Metformin chrání epiteliální buňky čočky před stárnutím u modelu přirozeně stárnoucí myši
Jul 12, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
ÚVOD
Čočkové epiteliální buňky (LEC) tvoří monovrstvu buněk vystýlající přední pouzdro čočky a sahají až k oblouku ekvatoriální čočky [1, 2]. Normální konstrukce a funkce LEC jsou nezbytné pro udržení průhlednosti a metabolické homeostázy celé čočky[3]. Stále více důkazů ukazuje, že stárnutí LEC může způsobit modifikaci, denaturaci a agregaci čočkových proteinů včetně enzymů a krystalinů, což nakonec vede k zakalení čočky nebo dokonce kataraktě [3-5]. Věkem podmíněná katarakta (ARC) zůstává hlavní příčinou zrakového postižení a slepoty, což vážně ovlivňuje kvalitu života starších jedinců [6]. V současné době neexistují žádné účinné strategie pro prevenci progrese ARC. Proto je nutné vyvinout farmakologickou intervenci, která může zlepšit průhlednost čočky a oddálit progresi ARC.
Během několika posledních desetiletí vědci dosáhli pozoruhodného pokroku ve zlepšování zdraví a prodlužování délky života pomocí několika genetických, dietních a farmakologických intervencí [7]. Metformin (MET) je jedním z rozsáhle studovaných činidel proti stárnutí. Podstatné studie naznačují, že MET může zmírnit stárnutí a prodloužit zdravý život v různých zvířecích modelových systémech. MET může nejen prodloužit životnost Caenorhabditis elegans, ale také zlepšit její zdraví a vitalitu [8]. MET může snížit akumulaci poškození DNA v kmenových buňkách středního střeva Drosophila související s věkem a oxidativním stresem a prodloužit jejich životnost [9]. Předchozí studie také naznačují, že chronické podávání nízkých dávek MET zlepšuje zdraví a délku života myší [10]. Kromě toho se objevující důkazy naznačují, že když jsou pacienti s diabetem léčeni MET, projevují výhody přežití, a to i ve srovnání s kontrolami, které diabetes nemají [11].
Kromě aktivity MET na podporu životnosti v různých modelových organismech se MET zaměřuje na mnohočetné buněčné signální dráhy ke zmírnění onemocnění souvisejících s věkem. Ukázalo se, že MET moduluje autofagii především prostřednictvím aktivace adenosinmonofosfátem (AMP) aktivované proteinkinázy (AMPK) a brání neurodegeneraci a neurozánětům, aby hrály neuroprotektivní roli u Parkinsonovy choroby [12]. Podobně MET zlepšuje změny související s věkem v jaterní sinusoidální endoteliální buňce prostřednictvím AMPK a endoteliálních cest oxidu dusnatého [13].cistanche dávkování redditKromě toho chronická aktivace AMPK pomocí MET zabraňuje kardiomyopatii upregulací autofagie u myší OVE26 s diabetem [14]. Kromě toho MET zmírňuje kardiovaskulární zhoršení související s věkem tím, že zvyšuje autofagii a kalorickou restrikci [15]. Kromě toho může léčba MET inhibovat aterosklerózu související s věkem u myší a králíků ApoE-7-navozenou dietou s vysokým obsahem tuků, významně zabránit kalcifikaci aterosklerotického plaku, snížit hladiny vysoce citlivého C-reaktivního proteinu a potlačit aktivaci dráha jaderného faktoru kappa B(NF-kB) v krevních cévách [16-18].
Na základě těchto pozorování se tato studie pokusila prozkoumat, zda MET může zpomalit stárnutí ARC a základní molekulární mechanismus. Naše zjištění jsou následující: (i) chronická léčba MET nízkou dávkou oddálila stárnutí LEC u přirozeně starých myší, čímž inhibovala zákal čočky; (i) dráha AMPK byla inaktivována a autofagický tok byl narušen u senescentních LEC; (i) ) chronická léčba MET nízkou dávkou oddálila stárnutí LEC u přirozeně starých myší aktivací dráhy AMPK a posílením autofagie. Naše zjištění potvrzují domnělou roli MET proti stárnutí a poskytují dostatečné důkazy, že MET se může ukázat jako možná terapeutická možnost pro ARC.
VÝSLEDEK
Senescence LEC byla spojena s ARC u přirozeně starých myší
Rozsáhle bylo zkoumáno několik potenciálních mechanismů ARC, včetně účinku stárnutí.výhody extraktu z cistanche,Asociace mezi stárnutím LEC a ARC in vivo však zůstává nejasná. Předpokládali jsme, že stárnutí LEC může vést k ARC in vivo. Proto jsme zkonstruovali myší model ARC. Naše výsledky ukázaly, že průhlednost čočky u přirozeně starých myší (starší myši) byla významně snížena ve srovnání s kontrolní skupinou (mladé myši) (obr. 1a). Jak je znázorněno na obr. 1b, výskyt šedého zákalu u přirozeně stárnoucí skupiny byl 95,23 procenta. Test barvení H&E ukázal, že LEC v kontrolní skupině byly kulatého tvaru a pravidelně uspořádány a hustota normálních LEC byla relativně vysoká, zatímco LEC přirozeně stárnoucích myší byly plochého tvaru a uspořádané nerovnoměrně a hustota normálních LEC byla relativně vysoká. senescentní LEC byly výrazně sníženy (obr. 1c). Navíc barvení SA- -Gal ukázalo, že poměr senescentních LEC byl u přirozeně starých myší zvýšený (obr. 1d). Dále jsme analyzovali proteinovou expresi markerů spojených se stárnutím pomocí IHC barvení a analýzy western blot. IHC barvení odhalilo, že exprese p21 a p53 byla zvýšena v LEC přirozeně starých myší ve srovnání s mladými myšmi (obr. 1e, f). Podobně jsme dále zjistili, že proteinová exprese p21 a p53 byla vyšší v pouzdrech čoček přirozeně stárnoucích myší než v pouzdrech čoček mladých myší (obr. 1g). Tyto výsledky naznačují, že stárnutí LEC bylo spojeno s ARC u přirozeně starých myší.
Cistanche může proti stárnutí
Chronické podávání nízkých dávek MET zlepšilo průhlednost čočky a zmírnilo stárnutí LEC Než jsme testovali účinek metforminu na ARC, zjišťovali jsme, zda je chronické podávání nízkých dávek MET pro myši bezpečné. Po léčbě MET po dobu 10 měsíců zemřelo 28 myší (18 ve skupině přirozeně stárnoucích a 10 ve skupině MET) přirozenou smrtí. Zjistili jsme, že živé myši v obou skupinách byly zdravé a mezi oběma skupinami nebyl žádný významný rozdíl v tělesné hmotnosti a hmotnosti orgánů (tabulka 1). Tyto výsledky tedy naznačovaly, že dávka metforminu použitá ve studii byla pro zvířata bezpečná a mohla být použita pro následné experimenty.
Následně byla podávána chronická nízká dávka MET pro posouzení, zda MET může inhibovat zákal čočky a zmírnit stárnutí LEC související s věkem u přirozeně starých myší. Jak se očekávalo, průhlednost čočky ve skupině MET se výrazně zlepšila ve srovnání s průhledností čočky ve skupině přirozeně stárnoucích (obr. 2a). Morfologická pozorování navíc potvrdila, že čočka skupiny MET vykazovala snížení opacity. Incidence katarakty ve skupině přirozeně stárnoucích byla 95,23 procenta, zatímco ve skupině MET byla 19.00 procent (obr.2b). Test barvení H&E odhalil, že hustota LEC ve skupině MET byla výrazně vyšší než u přirozeně starých myší (obr. 2c). Navíc LEC skupiny MET měly relativně kulatý tvar ve srovnání s přirozeně stárnoucí skupinou (obr. 2c). Barvení SA- -Gal ukázalo, že poměr senescentních LEC byl významně snížen ve skupině MET ve srovnání s poměrem ve skupině přirozeně stárnoucí (obr. 2d). IHC analýza odhalila, že exprese p21 a p53 byla snížena více v LEC ve skupině MET než ve skupině přirozeně stárnoucí (obr. 2e, f). Podobně analýza western blot odhalila, že proteinová exprese p21 a p53 byla výrazně snížena v pouzdrech čoček skupiny MET ve srovnání s pouzdry čočky u přirozeně stárnoucí skupiny (obr. 2g). Tyto výsledky naznačují, že chronické podávání nízkých dávek MET by mohlo zlepšit průhlednost čočky a zmírnit stárnutí LEC.
Chronické podávání nízkých dávek MET zmírnilo stárnutí LEC u přirozeně stárnoucích myší prostřednictvím aktivace AMPK Převážné množství dat podporuje závěr, že aktivace AMPK je dostatečná k prodloužení života v modelových organismech, což zvyšuje její přitažlivost jako cíl dlouhověkosti [19,20]. . S ohledem na tuto teorii jsme hodnotili expresi AMPK dráhy v LEC myší. Relativní hladina mRNA FAS byla snížena ve skupině přirozeně stárnoucích a zvýšena ve skupině MET (obr. 3a). Jak je ukázáno na obr. 3b, c, exprese fosforylované AMPKa (Thr172) a fosforylovaného ACC (Ser79) byla snížena v LEC přirozeně stárnoucích myší ve srovnání s těmi u mladých myší. Nicméně exprese fosforylovaného AMPKa (Thr172) a fosforylovaného ACC (Ser79) byla zvýšena v LEC skupiny MET ve srovnání s expresí přirozeně stárnoucí skupiny. Kromě toho analýza Western blot odhalila, že proteinová exprese fosforylovaného AMPKa (Thr172) a fosforylovaného ACC (Ser79) byla významně snížena v pouzdrech čoček přirozeně stárnoucích a hladiny proteinové exprese fosforylovaného AMPKa (Thr172) a fosforylovaného ACC ( Ser79) byly zvýšeny v pouzdrech čoček skupiny MET (obr. 3d). Tato data odhalila, že dráha AMPK byla inaktivována v LEC přirozeně starých myší. Kromě toho chronické podávání nízkých dávek MET zeslabilo senescenci LEC u přirozeně starých myší prostřednictvím aktivace AMPK.
Chronické podávání nízkých dávek MET obnovilo autofagický tok ke zmírnění stárnutí LEC u přirozeně stárnoucích myší Předchozí studie ukázaly, že autofagie může hrát důležitou roli v boji proti nepříznivým účinkům stárnutí [21,22]. Abychom dále analyzovali molekulární a buněčné změny v čočce po léčbě MET, určili jsme expresi LC3 a p62, protože jsou široce přijímány jako biomarkery úrovní autofagie. Jak je ukázáno na obr. 4a, relativní hladina exprese p62 mRNA byla významně zvýšena u přirozeně stárnoucí skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou; avšak relativní hladina exprese mRNA p62 byla podstatně snížena ve skupině MET ve srovnání se skupinou přirozeně stárnoucí.cistanche džingischánKromě toho IHC barvení odhalilo, že hladiny lehkého řetězce proteinu 1 asociovaného s mikrotubuly 3 (LC3-II/l) a p62 byly zvýšeny v LEC přirozeně starých myší. Naše výsledky dále ukázaly, že hladiny LC3-II/l a p62 byly pozoruhodně sníženy v LEC skupiny MET (obr. 4b, c). Hladiny proteinu LC3-ll a p62 byly výrazně zvýšeny v pouzdrech čočky přirozeně stárnoucí skupiny (obr. 4d). Celkově jsme spekulovali, že autofagický tok byl narušen v LEC přirozeně starých myší a mohl by být obnoven chronickým podáváním MET v nízkých dávkách, aby se zmírnilo stárnutí LEC u přirozeně starých myší.
DISKUSE
Neléčená katarakta je celosvětově hlavní příčinou slepoty, která se vyznačuje opacifikací krystalické čočky [23]. Epidemiologické studie prokázaly, že věk je dominantním rizikovým faktorem katarakty, známé jako ARC, a jedinou léčbou je chirurgické odstranění [24]. Předchozí studie ukázaly, že senescence LEC je hlavní příčinou ARC [25]. Dosud neexistovala žádná účinná terapeutická činidla pro inhibici zákalu čočky a zmírnění stárnutí LEC bez nežádoucích vedlejších účinků. Předmětem této studie bylo posouzení molekulárně biologického základu pro senescenci LEC a mechanismu ochrany normálních LEC proti stárnutí. Naše výsledky odhalily, že inaktivace AMPK a poškození autofagie byly spojeny se stárnutím LEC a ARC. Dále jsme zjistili, že MET může chránit LEC před stárnutím a inhibovat zákal čočky aktivací AMPK a posílením autofagie.
Senescence je základní biologický proces doprovázený obecným poklesem funkce tkání. S prodlužující se délkou života se dysfunkce související s věkem, jako je ARC, stávají vážnými zdravotními
problémy [26]. Uvádí se, že stárnutí LEC se podílí na výskytu a rozvoji ARC [5]. Naše výsledky ukázaly, že LEC přirozeně stárnoucích myší byly plochého tvaru a uspořádané nerovnoměrně a hustota LEC se výrazně snížila (obr. 1c, d). Kromě toho byla exprese genů spojených se stárnutím (p21 a p53) upregulována v LEC přirozeně starých myší (obr. 1e, f, g). Naše výsledky naznačovaly, že stárnutí LEC bylo spojeno s výskytem a rozvojem ARC. Proto může být vyžadováno přesné pochopení molekulárních mechanismů, které jsou základem stárnutí LEC, aby poskytlo zdůvodnění pro nové léčebné strategie.
MET je celosvětově nejčastěji předepisovaným perorálním hypoglykemickým lékem pro diabetes 2. typu. Objevující se důkazy naznačují, že MET má příznivé účinky na zdraví kromě těch, které jsou spojeny se zlepšením glykémie [27]. Bylo potvrzeno, že mechanismy MET jsou důležité pro zacílení základních drah biologického stárnutí, jako je aktivace AMPK, augmentace autofagie, inhibice zánětu a antioxidační účinky [28]. U lidí se MET používá v klinické praxi již více než 60 let; má vysoký bezpečnostní profil a má jedinečnou pozici, aby mohl zasahovat do několika klíčových cest odpovědných za stárnutí a nemoci související s věkem. Účinky MET na ARC a regulační mechanismus těchto účinků však nebyly nikdy hlášeny. V důsledku toho v naší studii chronické podávání nízkých dávek MET u přirozeně starých myší zlepšilo průhlednost čočky (obr. 2a) a zmírnilo stárnutí LEC in vivo (obr. 2).
Je široce uznáváno, že MET aktivuje dráhu AMPK, která je potenciálním mechanismem MET k uplatnění účinku proti stárnutí [29]. AMPK, buněčný energetický senzor, hraje klíčovou roli v regulaci buněčné energetické rovnováhy [30]. Několik studií ukázalo, že AMPK slouží jako integrátor a zprostředkovatel několika cest a procesů spojujících energetiku s dlouhověkostí. V naší studii jsme zjistili, že inaktivace AMPK byla rysem senescentních LEC u přirozeně starých myší (obr. 3). Následně se ukázalo, že MET stimuluje dráhu AMPK, aby se zabránilo stárnutí LEC (obr. 3). Jako zavedený aktivátor AMPK je role MET v prevenci stárnutí obecně připisována jeho účinkům na modulaci downstream signálních drah, jako je obnovení autofagie, aktivace Sirt1 a Foxo1 a suprese mTOR [31,32]. Naše studie poskytla novou řadu důkazů zdůrazňující důležitost funkce AMPK aktivované MET při prevenci výskytu ARC.
Jak již bylo zmíněno výše, AMPK komunikuje s řadou drah a proteinů, aby vykázala účinek proti stárnutí, včetně augmentace autofagie. Autofagie, která se objevuje jako klíčový proces pro zajištění dlouhověkosti, přitahuje široký zájem jako potenciální terapeutický cíl pro nemoci související s věkem. Autofagie je tekutý, vícestupňový komplexní biologický proces. Kompletní proces autofagie se nazývá autofagický tok, který se široce používá k vyjádření úrovně autofagie. Jako indikátor autofagie je LC3-Il pevně vázán na autofagozomální membránu, která je degradována lysozomálními enzymy.cistanche prodloužení životnostiPodobně p62, autofagy-specifický substrát, je obvykle degradován v autofagolysozomu a jeho exprese nepřímo odráží úroveň autofagie. V této studii naše zjištění naznačovala, že úroveň autofagie výrazně poklesla u senescentních LEC (obr. 4), zatímco MET zvrátila věkem podmíněné poškození autofagie (obr. 4). Molekulární mechanismus proti stárnutí MET je připisován primární funkci AMPK v buňkách, protože obecně zvyšuje autofagii prostřednictvím aktivace AMPK [33]. Navíc se ukázalo, že MET přímo zvyšuje autofagii, čímž přispívá k prevenci stárnutí [34]. K objasnění základních mechanismů jsou však zapotřebí podrobnější studie, které dokazují, že MET zvyšuje autofagii prostřednictvím nezávislé nebo závislé dráhy AMPK.
Bylo prokázáno, že prevalence ARC nebyla spojena se sexem v populacích asijského původu [35, 36]. Proto jsme nepovažovali sex za faktor, který může ovlivnit ARC. Naše studie by měla být interpretována s ohledem na výše uvedená omezení.
ZÁVĚR
V souhrnu jsme dokázali, že inaktivace dráhy AMPK a poškození autofagie související s věkem může přispět k senescenci LEC a výskytu ARC. Data z našich experimentů navíc odhalila, že MET účinně oddaluje stárnutí LEC a tvorbu ARC prostřednictvím aktivace dráhy AMPK a augmentace autofagie. Naše poznatky jsou základní linií pro další zkoumání molekulárních mechanismů, které jsou užitečné v roli MET během procesu stárnutí ARC a budou informativní pro intenzivnější studie o vývoji nových strategií proti výskytu a rozvoji ARC.
MATERIÁLY A METODY Reagencie
MET byl zakoupen od Bristol-Myers Squibb Company (Čína). Protilátky proti p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforylované AMPKa (p-AMPK) (Thr172) (ab133448), AMPKal (ab32047), -aktinu (ab82) SQSTM1/p62 (3340-1) byly získány od společnosti Abcam (MA, USA). Protilátky proti LC3 (12741) a fosfo-acetyl CoA karboxyláze (p-ACC) (Ser79) (3661) byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology ( MA, USA).
Zvířata a léčba
Samci myší C57BL6J, kteří byli 3 a 8 měsíců staří, byli zakoupeni od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Peking, Čína). Myši byly umístěny v podmínkách s řízenou teplotou (teplota, 20-25 stupeň a relativní vlhkost, 55±15 procent) s 12hodinovým cyklem světlo/tma, s volným přístupem k potravě a vodě. Všechny postupy a protokoly prováděné na zvířatech byly schváleny etickou komisí Harbin Medical University.
Myši byly rozděleny do následujících tří skupin: (i) kontrolní skupina s mladými myšmi (3 měsíce staré, tělesná hmotnost=29,72± 1,66 g, n =40), které dostávaly standardní purifikovanou myší stravu a vodu podle libosti; Když byly myši staré 10 měsíc, 120 myší bylo náhodně rozděleno do dvou skupin: přirozeně stará skupina a skupina MET. (i) přirozeně stará skupina (starší myši, 20 měsíců, tělesná hmotnost=32.98±1,93g, n=60) dostávala standardní purifikovanou myší dietu a vodu ad libitum;(ii)skupina MET ( 20 měsíců staré, tělesná hmotnost=31,21±2,81 g,n{19}}) byla udržována na standardní purifikované myší stravě a vodě, dokud myši nedosáhly věku 10 měsíců; poté byla zahájena léčba. Myši ve skupině MET byly krmeny stravou doplněnou 0,1 procenta MET (Bristol Myers Squibb, Čína) a volně vodou po dobu 10 měsíců.
izolace čoček a pouzder čoček
Myši byly usmrceny cervikální dislokací. Celé oko bylo okamžitě vyříznuto ze všech experimentálních zvířat a umístěno do sterilního fyziologického roztoku. Oční nerv byl umístěn nahoru a fixován pinzetou. Poté byl proveden řez na zrakovém nervu, který vstupuje do oka, a skléra byla stažena zpět, aby se čočka odhalila.cistanche nzNásledně jsme pomocí pinzety jemně odstranili úlomky řasnatého tělíska připevněné k ekvatoriální rovině čočky. Okamžitě byly pořízeny fotografie čerstvé čočky a čočka byla rychle fixována 4% paraformaldehydem při pokojové teplotě. Celé pouzdro čočky bylo rychle odloupnuto od zbývající čočky, zmraženo v kapalném dusíku a uskladněno při 80 °C pro následující experimenty.
Hematoxylin a eosin (H&E)
Čerstvá čočka byla okamžitě fixována 4% paraformaldehydem při teplotě místnosti a uložena do parafínu. Pro histologické vyšetření byly tkáně nařezány na 4-μm řezy. Po deparafinizaci a rehydrataci byly připravené parafinové řezy barveny roztokem hematoxylinu (H) po dobu 8 minut, následovalo 5 ponoření do 1% kyselého ethanolu (1% HC1 v 70% ethanolu).
a opláchnutí destilovanou vodou. Následně byly řezy barveny roztokem eosinu (E) po dobu 3 minut, následovala dehydratace odstupňovaným alkoholem a vyčeření xylenem. Morfologické změny byly pozorovány pod mikroskopem (Nikon, Eclipse, Japonsko).
Test galaktozidázy asociované se stárnutím (SA- -Gal) Aktivita galaktozidázy asociované se stárnutím (SA- -Gal) byla měřena pomocí soupravy pro barvení SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Podle pokynů výrobce byly tkáňové řezy po sérii ošetření promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) po dobu 5 minut (třikrát) a poté inkubovány v roztoku pro barvení SA- -gal (pH 6,0) při 37 stupňů bez CO2 po dobu 24 hodin. Snímky byly pořízeny pod světelným mikroskopem (Nikon, Eclipse, Japonsko). Procento SA- -gal-pozitivních buněk bylo odhadnuto jako průměrný počet pozitivních buněk/průměrný počet celkových buněk.
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (gRT-PCR) Celková RNA z pouzdra čočky myší byla extrahována pomocí činidla TRlzol. Reverzní transkripce byla provedena pomocí ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Analýza kvantitativní reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce (qRT-PCR) byla provedena pomocí SYBR Green Supermix
kit (Takara, Tokio, Japonsko), s -aktinem jako endogenní kontrolou. Transkripce byly zkoumány pro několik cílových genů, včetně FAS (dopředný, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'a reverzní, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (dopředný,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{{ 10}} a zpět,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') a -aktin (dopředu, 5'-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'a zpětně,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Relativní úrovně exprese každého genu byly
metoda. normalizováno na -aktin a vypočteno pomocí 2-△△ct r Imunohistochemického (IHC) barvení Pro imunohistochemickou (IHC) analýzu bylo použito celkem 5 reprezentativních řezů z každé z 10 vybraných čoček na skupinu pro hodnocení exprese p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 a p62. Poté, co byly připravené vzorky inkubovány při 60 stupních po dobu 2 hodin, prošly xylenovou a stupňovanou alkoholovou sérií pro deparafinizaci. Následně byly vzorky vařeny v 0,1 M kyselině citrónové (pH 6,1) po dobu 30 minut a ochlazeny na teplotu místnosti. Po trojnásobném promytí PBS byly vzorky napuštěny 0,3 % H20, aby se inhibovala aktivita endogenní peroxidázy. Následně byly přidány primární protilátky a ochlazeny na 4 °C přes noc. Odpovídající sekundární protilátky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C. Po promytí PBS byly vzorky inkubovány v diaminobenzidinu (DAB), dokud se nevyvinula požadovaná intenzita zbarvení. Obrazy imunobarvených buněk byly zachyceny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japonsko).
Western blot analýza
Celkový protein z kapslí čoček myší byl extrahován pomocí radioimunoprecipitačního pufru (RIPA) s koktejlem inhibitorů proteázy (Pierce, USA) a ke kvantifikaci koncentrace proteinu byla použita souprava kyseliny bicinchonové (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA). . Celkový protein (40 ug) byl analyzován pomocí elektroforézy na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu sodného (SDS-PAGE) a elektroforeticky přenesen na membrány polyvinylidendifluoridového filtru (PVDF) (Millipore, Německo). Membrány byly inkubovány přes noc s primární protilátkou při 4 °C. Následující den byly membrány inkubovány s odpovídajícími sekundárními protilátkami po dobu 1 hodiny při 37 °C. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány za použití chemiluminiscenční substrátové metody se Super Signal West Pico kit (Pierce Biotechnology, USA). Byly provedeny tři nezávislé experimenty.
Statistická analýza
Data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism 7.0 a Microsoft Excel. Protein byl kvantifikován pomocí softwaru Image J. K výpočtu statistické významnosti experimentálních dat byly použity Studentův t-test a analýza rozptylu (ANOVA). Rozdíly s P-hodnotou<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">
DOSTUPNOST DAT
Soubory dat použité a analyzované během aktuální studie jsou zahrnuty v tomto publikovaném článku.
Tento článek je převzat z www.nature.com/cddiscovery