Bezprostředně po vytáčení vezměte 2,5 ml supernatantu do objemové baňky, přidejte 2,5 ml destilované vody a 0,5 ml chloridu železitého (W/V) s hmotnostní koncentrací 0,1%. Použijte destilovanou vodu jako prázdné ovládání a měřte absorbanci A při vlnové délce 700 nm pomocí spektrofotometru. Síla redukční síly může být posuzována podle hodnoty absorbance. Čím vyšší je hodnota absorbance, tím silnější je redukční síla.

 

(3) Stanovení efektu superoxidového aniontového vychytávání volných radikálů [55]

Vezměte 4,5 ml 0. 0 5 mol/l pH 8,2 Tris-HCl pufru a předehrejte jej ve 25 stupňové vodní lázni pro 2 0 min. Přidejte 1 ml roztoku vzorku enzymu s koncentracemi 10%, 20%, 30%, 40%a 50%a 0,4 ml roztoku 25 mmol/l pyrogallol. Dobře promíchejte a reagujte ve 25 stupňové vodní lázni po dobu 5 minut. Přidejte 1,0 ml 8 mol/l HCl pro ukončení reakce. Jako reference použijte vyrovnávací paměť Tris-HCI a pro výpočet rychlosti vychytávání použijte spektrofotometr k měření absorbance A při vlnové délce 299 nm. Pro skupinu s prázdnou kontrolou bylo místo vzorku použito 1 ml rozpouštědla. Rychlost vychytávání O 2- byla vypočtena podle vzorce 3.1: o 2- úklidová rychlost (%)=(A 1- a2)/A1 × 100 (3.1), kde: A1 je absorbance prázdné trubice; A2 je absorbance vzorku.

(4) Stanovení účinku úniku na hydroxylové radikály [56]

1 0 0 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl vzorku roztoku byl přidán s vodou do 2 ml, poté přidán do 1,4 ml peroxidu vodíku s molární hmotnostní koncentrací 6 mm/l s molární koncentrací 20 mmol/l a 2ml a 2ml a 2ml a 2ml a 2ml s noulární hmotností frín. 1,5 mmol/l a zahřívá se ve vodní lázni konstantní teplotě při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Upravte na nulu destilovanou vodou a měřte absorbanci A při vlnové délce 562nm pomocí spektrofotometru. Proveďte 3 replikáty pro každé ošetření. Vypočítejte rychlost vychytávání hydroxylu podle vzorce 3.2: Hydroxylový radikální úklidová rychlost (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.2), kde: A1 je průměrná absorbance prázdného; A2 je průměrná absorbance roztoku vzorku. (5) Stanovení efektu DPPH volných radikálů [57]

Nové bylinky cistanche s mnohem více antioxidační síly než fermentace bakterií

 

Přesně pipeta 2 ml roztoku vzorku enzymu s koncentracemi 1 0%, 20%, 30%, 40%a 50%do 10 ml objemové baňky a poté přidejte 2 ml 80%DPPH ethanolového vodního roztoku k volumetrické baňce. Koncentrace molární hmotnosti je 2 × 10-4 mol/l. Po smíchání nechte jej stát při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Použitím 80% roztoku ethanolu jako reference změřte absorbanci vzorku při vlnové délce 517 nm, která je zaznamenána jako A1. Smíchejte 2 ml roztoku DPPH a 2 ml ethanolového roztoku s hmotnostní koncentrací 80% a změřte jejich absorbanci na stejné vlnové délce, která je zaznamenána jako A0. Smíchejte 2 ml enzymového roztoku a 2 ml ethanolového roztoku s hmotnostní koncentrací 80% a změřte jejich absorbanci na stejné vlnové délce, která je zaznamenána jako A2. Vypočítejte rychlost vychytávání volných radikálů DPPH podle vzorce 3.3:
Rychlost volného radikálu volných radikálů (%) {{0}} [1- (A 1- a2)/A 0] × 100 (3.3) Kde: A1 je absorbance 2 ml DPPH Aquanol Aqueuous Aqueuous Aqueous Aqueous Aqueuous Aqueous Aqueuous Aqueous Aqueous Aqueous Aqueous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueuous Aqueous Solution; A2 je absorbance smíšeného roztoku roztoku 2 ml enzymu a 2 ml 80% ethanolu hmotnostní koncentrací; A0 je absorbance smíšeného roztoku 2 ml roztoku DPPH a 2 ml 80% ethanolu hmotnostní koncentrací.

(6) Schopnost vychytávání volných radikálů ABTS [58]
Přidejte určité množství síranu draselného do roztoku 7 mmol/l ABTS, dokud není konečná koncentrace smíšeného roztoku 2,45 mmol/l. Smíšeného roztoku umístěte na chladné a suché místo při teplotě místnosti po dobu 12 až 16 hodin. 1 μl, 3 μl, 5 μl, 7 μl a 9μl roztoku vzorku byly doplněny na 10 μl s 5 mmol/l pH7,4 fosfátovým pufrem a poté se rovnoměrně smíchaly s 10ml výše uvedeného síranu draselného a ABTS smíšeného roztoku a reagovaly na reakční teplotu a reakční doba 5 min. Nula s destilovanou vodou a měřte absorbanci A při vlnové délce 734nm pomocí spektrofotometru. Vypočítejte míru úklidu volných radikálů ABTS podle vzorce 3.4:
ABTS Free Radical Scaveng Rychlost (%)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.4), kde: A1 je absorbance kontrolní skupiny Blank; A2 je absorbance experimentální skupiny

 

3.2 Výsledky a analýza

3.2.1 Celkový obsah fenolu

(1) Standardní křivka
Standardní křivka celkového obsahu fenolu byla nakreslena s koncentrací kyseliny galové jako horizontální ose a hodnota absorbance A jako svislé ose, jak je znázorněno na obrázku 3.1.

 

Obr.3.1 Standardní křivka celkového obsahu fenolu

Z obr.3.1 vidíme, že standardní rovnice křivky je y =11. 375x +0. 2593 (x je koncentrace vzorku, y je absorbance), r 2=0. 9981.

(2) Stanovení vzorků

Výsledky stanovení celkového obsahu fenolu enzymů Apple v kontrolní skupině a experimentální skupiny v různých koncentracích jsou uvedeny na obr .3.2.

 

 

 

Obr.3.2 Křivka celkového obsahu fenolu

Jak je znázorněno na obr.3.2, enzymy Apple v kontrolní skupině i v experimentální skupině mají vysoký celkový obsah fenolu a obě se zvyšují se zvýšením množství přidaného roztoku vzorku. Ve stejném gradientu koncentrace se celkový fenolový obsah enzymu jablek v kontrolní skupině zvýšil z 0. 673 mg na 2,8 0 7mg a celkový fenolový obsah experimentální skupiny se zvýšil z 0,961 mg na 4,185 mg. Celkový fenolový obsah experimentální skupiny je mnohem vyšší než obsah kontrolní skupiny a vzestupný trend je jasnější. Podle celkového obsahu fenolického obsahu je celková antioxidační aktivita experimentální skupiny větší než aktivita kontrolní skupiny.

 

3.2.2 Snížení energie

Výsledky snížení stanovení výkonu enzymů Apple v kontrolní skupině a experimentální skupiny v různých koncentracích jsou uvedeny na obrázku 3.3.

 

Jak je znázorněno na obrázku 3.3, měnící se trend redukční síly enzymů jablek je podobný měnícím se trendu celkového obsahu fenolu. Snížená síla experimentální skupiny je vyšší než síla kontrolní skupiny a zda se jedná o experimentální skupinu nebo kontrolní skupina, v rozsahu koncentrace prezentovaného v experimentu, redukční síla ukazuje rostoucí trend se zvýšením množství přidaného roztoku vzorku. Experimentální data také potvrdila, že pokud jde o snižování energie, antioxidační aktivita experimentální skupiny je větší než aktivita kontrolní skupiny.

 

 

3.2.3 Superoxid Anion Anion Free Radical Spalists

Výsledky superoxidového aniontového volného radikálu vychytávací schopnosti enzymů jablek v kontrolní skupině a experimentální skupiny v různých koncentracích jsou uvedeny na obrázku 3.4.

Jak je znázorněno na obrázku 3.4, existuje velký rozdíl v schopnosti superoxidového aniontového volného radikálu mezi experimentální skupinou a kontrolní skupinou. V rozmezí koncentrace prezentovaného v experimentu se superoxidový aniontový radikál vychytávací schopnost experimentální skupiny nejvýznamněji mění, když je koncentrace vzorku 10%až 20%a změna není zřejmá po koncentraci větší než 20%; Pokud je koncentrace 50%, je schopnost superoxidového aniontu volný radikál až 85,4%. Schopnost vychytávání volných radikálů na superoxidu, kterou řídí kontrolní skupina, lze jasně vidět z trendového grafu. Jak se koncentrace enzymu zvyšuje, tato schopnost vychytávání volných radikálů se také zvyšuje, mění se pomalu a postupně má sklon do stabilního stavu. Schopnost vychytávání dosahuje maximálně 42,6%. Experimentální skupina je téměř dvakrát vyšší než kontrolní skupina.

 

 

3.2.4 Schopnost vychytávání radikálů hydroxylu

Změny v hydroxylovém volném radikálu vychytávací schopnosti enzymů jablek v kontrolní skupině a experimentální skupině v různých koncentracích jsou znázorněny na obr. 3.5.

 

 

Obr.3.5 Křivka úklidu hydroxylu volný radikál

 

Z obr. 3.5 je vidět, že v rozmezí koncentrace prezentovaného v experimentu se schopnost vychytávání enzymů v experimentální skupině v experimentální skupině zvýšila se zvýšením přidaného množství. Schopnost vychytávání radikálů hydroxylu byla nižší než schopnost kontrolní skupiny a při nízkých koncentracích fungovala velmi špatně. Při vysokých koncentracích se schopnost hydroxylového volného radikálu výrazně zvýšila. Důvodem může být to, že během fermentačního procesu byly typy a obsah mikroorganismů v enzymech Apple v experimentální skupině a kontrolní skupině odlišné a obsah sekundárních metabolitů a složek každého produktu produkovaného fermentací byl odlišný, takže zobrazená antioxidační kapacita byla odlišná.

 

3.2.5 DPPH · Schopnost vychytávání volných radikálů

Ve srovnání s jinými metodami detekce se schopnost DPPH · vychytávání volných radikálů široce používá k vyhodnocení antioxidační aktivity v krátkém časovém období [59]. Schopnost vychytávání volných radikálů DPPH · byla vynesena podle výsledků kontrolní skupiny a experimentální skupiny jablečných enzymů, jak je znázorněno na obrázku 3.6.

Jak je znázorněno na obrázku 3.6, když byla koncentrace enzymu jablečné skupiny kontrolní skupiny nižší než 30%, schopnost vychytávání volných radikálů DPPH byla menší než 50%, ale experimentální skupina Apple enzym také vykazovala vyšší schopnost volného radikálu volného radikálu při nízkých koncentracích. Experimentální výsledky ukazují, že přidání Aspergillus oryzae, kvasinek, termofilního streptokoku a bulharského laktobacillu je prospěšné pro schopnost enzymu DPPH · volných radikálů enzymu. Pokud je koncentrace enzymu 50%, je tato schopnost až 91,4%, což je mnohem vyšší než 69,8%kontrolní skupiny ve stejné koncentraci.

 

3.2.6 ABTS radikální úklidová kapacita

Výsledky ABTS radikální vychytávací kapacity jablkových enzymů v kontrolní skupině a experimentální skupiny v různých koncentracích jsou uvedeny na obr. 3.7.

Obr.3.7 Křivka ABTS radikální vychytávací kapacita
Z obr. 3.7 je vidět, že rychlost úklidu enzymů Apple v experimentální skupině je vyšší, když je přidání enzymu větší než 5 μl. Studie Erel et al. ukázali, že vychytávací kapacita ABTS radikálů závisí do značné míry na vyšší koncentraci fenolických látek [60]. Výsledky stanovení celkového obsahu fenolu ukázaly, že celkový obsah fenolu v experimentální skupině byl vyšší než obsah kontrolní skupiny. Experimentální výsledky na obr. 3.7 právě ověřovaly, že vychytávací kapacita ABTS radikálů je větší než kapacita kontrolní skupiny.

 

3.3 Shrnutí této kapitoly

Tato kapitola studuje vztah mezi antioxidační aktivitou jablkových enzymů produkovaných fermentací se čtyřmi vybranými kmeny jablek, koncentrací enzymových vzorků a srovnání antioxidačních aktivních složek a schopností volného radikálu mezi experimentální skupinou a kontrolní skupinou. Experimentální výsledky ukazují, že celkový obsah fenolu v enzymu Apple v kontrolní skupině je nižší než obsah v experimentální skupině a jeho redukční síla, superoxidový aniontový volný radikál, volný radikál DPPH a schopnost volných radikálů je lepší než obsah v kontrolní skupině; Enzym v kontrolní skupině má obzvláště dobrou schopnost vychytávání hydroxylových volných radikálů.
Experimentální skupina obecně vykazovala vyšší antioxidační aktivitu, která dále potvrdila proveditelnost umělého přidávání kmenů k výrobě mikrobiálních enzymů. Tímto způsobem mají mikrobiální enzymové potraviny více látek prospěšných pro lidské zdraví na základě původního přirozeného kvašení a mohou se lépe rozvíjet ve směru očekávané lidmi.