Mechanistická studie nápoje Xian Fang Huo Ming na bázi cistanche při léčbě chronické prostatitidy: farmakologie integrované sítě a experimentální validace zaměření na cestu PI3K/Akt/NF-κB
Oct 27, 2025
2. Metody
2.1 Farmakologie sítě a analýza molekulárního dokování
2.1.1 Identifikace aktivních složek a cílů onemocnění
Pomocí databáze TCMSP byly aktivní sloučeniny v nápoji Xian Fang Huo Ming Drink (XFHY) založeném na Cistanche testovány podle kritérií ADME: orální biologická dostupnost (OB) větší nebo rovna 30 % a podobnost s léčivem (DL) větší nebo rovna 0,18. Potenciální cíle těchto sloučenin byly identifikovány pomocí SwissTargetPrediction (pravděpodobnost větší nebo rovna 0,1). Síť „bylina – sloučenina – cíl“ byla vytvořena pomocí Cytoscape 3.9.1 a pět nejlepších sloučenin bylo identifikováno na základě stupně centrality. Současně byly z GeneCards, OMIM a DisGeNET shromážděny cíle onemocnění související s CP/CPPS pomocí klíčových slov jako „chronická prostatitida“ a „prostatitida“.
Doplňky extraktu z cistanche pro zdraví prostaty a ledvin PhGs75% Ech 30% Act 12%
2.1.2 Identifikace cílů křižovatky
Průsečík mezi cílovými sloučeninami XFHY a cíli onemocnění CP/CPPS byl určen pomocí softwaru Venny 2.1 pro vytvoření Vennova diagramu, který identifikuje klíčové potenciální terapeutické cíle.
2.1.3 Výstavba sítě PPI
Průnikové cíle byly importovány do databáze STRING (druh: Homo sapiens; interakční skóre > 0,9). Výsledná síť interakce protein-protein (PPI) byla importována do Cytoscape a hlavní cíle byly identifikovány pomocí CytoHubba na základě parametrů topologie sítě, jako je stupeň, mezilehlost a blízkost.
2.1.4 Vybudování sítě „Bylina – Směs – Cíl – Cesta“.
Pomocí Cytoscape 3.9.1 byl vytvořen síťový model pro vizualizaci vztahu mezi XFHY, jeho aktivními sloučeninami, cíli a signálními cestami. Parametry sítě byly analyzovány pro určení klíčových uzlů.
2.1.5 Analýza obohacení GO a KEGG
Průnikové cíle byly nahrány do databáze DAVID pro analýzu obohacení dráhy genové ontologie (GO) a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (P < 0,05). Výsledky byly vizualizovány pomocí bioinformatických nástrojů.
2.1.6 Molekulární dokování
Prvních pět sloučenin (např. kvercetin, kaempferol) bylo použito jako ligandy a prvních deset hlavních cílů ze sítě PPI jako receptory. Proteinové struktury byly získány z Protein Data Bank (PDB), předzpracovány pomocí AutoDockTools 1.5.6 (včetně dehydratace, hydrogenace a přidání náboje) a převedeny do formátu PDBQT. Ligandové struktury ve formátu MOL2 byly získány z TCMSP a podobně převedeny. Molekulární dokování bylo provedeno pomocí AutoDock a vazebné afinity byly vizualizovány pomocí GraphPad Prism 8.
2.2 Pokus na zvířatech
2.2.1 Založení modelu
K modelování CP/CPPS byla použita metoda chemické indukce. Krysy byly anestetizovány 3% pentobarbitalem sodným (50 mg/kg). Střední řez byl proveden v dolní části břicha a do každého laterálního laloku prostaty bylo injikováno 80 μl 3% λ-karagenanu (celkem 160 μl). Falešně operované krysy dostávaly injekce fyziologického roztoku. Pooperační péče zahrnovala lokální aplikaci antibiotik. Sedmý den byl úspěch modelování potvrzen makroskopickým a histologickým vyšetřením prostaty (edém, kongesce, epiteliální degenerace a zánětlivá infiltrace).
2.2.2 Seskupování a léčba
Sedmdesát samců potkanů SD bylo náhodně rozděleno do sedmi skupin (n=10):
Normální ovládání
Falešná operace
Ovládání modelu
Skupiny s nízkou, střední a vysokou dávkou XFHY
Tamsulosinová skupina
Dávky byly vypočteny na základě ekvivalentní dávky pro člověka (7,29 g/kg/den). XFHY byl podáván orální sondou v 0,3645 g/ml (nízká) a 1,458 g/ml (vysoká). Tamsulosin byl podáván v dávce 0,0018 mg/kg. Všechna ošetření trvala 28 dní, počínaje 8 dny po modelaci.
2.2.3 Histopatologické hodnocení
Levé laloky prostaty byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, zality v parafínu, nařezány a obarveny hematoxylinem-eosinem. Histologické změny byly hodnoceny pod světelnou mikroskopií.
2.2.4 ELISA pro zánětlivé markery
Krev odebraná z břišní aorty byla odstředěna a sérové hladiny TNF-, IL-1 a COX-2 byly měřeny pomocí souprav ELISA podle pokynů výrobce.
2.2.5 qRT-PCR pro genovou expresi
Celková RNA byla extrahována z tkáně prostaty a reverzně transkribována do cDNA. PCR v reálném čase byla prováděna s použitím specifických primerů pro PI3K, Akt a NF-KB p65. GAPDH byl použit jako vnitřní kontrola. Relativní exprese byla vypočtena pomocí metody 2^-AACt.
2.2.6 Western blot pro expresi proteinu
Protein byl extrahován ze zmrazené tkáně prostaty pomocí RIPA pufru. Po kvantifikaci byly proteiny separovány pomocí SDS-PAGE, přeneseny na PVDF membrány a sondovány primárními protilátkami proti PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt (Ser473/Thr308), NF-KB p65 a p-NF-KB p65. Byly použity sekundární protilátky konjugované s HRP a detekce ECL. Intenzity pásů byly kvantifikovány pomocí ImageJ.
2.2.7 Statistická analýza
Všechny experimenty byly provedeny trojmo. Data byla analyzována pomocí GraphPad Prism 8 a vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka. Pro srovnání více skupin byla použita jednocestná ANOVA následovaná LSD nebo Dunnettovým testem. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.
3. Výsledky
3.1 Farmakologie sítě a molekulární dokování
Průsečík složený – cíl:912 složených cílů a 2 197 chorobných cílů poskytlo 374 překrývajících se cílů.
Nejlepší identifikované sloučeniny:Kvercetin, kaempferol, pelargonidin, naringenin a byakangelikol – všechny se známými protizánětlivými a antioxidačními účinky.
Analýza PPI:Mezi klíčové cíle patřily TP53, AKT1, EGFR, TNF, IL6, STAT3, BCL2, CASP3, CCND1 a NFKB1.
Obohacení GO a KEGG:Obohacené dráhy zahrnovaly PI3K/Akt, MAPK, RAS a biologické procesy související se zánětem.
Molekulární dokování:Mezi hlavními cíli a hlavními sloučeninami byly pozorovány silné vazebné afinity (vazebná energie menší nebo rovna -5,0 kcal/mol), což naznačuje vysokou biologickou aktivitu.
3.2 Experimentální ověření
3.2.1 Barvení HE
Modelová skupina potkanů vykazovala degeneraci žlázového epitelu, stromální edém a rozsáhlou zánětlivou infiltraci. Skupiny léčené XFHY vykazovaly snížený zánět, zejména ve skupinách se střední a vysokou dávkou.
3.2.2 Úrovně zánětlivých markerů
Ve srovnání s modelovou skupinou XFHY významně snížila hladiny TNF-, IL-1 a COX-2 v séru (P < 0,01), což ukazuje na protizánětlivou účinnost.
3.2.3 Genová exprese (qPCR)
XFHY významně snížila hladiny mRNA PI3K, Akt a NF-KB p65 způsobem závislým na dávce. Nízká dávka snížená pouze Akt a p65; skupiny se střední a vysokou dávkou vykazovaly širší supresi.
3.2.4 Proteinová exprese (Western Blot)
Hladiny fosforylace PI3K, Akt (Ser473, Thr308) a NF-KB p65 byly významně zvýšeny v modelové skupině a sníženy u potkanů ošetřených XFHY, zejména při středních a vysokých dávkách.
4. Diskuse
Na základě klinických zkušeností to tato studie potvrzujeXFHY na bázi Cistanchemá výrazný protizánětlivý účinek na CP/CPPS. Síťová farmakologie identifikovala zejména klíčové aktivní sloučeninykvercetins prokázanými protizánětlivými a antioxidačními vlastnostmi. Analýza PPI zvýraznila cíle jako napřTNF, IL6aAKT1, které jsou ústřední pro zánět při prostatitidě.
Analýza KEGG naznačila zapojeníPI3K/Akt/NF-KBsignální dráha široce uznávaná při zánětu a imunitní regulaci. XFHY může vykazovat terapeutické účinky inhibicí této dráhy, a tak snížit expresi prozánětlivých cytokinů.
Dále se zdá, že duální fosforylace Akt (Ser473 a Thr308) je kritická pro aktivaci NF-KB. XFHY inhiboval fosforylaci na obou místech, což naznačuje inhibici signalizace NF-KB prostřednictvím upstream suprese Akt.
Závěr
XFHY může zmírnit CP/CPPS blokováním dráhy PI3K/Akt/NF-κB, snížením expreseIL-1, TNF-aCOX-2a zmírnění zánětlivých reakcí v tkáni prostaty. Zapojení dráhy, zejména fosforylace Akt na Ser473 a Thr308, poskytuje potenciální mechanické vysvětlení účinnosti XFHY. Další výzkum je oprávněn potvrdit, zda PI3K/Akt/NF-KB je definitivní cestou, kterou XFHY uplatňuje svůj terapeutický účinek.
Střet zájmů:
Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Dejte mi vědět, pokud chcetegrafický abstrakt, souhrnná tabulkaneboPowerPointová prezentacena základě této studie!
