Longitudinální imunitní profilování odhaluje dominantní epitopy zprostředkovávající dlouhodobou humorální imunitu u jedinců v rekonvalescenci COVID-19
Sep 12, 2023
Pozadí: Koronavirus 2 těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoV-2) je vysoce patogenní a nakažlivý koronavirus, který způsobil celosvětovou pandemii s 5,2 miliony úmrtí. Zbývá objasnit otázky týkající se sérologických rysů dlouhodobé imunity, zejména dominantních epitopů zprostředkujících trvalé protilátkové odpovědi po infekci SARS-CoV-2.
Objektivní: Naším cílem bylo rozebrat kinetiku a dlouhověkost imunitních odpovědí u pacientů s koronavirovým onemocněním 2019 (COVID-19) a také epitopy odpovědné za trvalou dlouhodobou humorální imunitu proti SARS-CoV-2.
Metody: Hodnotili jsme imunitní dynamiku SARS-CoV-2 do 180 až 220 dnů po nástupu onemocnění u 31 jedinců, kteří převážně pociťovali středně závažné příznaky COVID-19, a poté provedli celoproteomové profilování dominantních epitopů odpovědných za přetrvávající humorální imunitní reakce.
Výsledek: Podélná analýza odhalila u pacientů s COVID-19 trvalé protilátky specifické pro protein SARS-CoV-2 a neutralizující protilátky spolu s aktivací produkce cytokinů v časných stádiích po infekci SARS-CoV-2. Bylo ukázáno, že vysoce reaktivní epitopy, které byly schopné zprostředkovat dlouhodobé protilátkové odpovědi, se nacházejí na špičce a proteinech ORF1ab. Klíčové epitopy spike proteinu SARS-CoV-2 byly mapovány do N-terminální domény podjednotky S1 a podjednotky S2, s různým stupněm sekvenční homologie mezi endemickými lidskými koronaviry a vysokou sekvenční identitou mezi ranými SARS- CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) a aktuální cirkulující varianty.
Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém
Závěr: Infekce SARS-CoV-2 indukuje perzistentní humorální imunitu u pacientů v rekonvalescenci COVID-19 tím, že se zaměřuje na dominantní epitopy umístěné na hrotu a proteinech ORF1ab, které zprostředkovávají dlouhodobé imunitní reakce. Naše zjištění poskytují cestu k podpoře racionálního návrhu vakcín a diagnostického vývoje. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)
Klíčová slova:
SARS-CoV-2, COVID-19, dlouhodobá imunitní odpověď, humorální imunita, proteomový peptidový mikročip, dominantní epitop
Těžký akutní respirační syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), původce probíhající pandemie koronavirového onemocnění 2019 (COVID-19), patří do rodu Betacoronavirus, který zahrnuje 2 další známé vysoce patogenní lidské koronaviry: koronaviry těžkého akutního respiračního syndromu (SARS) a respiračního syndromu na Středním východě (MERS).1 Od vypuknutí prvního zaznamenaného případu na konci prosince 2019 vedla infekce SARS-CoV-2 k více než 263 milionům potvrzených případů a 5,2 milionu úmrtí na celém světě k listopadu 2021, což postihlo 220 zemí a regionů na 5 kontinentech.2 Po infekci se klinické projevy velmi liší, včetně asymptomatických infekcí, mírných nebo středně závažných příznaků nebo dokonce život ohrožující těžké pneumonie.3 Vzhledem k dostupnosti různých typů očkovacích přístupů se mnoho zemí stále snaží udržet nové vlny infekcí, přičemž se objevují varianty virů, které, jak se zdá, vykazují zvýšenou přenositelnost a odolnost vůči antivirovým imunitním reakcím. Účinná humorální imunitní odpověď zprostředkovaná neutralizačními protilátkami by měla mít silnou a nepostradatelnou adaptivní imunitu k blokování infekce a eliminaci virových patogenů. Po infekci SARS-CoV-2 byla mezi infikovanými jedinci pozorována vysoká míra (nad 90 %) silné sérokonverze 7 až 14 dní po začátku onemocnění.{24}} Produkce antigenně specifických IgA, IgG, a IgM rozpoznávající spike protein (S) a nukleokapsidový protein (N) SARS-CoV-2 byl detekovatelný během akutní fáze onemocnění a raného stádia rekonvalescence.4,5,7 Zdá se, že velikost neutralizujících protilátek být spojeno s věkem, symptomatickou infekcí a závažností onemocnění. Starší pacienti a jedinci s vážnými příznaky COVID{30}} mají tendenci vyvinout vyšší hladiny neutralizačních protilátek.4,8-10 Několik studií týkajících se dlouhověkosti protilátkových odpovědí odhalilo, že navzdory ztrátě reaktivity séra/plazmy na virus antigenů a klesajících titrů neutralizačních protilátek v průběhu času u některých symptomatických případů COVID-19 byla u pacientů v rekonvalescenci COVID-19 pozorována trvalá úroveň celkové dlouhodobé humorální imunity po dobu až 8 až 12 měsíců po infekci .10-13 Kromě toho počet SARS-CoV-2 antigen-specifických paměťových B buněk zůstal stabilní po dobu alespoň 6 až 12 měsíců,12,13 spolu s pokračující selekcí a akumulací B-buněčných klonů exprimujících neutralizační protilátky,12,14 indikující udržení přetrvávající humorální imunity po infekci SARSCoV-2.
cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu
Neutralizační protilátky hrají zásadní roli v obraně hostitele proti virové infekci. Byl identifikován panel vysoce účinných monoklonálních protilátek SARS-CoV-2,15-17 primárně zacílených na epitopy umístěné na receptorové vazebné doméně proteinu S, který se skládá do trimerů na povrchu virionu a usnadňuje vstup viru a fúze při zapojení receptoru angiotenzin konvertujícího enzymu 2.18 Jiné oblasti proteinu S, včetně N-terminální domény (NTD) podjednotky S1 a podjednotky S2, také obsahují imunogenní epitopy, které jsou schopné indukovat neutralizační protilátky.16 ,19,20 Kromě neutralizace mohou protilátky SARS-CoV-2 poskytovat ochranu in vivo prostřednictvím efektorových funkcí zprostředkovaných Fc, jako je fagocytóza závislá na protilátkách spouštěná přirozenými zabíječskými buňkami a cytotoxicita závislá na protilátkách monocyty nebo makrofágy. 21,22 Kromě boje s virovými infekcemi mohou protilátky generované přirozenou infekcí nebo vakcinací usnadnit patogenezi viru, buď zvýšenou aktivací zánětu, nebo zvýšenou infekčností viru prostřednictvím tvorby imunitního komplexu antigen/protilátka nebo funkcemi závislými na Fc,23-25 ačkoli zesílená virová infekce nebyla pozorována v kontextu SARS-CoV-2 in vivo. Tyto odlišné role protilátkových odpovědí vyžadují systematickou charakterizaci SARSCoV-2 epitopů, stejně jako vlastnosti dlouhotrvajících protilátek zacílených na neutralizační nebo neneutralizující epitopy. Navzdory nedávnému pokroku v kinetice a trvání protilátkových odpovědí po infekci SARS-CoV-2 je longitudinální analýza týkající se prominentních epitopů, které udržují dlouhodobé humorální imunitní odpovědi, stále omezená. Předchozí studie profilovaly epitopy protilátkové odpovědi u jedinců infikovaných COVID–19 především pomocí testů založených na ELISA,26,27 přístupech založených na fágovém nebo bakteriálním displeji28-31 a technologiích založených na mikročipu.30,{{ 38}} Bylo identifikováno několik imunodominantních epitopů SARS-CoV-2 S proteinu; nejčastěji detekované oblasti byly mapovány blízko nebo pokrývající fúzní peptid (FP) podjednotky S2, repetice druhé sedmičky v podjednotce S2 a na C-terminální doméně podjednotky S1.26,{46}}, 32,33 Kromě toho sérologický screening také odhalil epitopy umístěné na jiných proteinech napříč proteomem SARS-CoV-2, včetně N proteinu, membránového (M) proteinu a ORF1ab, ORF3a a ORF7a.28-30, 34,35 Přestože předchozí studie poskytly důležitý pohled na antigenní epitopy, tyto studie se z velké části zaměřily na profilování epitopů pacientů s COVID-19 v časné fázi rekonvalescence. Zbývá objasnit přesné epitopy zprostředkovávající trvalé odpovědi specifických protilátek SARS-CoV-2, jakož i dynamiku rozpoznávání epitopů. Abychom zde získali hlubší pochopení kinetiky a dlouhověkosti humorálních imunitních odpovědí u pacientů s COVID{60}}, zejména epitopů odpovědných za trvalou dlouhodobou imunitu proti SARS-CoV-2, provedli jsme komplexní longitudinální analýzu imunitního profilování u 31 pacientů s COVID{65}} do 180 až 220 dnů po nástupu příznaků. Na základě vyhodnocení antigen-vazebných a neutralizačních protilátek a také hladin sérových cytokinů jsme dále identifikovali panel epitopů umístěných v proteinech ORF1ab, S a N SARSCoV-2, které zprostředkovávají perzistentní humorální imunitní reakce pomocí peptidu microarray zahrnující kompletní proteom SARS-CoV-2. Naše výsledky vrhají světlo na rysy dlouhodobé imunity k překonání virové infekce a pomohou informovat o racionálním návrhu vakcíny a vývoji vylepšených sérologických diagnostických nástrojů.
METODY
Účastníci studie a kolekce vzorků
K dlouhodobému vyhodnocení kinetiky imunitních odpovědí řízených SARS-CoV-2 bylo odebráno 101 vzorků séra od 31 jedinců infikovaných SARS-CoV-2, kteří byli přijati do třetí nemocnice v Nantongu přidružené k univerzitě Nantong (Nantong , Čína) mezi lednem a březnem 2020. U všech pacientů byla diagnostikována potvrzená infekce SARS-CoV-2 pomocí kvantitativního PCR testování s reverzní transkripcí; závažnost onemocnění byla definována jako mírná až střední (nezávažná) nebo závažná COVID-19 podle verze 7 Diagnostického a léčebného protokolu pro nový koronavirový zápal plic vydaného Národní zdravotnickou komisí Čínské lidové republiky.36 Pacienti byli sledováni podélně po dobu 4 až 8 měsíců po zotavení z akutní infekce. Krevní vzorky byly odebírány podélným způsobem od 4 do 219 dnů po nástupu příznaků u 20 pacientů z 31 účastníků studie (medián 4,5 vzorků na jednotlivce, v rozmezí od 2 do 8), přičemž odběr vzorků byl proveden v jednom časovém bodě pro každý z nich. dalších 11 jedinců, kteří byli v pozdní fázi rekonvalescence onemocnění (122. až 214. den po začátku onemocnění). V souladu s tím byla jako kontrolní skupina zahrnuta také séra (n 5 20) od zdravých dárců stejného věku a pohlaví. Žádný účastník studie neměl zdokumentovanou předchozí infekci SARS nebo MERS.
Studie byla schválena etickou komisí třetí nemocnice Nantong přidružené k univerzitě Nantong (schválení EL2020006). Od každého z účastníků studie byl získán písemný informovaný souhlas. Sérum bylo odděleno od periferní krve ve zkumavkách se sérovým gelem pomocí centrifugace, formováno do alikvotů a před použitím skladováno při 280 °C.
Buněčné linie
Buňky HEK293T a Huh7 byly kultivovány v Dulbeccom modifikovaném Eagle médiu (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (Gibco), 100 U/ml penicilinu (Gibco) a 100 mg/ ml streptomycinu (Gibco) při 378 °C s 5 % CO2.
cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Detekce IgG protilátky pomocí ELISA
Hladiny IgG protilátek vázajících antigen ve vzorcích lidského séra byly stanoveny pomocí ELISA. Devadesát šest jamek ELISA destiček (Corning, Corning, NY) bylo předem potaženo nukleokapsidovým proteinem SARS-CoV-2 (Sino Biological, Peking, Čína, katalogové č. 40588-V08B , 50 ng na jamku) nebo spike protein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng na jamku), SARS-CoV spike protein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng na jamku jamka), nebo MERS-CoV spike protein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng na jamku) přes noc při 48 °C. Po blokování 5% odtučněným mlékem ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBS-T) po dobu 2 hodin při 378 °C 3-složte sériově zředěné tepelně inaktivované vzorky séra při výchozím ředění 1 :200 bylo přidáno do předem potažených destiček na 2 hodiny při 378 °C. Jamky byly promyty 3x mezi každým krokem PBS-T. Reakce byly vizualizovány inkubací s anti-lidskou IgG protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Abcam, Cambridge, Spojené království, 1:100, 000 ředění) po dobu 1 hodiny při 378 °C, s následným přidáním substrátu tetramethylbenzidinu (Life Technologies, Carlsbad , Kalifornie). Vyvíjecí reakce byly zastaveny 2 mol H2SO4 a absorbance byla měřena při 450 nm s korekční vlnovou délkou nastavenou na 630 nm (OD450 2OD630). Pro výpočet koncového titru vazebných protilátek byla data linearizována vynesením log10 ředění séra proti korigovaným hodnotám optické hustoty (OD) (OD450 2 OD630) v lineární části křivky (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99) a ředění séra, při kterém byla vypočtena upravená hodnota OD (OD450 2 OD630) 5 0, aby se získal koncový titr. Antigen-specifické IgG protilátky u myší imunizovaných peptidem byly hodnoceny ELISA na bázi peptidů. Stručně, 96-jamkové ELISA destičky (Thermo Fisher Scientific) byly potaženy 1 mg na jamku 4 směsnými peptidy (peptidy 318, 356, 510 a 530) v uhličitanovém pufru (pH 9,6) přes noc při 48 °C. Po blokování PBS-T obsahujícím 5 % odtučněného mléka byly jamky inkubovány se vzorky séra zředěnými v poměru 1:40 po dobu 1 hodiny při 378 °C. Následně byly destičky promyty a inkubovány s anti-myší IgG protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Abcam). Reakce byly vizualizovány tetramethylbenzidinovým substrátem (Life Technologies) a absorbance při 450 nm byla měřena po zastavení reakcí s 2 mol H2SO4.
Produkce a titrace pseudovirů
Kodonově optimalizovaný gen kódující SARS-CoV-2 (NC_045512) nebo SARS-CoV (AY291315.1) spike protein s C-koncovou delecí 19 aa nebo MERS-CoV (JX{{10 }}) spike protein zkrácený s C-koncovými 16 aa byl klonován do vektoru pcDNA3.1(1), v daném pořadí. Buňky HEK 293T kultivované ve 100 mm tkáňové kultivační misce byly kotransfekovány 1 mg plazmidu kódujícího spike protein a 15 mg env-deficientní páteře exprimující luciferázu (pNL4-3.luc.RE) za použití polyethyleniminu (Polysciences , Warrington, Pensylvánie). Supernatanty buněčné kultury obsahující pseudovirus byly shromážděny 48 hodin po transfekci, přefiltrovány a skladovány při 280 °C v alikvotech. Pro stanovení virových titrů (50% infekční dávka pro tkáňové kultury) byla k 1 3 104 buňkám Huh7 předem nasazeným na 96-jamkové destičky přidána sériová ředění pseudovirů. Po 12 hodinách infekce bylo médium obsahující virus nahrazeno čerstvým růstovým médiem a buňky byly kultivovány dalších 48 hodin. Luciferázová aktivita buněčné lýzy byla měřena pomocí Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wisc) za použití čtečky mikrodestiček (BioTek Instruments, Winooski, Vt) a byly uvažovány jamky produkující relativní jednotky luminiscence vyšší než 10násobek průměrné hodnoty pozadí. pozitivní.
Pseudovirus neutralizační test
Tepelně inaktivované vzorky séra od pacientů s COVID-19 nebo zdravých dárců byly 2-násobně sériově naředěny a inkubovány se 200 pseudoviry při 50% infekční dávce pro tkáňové kultury po dobu 1 hodiny při 378 °C. Směsi byly poté aplikovány k infikování buněk Huh7 předem naočkovaných v 96-jamkových destičkách v duplikátech. Jamky byly doplněny čerstvým růstovým médiem 12 hodin po infekci a luciferázová aktivita buněk byla stanovena o 48 hodin později. 50% neutralizační titry (NT50) proti SARS-CoV-2 a pseudovirům SARS-CoV byly vypočteny nelineární regresí pomocí softwaru GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornie); a NT50 pseudoviru MERS-CoV bylo definováno jako nejvyšší ředění séra, které vedlo k 50% snížení relativních jednotek luminiscence ve srovnání s virovou kontrolou bez aplikace vzorků séra.
Detekce cytokinů na bázi proteinových mikročipů
Kvantitativní měření více cytokinů (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g a TNF-a) ve vzorcích séra byla provedena pomocí multiplexního pole ELISA (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) podle protokolu výrobce. Stručně, sklíčka předem potažená cytokinově specifickými protilátkami byla blokována ředidlem vzorků při pokojové teplotě po dobu 30 minut, poté bylo přidáno 60 ml 2-násobně zředěných vzorků séra nebo standardních ředění cytokinů. Po inkubaci přes noc při 48 °C byla sklíčka 5krát promyta a obarvena 80 ml koktejlu biotinylované detekční protilátky a poté streptavidinu ekvivalentního s barvivem konjugovaného s Cy3 při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Intenzita fluorescence byla detekována skenerem InnoScan 300 microarray (Innopsys, Chicago, IL) při 532 nm a data byla analyzována softwarem Q-Analyzer (RayBiotech).
Syntéza a konjugace peptidů s hovězím sérovým albuminem
Celkem 515 peptidů (délka 15 aa, překrývající se o 11 aa), které pokrývají proteom SARS-CoV-2, bylo syntetizováno společností GL Biochem (Shanghai, Čína) na základě aminokyselinové sekvence SARS-CoV -2 kmen Wuhan-Hu-1. Peptidy byly konjugovány s hovězím sérovým albuminem (BSA) za použití zesíťovacího činidla Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Stručně, Sulfo-SMCC byl přidán v 30-násobném molárním přebytku k BSA, následovala dialýza do PBS. Následně byl přidán peptid obsahující cystein v poměru 1:1 (hmotn./hmotn.), inkubován po dobu 2 hodin a dále dialyzován pomocí PBS, aby se odstranily volné peptidy.
Výroba peptidových mikročipů
K přípravě peptidového mikročipu se používají peptidy SARS-CoV-2, stejně jako negativní kontrola (BSA) a pozitivní kontroly (protilátky proti lidskému IgG a protilátky proti lidskému IgM; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , byly imobilizovány na podložních sklíčkách PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) v triplikátech za použití tiskárny Super Marathon (Arrayjet, Edinburgh, Skotsko, Spojené království). Poté byly peptidové mikročipy uchovány při 2808C pro další použití.
cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému
Mapování epitopů na bázi Microarray
Analýza séra založená na mikročipu byla provedena podle Li et al,37 s menšími úpravami. Aby se vytvořily jednotlivé komůrky pro identické podpole, 14-komorové pryžové těsnění bylo namontováno na každé podložní sklíčko peptidového mikročipu. Sklíčková pole byla před použitím zahřátá na teplotu místnosti, poté blokována 3% BSA v PBS-T po dobu 3 hodin. Vzorky séra od pacientů s COVID-19 nebo smíšená séra od 20 zdravých dárců (kontrolní skupina) byly u většiny vzorků zředěny v poměru 1:200 v PBS-T a poté inkubovány s každým dílčím polem po dobu 2 hodin při 48C. Čipy byly promyty PBS-T a inkubovány s Cy3-konjugovaným kozím anti-lidským IgG a Alexa Fluor 647 – konjugovaným oslím anti-lidským IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) v ředění 1:1000 každý po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po inkubaci byly čipy promyty PBS-T a poté zcela vysušeny centrifugací při teplotě místnosti. Následně byla pole naskenována pomocí mikročipového skeneru LuxScan 10K-A (CapitalBio, Peking, Čína) a data intenzity fluorescence FL byla získána a analyzována softwarem GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornie).
OBR. 1. Podélná dynamika protilátkových odpovědí u pacientů s COVID{1}}. Schéma návrhu studie. Do studie bylo zařazeno celkem 31 jedinců infikovaných SARS–CoV–2 a 20 zdravých dárců. Odběr vzorků séra byl prováděn podélně v několika časových bodech u 20 pacientů mezi 31 jednotlivci infikovanými SARS-CoV-2, zatímco odběr vzorků byl proveden v jednom časovém bodě u ostatních 11 pacientů. Je uveden počet účastníků a vzorky séra použité v různých testech. B a C, Celkem 101 vzorků séra od 31 pacientů s COVID-19 bylo testováno metodou ELISA na SARS-CoV-2 N protein (B) a S protein (C) vázající IgG protilátky v různých časových bodech po nástupu příznaků (dny 1-30, n 5 37; dny 31-61, n 5 18; dny 100-150, n 5 21; dny {{21 }}, n 5 25). Vzorky séra od 20 zdravých dárců byly zahrnuty jako kontrolní skupina. D, NT50 proti pseudovirům SARS-CoV-2 v průběhu času byla vypočtena nelineární regresí. E, Je uvedena distribuce sérové neutralizační aktivity u pacientů s COVID{27}} v uvedených časových bodech po nástupu onemocnění. Vzorky s titrem NT50 pod 20 byly definovány jako neneutralizující
Peptidová mikročipová analýza dat
Byla analyzována data IgG a IgM. Intenzita signálu každé skvrny byla definována jako popředí mínus pozadí a zprůměrována trojitá místa pro každý peptid. Hraniční hodnota pro pozitivní peptidovou odpověď vzorků COVID-19 byla nastavena jako dvojnásobek intenzity signálu kontroly zdravého dárce. Peptidy s pozitivními četnostmi nad 80 % mezi vzorky testovanými ve všech 3 časových bodech odběru vzorků (dny 10-60, 100-150 a 180-220 po nástupu onemocnění) byly definovány jako dominantní a perzistentní peptidy a peptidy s četnost pozitivní odezvy nad 60 % ve všech 3-časových bodech byla považována za subdominantní a přetrvávající. Byla vypočtena průměrná intenzita signálu každého peptidu ve 3 skupinách časového bodu vzorkování; byly také vybrány peptidy vykazující vysokou intenzitu signálu (nad průměrem 1 SD intenzit signálu všech testovaných vzorků). Zpracování a analýza dat byla provedena pomocí softwaru R v3.6.3 (https://www.r-project.org/) a významné změny intenzity signálu mezi různými skupinami časových bodů vzorkování byly vyhodnoceny na základě Limma. Rozdíly s P < 0,05 byly považovány za statisticky významné.
Očkování myší
Samice myší BALB/c ve věku 6 až 8 týdnů byly zakoupeny od Beijing Vitalstar Biotechnology (Peking, Čína). Všechny myši byly umístěny ve specifických zařízeních bez patogenů a studie na zvířatech byla schválena Institutional Animal Care and Use Committee of Tianjin Medical University (Tianjin, Čína). Pro imunizaci bylo skupinám myší (n 5 5) intramuskulárně injikováno 25 mg na dávku každého peptidu (peptidy 318, 356, 510 a 530 v tomto pořadí) smíchaných s 50 mg kamence (InvivoGen, San Diego, Kalifornie) a 10 mg CpG adjuvans, a posílena dvakrát 50 mg na dávku peptidů v přítomnosti adjuvans v 2-týdenních intervalech. Vakcinace samotnými adjuvans sloužila jako negativní kontrola. Séra byla odebrána od imunizovaných myší v den 10 nebo den 14 po druhé a třetí imunizaci.
Statistické a strukturální analýzy
Všechny grafy byly vyneseny pomocí GraphPad Prism. Statistická srovnání mezi skupinami na obr. 1, 2 a 4 byla provedena pomocí 1-způsobu ANOVA s Tukeyho vícenásobným srovnáním. Korelace zobrazené na obr. 1 obr. E9 a obr. E10 v online úložišti dostupném na www.jacionline.org byly stanoveny pomocí Pearsonovy korelační analýzy. Rozdíly s P < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Struktury spike proteinu SARS-CoV-2 (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX a PDB ID: 6ZGI) a dimerizační doména SARS-CoV{{ 13}} nukleokapsidový protein (PDB ID: 6YUN) byly použity k disekci strukturních detailů identifikovaných epitopů umístěných na spike proteinu a dimerizační doméně nukleokapsidového proteinu. Zarovnání sekvencí a analýza homologie mezi různými lidskými koronaviry byly provedeny pomocí algoritmu Clustal W v softwaru MEGA v10.1.6.
VÝSLEDEK
Infekce SARS-CoV-2 indukuje trvalé antigen-specifické vazby a neutralizační protilátky
K dlouhodobému posouzení protilátkových odpovědí po infekci SARS-CoV-2 bylo odebráno 101 vzorků séra od 31 jedinců s infekcí SARS-CoV-2 potvrzenou PCR (obr. 1, A). Účastníci studie zahrnovali 26 pacientů se středně závažným onemocněním COVID-19, 1 s asymptomatickým projevem, 2 s mírným onemocněním a 2 se závažnými příznaky (viz tabulka E1 v online úložišti dostupném na www.jacionline.org). Pacienti zařazení do této studie byli ve věku od 17 do 66 let (střední věk 45 let), s přibližně stejnou distribucí mužů (51,6 %) a žen (48,4 %). Mezi nejčastější příznaky mezi účastníky studie patřila horečka (83,9 %), kašel (67,7 %), myalgie (22,6 %) a zimnice (22,6 %), s mediánem trvání nemoci 15 dní. Celkem 90 vzorků séra od 20 pacientů s COVID{32}} bylo odebráno během hospitalizace a propuštění po zotavení v několika časových bodech až do 219 dnů po nástupu příznaků (obr. 1, A a tabulka E2 v online úložišti). Odběr vzorků od ostatních 11 účastníků byl proveden v jednom časovém bodě během pozdní rekonvalescence (dny 122 až 214 po nástupu příznaků). Kromě toho byly jako kontrolní skupina zahrnuty vzorky od 20 zdravých dárců s odpovídající distribucí podle věku a pohlaví (tabulka El). Antigen-specifické IgG protilátky ve vzorcích séra byly kvantifikovány metodou ELISA předem potaženou SARS-CoV-2 N proteinem nebo S proteinem. Ve srovnání se zdravými dárci se u pacientů s COVID-19 vyvinuly protilátky anti-N i anti-S IgG do 30 dnů po nástupu příznaků, s geometrickým průměrem koncového titru 4,10 (log10 anti-N IgG) a 4.20 (log10 anti-S IgG) (obr. 1, B a C; a viz tabulka E3 v online úložišti na www. jacionline.org; obr. E1, A a B; a obr. E2), v souladu s předchozími pozorováními, že sérokonverze dochází 1 až 2 týdny po infekci SARS-CoV-2.5,38 Poté titry protilátek vázající antigen v průběhu času v různé míře klesaly. Rychle a dramaticky klesající hladiny anti-N IgG protilátek byly pozorovány u pacientů s COVID-19, zatímco vyšší hladiny anti-S IgG titrů byly udržovány až 180 až 220 dnů po nástupu onemocnění ve srovnání se zdravými dárci (obr. 1, B a C). Korelační analýza odhalila významnou korelaci mezi log10 titry anti-N IgG a anti-S IgG titry (r 5 0 0,50 a P < 0,001; Obr. 1, F). Kromě kvantifikace vazebných protilátek byla dynamika funkčních neutralizačních protilátek u jedinců s COVID{80}} dále stanovena pomocí pseudotypizovaného SARS-CoV-2. Více než 95 % vzorků séra pacientů (35/37) odebraných mezi 4. a 30. dnem po nástupu příznaků mělo silné neutralizační aktivity proti SARS-CoV-2 a velká část vzorků vykazovala střední (NT50 80-320) ) na silnou (NT50 > 320) neutralizační aktivitu (obr. 1, D a E). Je třeba poznamenat, že 2 vzorky s žádnými nebo nízkými neutralizačními titry (NT50 při minimálním ředění séra 1:20) byly odebrány v časném období po virové infekci (v den 4 a den 11 po nástupu příznaků) před vyvoláním silných neutralizačních protilátek (obr. 1, D a obr. El, C). Navzdory klesajícím hladinám SARS-CoV{103}} neutralizujících protilátek u pacientů s COVID{104}} v průběhu času, většina vzorků séra pacientů (24/25) získaných během 180 až 220 dnů po nástupu příznaků udržela pozitivitu na neutralizaci vůči SARS- CoV-2, s 2,{112}}násobným poklesem geometrického průměru NT50 titrů (obr. 1, D a E; tabulka E3; obr. E3). Jak se očekávalo, ve srovnání s protilátkami anti-N IgG byla identifikována silnější korelace mezi titry IgG vázajícími SARS-CoV{119}} S a titry neutralizačních protilátek (r 5 0,61 a P < 0,001; Obr. 1 , G a H), což je v souladu se zjištěními, že protein SARS-CoV{125}} S je hlavním cílem neutralizujících protilátek. Protein S SARS-CoV-2 sdílí vysokou sekvenční podobnost s vysoce virulentním SARS-CoV (76% sekvenční identita) a vykazuje nízkou sekvenční homologii s MERS-CoV (34% sekvenční identita). Byla hlášena sérologická zkřížená reaktivita mezi koronaviry;8,10,28,29 však údaje o dlouhodobém následném hodnocení zkřížené reaktivity protilátek proti SARS-CoV{140}} vůči jiným koronavirům zůstávají omezené. Stanovili jsme zkříženě se vážící a zkříženě neutralizující protilátky v longitudinálních sérech jedinců infikovaných SARS-CoV{144}}. Výsledky ukázaly, že více než 80 % vzorků séra pacientů se navázalo na S proteiny SARS-CoV a/nebo MERS-CoV do 1 měsíce po nástupu příznaků, přičemž 27 % vzorků vykazovalo dvojitou zkříženou reaktivitu (obr. 1, I). Reaktivita na protein SARS-CoV S měla větší podíl (73 %) než MERS-CoV (35 %) mezi vzorky testovanými v časném období (1-30 dní po nástupu onemocnění) (obr. 1, I). Dvojité zkřížené vazby a SARS-CoV zkříženě se vázající protilátky vykazovaly postupný pokles v průběhu času, přičemž pouze 8 % vzorků s dvojitou zkříženou vazbou a 20 % SARS-CoV s jednoduchou zkříženou vazbou 180 až 220 dnů po nástupu onemocnění (obr. 1 , I; v online úložišti dostupném na www.jacionline.org, viz obr. E4, A, obr. E5, A a obr. E6 v online úložišti tohoto článku na www.jacionline.org). Je zajímavé, že pozitivita protilátek reagujících na protein MERS-CoV S zůstala v průběhu času relativně konstantní (obr. 1, I). Na rozdíl od vysoké kapacity křížové vazby pouze malý počet vzorků séra pacientů zkříženě neutralizoval pseudoviry SARS-CoV a/nebo MERS-CoV (obr. 1, I; obr. E4, B; obr. E5, B; a viz obr. E7 v Online úložiště). Přibližně 27 % vzorků odebraných 1 až 30 dnů po nástupu příznaků vykazovalo zkříženou neutralizační aktivitu a tento počet klesl na 20 % po 180 až 220 dnech, s dramatičtějšími změnami zkříženě neutralizační aktivity SARS-CoV (obr. 1, I ). Vyšší podíl vzorků zkříženě neutralizoval SARSCoV než MERS-CoV do 30 dnů po nástupu onemocnění. Stojí za zmínku, že navzdory podobným podílům vzorků vykazujících zkříženou neutralizaci SARS-CoV a MERS-CoV byly hodnoty NT50 pro MERS-CoV mnohem nižší než hodnoty SARSCoV mezi vzorky séra, které byly pozitivní na zkříženou neutralizaci (obr. E4, B, obr. E5, B, obr. E7).
rostlina cistanche zvyšující imunitní systém
Infekce SARS-CoV-2 vede k aktivaci produkce cytokinů
Abychom komplexně charakterizovali imunologické změny po infekci SARS-CoV-2, dále jsme hodnotili změny v dynamice hladin cytokinů v séru pacientů s COVID-19. Padesát pět longitudinálních vzorků séra, které byly odebrány během prvních 2 měsíců od nástupu symptomů, bylo použito pro detekci produkce cytokinů pomocí proteinového mikročipu. Během prvního měsíce onemocnění byly pozorovány zvýšené sérové hladiny mnoha cytokinů, včetně IL-1a (prozánětlivý), IL-6 (prozánětlivý) a IL-10 (protizánětlivý ), které byly spojeny se syndromem uvolnění cytokinů u těžkých případů COVID{11}}39,40 a také IFN-g (typ TH1) a IL-4 (typ TH2) (obr. 2, A, a obr. E8 v online úložišti dostupném na www.jacionline.org). Konkrétně se sérové hladiny IL-6, IL-10 a IFN-g zvýšily během 15 dnů po nástupu příznaků u pacientů a v pozdějších fázích se snížily, zatímco uvolňování IL-1 Ukázalo se, že a a IL-4 se pozoruhodně zvýšily během 16 až 30 dnů od začátku onemocnění a poté rychle klesly k normálu (obr. 2, A). Korelační analýza ukázala slabou nebo žádnou lineární souvislost mezi antigenně-specifickými protilátkovými odpověďmi a produkcí cytokinů po infekci SARS-CoV-2, ačkoli byla pozorována statistická významnost mezi hladinami IL-10 a SARS-CoV{{{{101} 34}} protilátka vázající protein N (r 5 0.321 a P < 0.05), mezi produkcí IL-1b a protilátkou vázající protein S (r 5 20.335 a P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.
Mapování epitopů v rámci celého proteomu identifikuje dominantní epitopy zprostředkovávající perzistentní humorální imunitní reakce u pacientů s COVID{1}}
Abychom lépe charakterizovali charakteristické rysy humorální imunity vůči SARS-CoV-2 v průběhu času, použili jsme mapování epitopu celého proteomu pomocí mikročipů na bázi peptidů. Byla vytvořena peptidová knihovna pokrývající proteom SARS-CoV{5}} a imobilizována na sklíčka, kde každý peptid měl délku 15 aa s překrytím 11 aa. Celkem 51 longitudinálních vzorků séra od 19 pacientů buď asymptomatických (n 5 1) nebo mírných (n 5 2) až středně těžkých (n 5 15) nebo těžkých (n 5 1) ) Byly testovány infekce SARS-CoV-2 (tabulka I). Aby bylo dosaženo relativně vyváženého počtu vzorků, intervalů a časových bodů, byly vzorky odebírány postupně ve 2 nebo 3 časových bodech od každého účastníka COVID{18}} v rozmezí 16 až 219 dnů po nástupu příznaků. Většina pacientů (18/19) vytvořila neutralizační protilátky po virové infekci, s výjimkou jediného jedince s asymptomatickou infekcí (tabulka I). Podle různých časových bodů vzorkování byly vzorky rozděleny do 3 skupin: dny 10-60 (n 5 18), dny 100-150 (n 5 18) a dny {{28 }} (n 5 15). Podélné hodnocení profilů virových epitopů u pacientů s COVID-19 bylo provedeno pro protilátky IgG i IgM v séru, přičemž jako negativní kontrola byla použita shromážděná séra od 20 zdravých dárců. Pomocí mikročipu proteomu SARS-CoV-2 byla stanovena kinetika protilátkových odpovědí vázajících peptid a analyzována na (1) intenzitu vazebného signálu a (2) procento pozitivně reaktivních vzorků (pozitivní míra) pro každý peptid . Na základě hraniční hodnoty pro pozitivní reakci na vazbu peptidů, která byla nastavena jako dvojnásobek intenzity signálu negativní kontroly, jsme identifikovali celkem 460 pozitivních peptidů pro IgG a 479 pozitivních peptidů pro IgM, které byly reaktivní s alespoň 1 pacientem vzorek séra. Pozitivní počty peptidů a distribuce odpovědí v různých otevřených čtecích rámcích (ORF) SARS-CoV-2 byly relativně stabilní mezi různými vzorkovacími skupinami s trendem mírného poklesu pozitivních počtů peptidů v průběhu času (obr. 3, A). Největší reaktivita byla identifikována v replikázovém polyproteinu ORF1ab, což je největší ORF, který zahrnuje více než dvě třetiny celého genomu (obr. 3, A). Je zajímavé, že jsme pozorovali střední až silné stupně korelace mezi pozitivními reakcemi na vazbu peptidů a hladinami sérových cytokinů brzy po infekci SARS-CoV-2 (dny 10-60 po začátku onemocnění; viz obr. E10 v online úložišti na adrese www.jacionline.org). Bylo ukázáno, že počet pozitivních vazebných peptidů pro IgM souvisí se sérovými hladinami IL-6 a IL-10; podobně průměrná intenzita signálu celkových reaktivních peptidů a ORF1ab vazebných peptidů pro IgM představovala pozitivní asociace s produkcí IL-6 a IFN-g ve vzorcích séra. Tato data naznačují, že změny hladin cytokinů po infekci SARS-CoV-2 mohou ovlivnit velikost a šířku epitopů rozpoznávaných antigenně specifickými humorálními odpověďmi. Na základě identifikace pozitivních epitopů jsme dále vybrali nejběžnější epitopy, které trvale zůstávaly reaktivní ve více než 80 % vzorků COVID{63}} v každé ze 3 vzorkovacích skupin (nazývané dominantní a perzistentní epitopy). Výsledky ukázaly, že tyto vysoce dominantní epitopy schopné zprostředkovat dlouhodobé humorální imunitní reakce byly lokalizovány v polyproteinu SARS-CoV-2 ORF1ab a proteinu S, přičemž více epitopů rozpoznávaných protilátkami IgM (n 5 33) než IgG protilátky (n 5 10) (obr. 3, B a tabulka II; viz obr. E11 a obr. E12 v online úložišti na www.jacionline.org). Polyprotein ORF1ab měl maximální počet dominantních epitopů zprostředkovávajících dlouhodobé odpovědi a epitopy byly široce distribuovány v oblastech nestrukturálních proteinů (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, a nbsp 16 (tabulka II). Zejména jsme identifikovali jeden imunodominantní epitop, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), který mohl být rozpoznán protilátkami IgG a IgM od 100 % pacientů s COVID-19, bez ohledu na časové body odběru séra (obr. 3, B a tabulka II, viz obr. E13 a obr. E14 v online úložišti). Tento vysoce reaktivní peptid se nachází v oblasti helikázy (nsp 13) polyproteinu ORF1ab, který je nezbytný pro odvíjení templátů dvouvláknové RNA během replikace SARS-CoV-2.41 Mezi vybranými peptidy ORF1ab jsou 2 imunodominantní peptidy s nejvyššími průměrnými intenzitami signálu rozpoznávanými IgG protilátkami, číslo 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) a číslo 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), jsou obě umístěny na nsp 13. Pro IgM odpovědi, peptid 685 (ORF1ab, aa 249-263) na nsp 2 a peptid 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) na nsp 13 vykazovaly nejrobustnější vazebné intenzity (obr. 3, B). Vezmeme-li v úvahu variace signálů základní linie (shromážděná séra od zdravých dárců) pro různé peptidy (obr. 3, B), dále jsme vypočítali násobné změny intenzity signálu týkající se každého klíčového peptidu ve vztahu ke zdravé kontrolní skupině. Výsledky ukázaly, že peptid 2073 (vazba IgG) a peptid 1985 (vazba IgM) umístěné v oblasti nsp 13 udržely nejvyšší intenzity vazby peptidu (násobná změna) mezi sérem pacientů shromážděným po dobu 180 až 220 dnů (obr. E13 a obr. E14).
OBR. 2. Kinetika produkce cytokinů u pacientů s COVID{1}}. A, Hladiny produkce cytokinů v 55 vzorcích séra odebraných od 16 pacientů s COVID-19 během akutní fáze a raného stádia rekonvalescence byly detekovány metodou ELISA na bázi proteinových mikročipů (dny 1-15, n 5 11; dny 16-30, n 5 26; dny 31-61, n 5 18; zdraví dárci, n 5 20). Každá tečka představuje individuální vzorek séra; tečkované čáry označují mez detekce. Statistická významnost byla stanovena pomocí 1-way ANOVA s Tukeyho vícenásobným srovnáním. *P < 0,05, **P < 0,01 a ****P < 0,0001. B, násobek změny úrovně produkce jednotlivých cytokinů u pacientů s COVID-19 zobrazených na (A) ve srovnání s průměrnými hodnotami 20 vzorků od zdravých dárců. Každý sloupec označuje odlišný vzorek séra odebraný z uvedených časových bodů po nástupu symptomů; každý řádek představuje 1 jednotlivý testovaný cytokin.
TABULKA I. Charakteristiky pacientů s COVID{0}} a kohorty vzorků v mapování epitopů
OBR. 3. IgM a IgG rozpoznávání dominantních epitopů, které přispívají k dlouhodobým protilátkovým odpovědím u jedinců infikovaných SARS-CoV-2. Longitudinální analýza rozpoznávání epitopů v séru u 19 jedinců s COVID-19 pomocí peptidového mikročipu pokrývajícího proteom SARS-CoV-2. Hraniční hodnota pro pozitivní odpověď na vazbu peptidu ve vzorcích pacientů (n 5 51) byla nastavena jako dvojnásobek intenzity signálu spojeného séra od 20 zdravých dárců. A, Počty peptidů a distribuce pozitivních vazebných peptidů, které byly detekovatelné v 1 nebo více vzorcích odebraných po 10-60 dnech (n 5 18), 100-150 dnech (n 5 18), a 180- 220 dní (n 5 15) po nástupu onemocnění. Čísla označují celkový počet identifikovaných IgG a IgM epitopů z každého ORF. B, Intenzity signálu dominantních a perzistentních epitopů IgG a IgM (osa x), které byly trvale reaktivní ve více než 80 % vzorků ve všech 3 časových bodech odběru vzorků. Každá tečka označuje spojená séra od zdravých dárců (nahoře) nebo samostatný vzorek séra pacienta odebraný v uvedených časových bodech po nástupu příznaků. E, Obalový protein.
TABLE II. Epitopes with >80% pozitivní míra ve všech 3 časových bodech vzorkování
Dominantní a perzistentní epitopy proteinu SARS-CoV-2 S se nacházejí na podjednotkách NTD a S2
Z proteinu SARSCoV-2 S byly identifikovány celkem 4 dominantní a perzistentní epitopy: peptid 318 (S, aa 45-59) a peptid 356 (S, aa 197-211), které se nacházejí v regionu NTD; peptid 510 (S, aa 813-827), který pokrývá místo štěpení S2' a části FP podjednotky S2, a peptid 530 (S, aa 893-907), který se nachází ve spojovací oblasti mezi FP a oblastí repetice první sedmičky podjednotky S2 (obr. 3, B a tabulka II). Z těchto klíčových peptidů proteinu S, které jsme vybrali, měl peptid 318, umístěný na NTD proteinu S, nejsilnější vazebnou intenzitu (násobná změna vzhledem ke kontrole; obr. E13 a obr. E14). Strukturální analýzy odhalily, že tyto epitopy jsou plně exponovány na povrchu monomerního S proteinu; nicméně některé zbytky epitopů pro peptidy 318, 356 a 530 jsou skryty pod povrchem trimerního proteinu S (obr. 4, A a B), což naznačuje, že jak struktury monomeru S, tak trimeru jsou účinně rozpoznávány imunitním systémem hostitele za určitých podmínek. okolnosti. Abychom byli konkrétní, 2 smyčkové segmenty peptidu 318 (aa 45-46 a aa 56-59) jsou vystaveny na trimerním proteinu S, s centrálním b-vláknem pohřbeným uvnitř; a většina zbytků peptidu 356 je přístupná na povrchu, včetně základního b-řetězce (aa 203-209) a segmentu smyčky (aa 210-211). Peptid 510 obsahuje S2' štěpné místo a centrální helix FP, přičemž oba jsou plně přítomny na povrchu S proteinu; zbytky peptidu 530 jsou většinou kryptické, pouze s malou částí smyčky (aa 893-895) vystavenou na trimerním S proteinu (obr. 4, C). Analýza sekvenční homologie mezi 7 běžnými lidskými koronaviry odhalila, že 2 epitopy umístěné na podjednotce S2 (peptidy 510 a 530) sdílejí vysokou sekvenční identitu s jinými koronaviry, což naznačuje sérologickou zkříženou reaktivitu zaměřenou na tyto epitopy mezi lidskými koronaviry (obr. 4, D). Sekvence peptidu 318 vykazovala vysokou podobnost se SARSCoV, zatímco u koronavirů byla prokázána nízká úroveň sekvenční homologie pro peptid 356, což naznačuje odpovědi protilátek specifické pro SARS-CoV-2 zacílené na tuto oblast (obr. 4, D). S ohledem na nové vznikající a celosvětově cirkulující varianty SARS-CoV-2 jsme dále provedli sekvenční zarovnání s ohledem na klíčové epitopy proteinu S mezi raným kmenem SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu{{52} }) a 5 variant obav (Alpha, Beta, Gamma, Delta a Omicron), stejně jako 2 varianty zájmu (Lambda a Mu), podle klasifikace variant virů Světové zdravotnické organizace (aktualizováno 30. listopadu 2021 ). Výsledky ukázaly, že sekvence těchto dominantních a perzistentních epitopů jsou mezi analyzovanými variantami téměř totožné, s výjimkou jediné mutace N211I identifikované v nové variantě Omicron (obr. 4, E). Tato data naznačují, že protilátky vytvořené ranými kmeny SARS-CoV-2 mohou konzistentně rozpoznávat současné cirkulující varianty a že tyto dominantní epitopy mohou být schopny zprostředkovat trvalé dlouhodobé protilátkové odpovědi na infekci SARS-CoV-2 varianty. Pro další stanovení imunologických charakteristik identifikovaných epitopů na S proteinu a pro další zkoumání potenciální hodnoty těchto S-proteinových epitopů jako kandidátů na peptidovou vakcínu jsme provedli studii imunizace myší s použitím vybraných peptidů. BALB/c myši byly naočkovány 3krát každým peptidem v přítomnosti kamence a CpG adjuvans (obr. 4, F). Mezi 4 vybranými peptidy vakcinace peptidem 356 vyvolala antigen-specifické protilátky po druhé a třetí dávce (obr. 4, G). Výsledky sérového neutralizačního testu odhalily, že imunizace lineárními peptidy nevytvářela významné hladiny neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2 (obr. 4, H), což naznačuje, že tyto lineární peptidy fungují špatně při indukci robustních reakcí neutralizačních protilátek.
N protein SARS-CoV-2 postrádá většinu reaktivních epitopů zprostředkovávajících trvalé protilátkové odpovědi po virové infekci
Řada studií objasnila silnou antigenicitu SARS-CoV-2 N proteinu.4,11,12 Nepodařilo se nám však identifikovat dominantní a perzistentní epitopy lokalizované na N proteinu na základě současných výběrových kritérií (míra pozitivity nad 80 % ve všech 3 časových bodech vzorkování). Pro longitudinální hodnocení epitopových profilů proteinu N u jedinců s COVID-19 jsme provedli druhé kolo epitopového screeningu, které bylo založeno na datech získaných z peptidového mikročipu pro selekci subdominantních epitopů, které trvale zůstávaly pozitivní reaktivitou ve více než 60 % vzorků COVID-19 pro každý ze 3 časových bodů odběru (tzv. subdominantní a perzistentní epitopy). Byly identifikovány celkem 4 subdominantní a perzistentní epitopy proteinu SARS-CoV-2 N, mezi nimiž peptid 2455 (N, aa 213-227) vykazoval reaktivitu na protilátky IgG i IgM u COVID{{16 }} pacientů s relativně vyššími úrovněmi intenzity signálu (obr. 5, A a B a viz tabulka E4 v online úložišti na www.jacionline.org). 2 překrývající se peptidy, peptid 2455 (N, aa 213-227) a peptid 2456 (N, aa 217-231), jsou umístěny v oblasti spojky bohaté na Ser/Arg mezi N-koncovou RNA vazebnou doménou a C-koncová dimerizační doména N proteinu. Peptid 2482 (N, aa 321-335) a peptid 2491 (N, aa 357-371) jsou plně nebo částečně umístěny v dimerizační doméně N proteinu (tabulka E4). Kvůli nedostatku 3-D struktur týkajících se intaktní konformace N proteinu jsme provedli pouze strukturální analýzy 2 identifikovaných epitopů na dimerní struktuře C-terminální dimerizační domény. Zbytky peptidu 2482 tvoří 2b vlákna, která jsou uspořádána antiparalelně v dimerizačních rozhraních, zatímco aa 357-364 peptidu 2491 tvoří struktury na bázi šroubovice, které jsou umístěny na opačných koncích dimeru (obr. 5, C) . Srovnání sekvencí mezi raným SARS-CoV-2 (kmen Wuhan-Hu-1) a 7 nově vznikajícími variantami dále odhalilo, že sekvence těchto subdominantních a perzistentních epitopů v proteinu N jsou téměř identické mezi současnými cirkulujícími variantami, přičemž jediná G215C substituce peptidu 2455 vyskytující se ve variantě Delta a jediná G214C mutace peptidu 2455 identifikovaná ve variantě Lambda, což naznačuje, že protilátky zacílené na tyto peptidy potenciálně rozpoznávají antigen vznikajících variant SARS-CoV-2 (obr. 5, D ).
OBR. 4. Dominantní epitopy spike proteinu SARS-CoV-2 z hlediska zprostředkování trvalých humorálních imunitních odpovědí. A a B, Umístění dominantních a persistentních epitopů na 3-D strukturách monomerního (A) a trimerního (B) S proteinu (PDB ID: 6VXX). Epitopy jsou zvýrazněny zeleně (peptid 356, aa 197-211), červeně (peptid 318, aa 45-59), modře (peptid 510, aa 813-827) a fialově (peptid 530, aa 893-907), resp. Tři S monomery v uzavřené konformaci jsou znázorněny šedou, růžovou a azurovou barvou. C, Podrobná analýza struktury dominantních epitopů v proteinu SARS-CoV-2 S na uzavřeném stavu trimeru S (PDB ID: 6VXX). D, Zarovnání sekvencí identifikovaných epitopů mezi běžnými lidskými koronaviry. Zbytky epitopu, které jsou zachovány mezi SARS-CoV-2 a jinými lidskými koronaviry, jsou vystínovány šedě. E, Analýza konzervace epitopu raného SARS-CoV-2 (kmen Wuhan-Hu-1) a 7 nově vznikajících variant. Černé tečky představují identické zbytky mezi kmenem Wuhan-Hu-1 a uvedeným.
OBR. 5. Subdominantní epitopy umístěné na nukleokapsidovém proteinu SARS-CoV-2 jsou schopné zprostředkovat přetrvávající protilátkové odpovědi. Frekvence rozpoznávání A, IgG a IgM subdominantních peptidů (trvale reaktivních ve více než 60 % vzorků) mezi vzorky séra pacientů odebraných v několika časových bodech po nástupu onemocnění. B, Kinetika intenzity signálu identifikovaných subdominantních epitopů v průběhu času. Každá tečka představuje odlišný vzorek séra pacienta získaný od pacientů s COVID-19 v uvedených časových bodech po nástupu příznaků. Tečkované vodorovné čáry označují hraniční hodnoty pozitivní odpovědi pro každý peptid. C, Podrobná analýza struktury epitopů na C-koncové dimerizační doméně N proteinu (PDB ID: 6YUN). Epitopy jsou označeny modře (peptid 2482, aa 321-335) a hnědou barvou (peptid 2491, aa 357-364). 2 monomerní struktury jsou znázorněny šedou a azurovou barvou. D, Analýza zarovnání sekvencí identifikovaných N-proteinových epitopů mezi raným SARS-CoV-2 (kmen Wuhan-Hu-1) a 7 nově vznikajícími variantami. Černé tečky označují identické sekvence mezi kmenem Wuhan-Hu-1 a uvedenou variantou. Změny v aminokyselinové sekvenci jsou zvýrazněny červeně.
OBR. 6. Vložkové epitopy s vysokou vazebnou intenzitou a klesajícími reaktivními frekvencemi v průběhu času, které rozpoznávají jedinci infikovaní SARS-CoV-2. A a B, Podélná analýza a distribuce identifikovaných peptidů vykazujících vysokou intenzitu vazebného signálu (nad průměrem 1 SD intenzit signálu všech testovaných vzorků), ale s časem klesající pozitivní četnost. Rozpoznávací frekvence (A) a intenzita signálu (B) epitopů byly vyneseny do grafu se 3 časovými body vzorkování po nástupu symptomu. Každá tečka v (B) představuje vzorek séra jednotlivého pacienta odebraný v uvedených časových bodech po nástupu příznaků; tečkované vodorovné čáry označují hraniční hodnoty pozitivity pro každý peptid. Analýza statistické významnosti byla provedena na základě softwaru Limma of R v3.6.3. *P < 0,05 a **P < 0,01. C, Porovnání umístění a sekvence 2 sousedních epitopů, peptidu 510 (dominantní a perzistentní) a peptidu 511 (vysoká intenzita signálu a klesající pozitivita v průběhu času), na struktuře proteinu SARS-CoV-2 S (PDB ID: 6ZGI) . Překrývající se oblasti mezi 2 epitopy jsou zvýrazněny zeleně; jedinečné sekvence jsou označeny červeně a modře.
Longitudinální sérologická analýza identifikuje epitopy s vysokou intenzitou signálu, ale s časem klesající reaktivitou
Kromě vybraných vysoce reaktivních epitopů, které jsou zodpovědné za setrvalé humorální imunitní reakce uvedené výše, jsme dále identifikovali a charakterizovali panel 9 pozitivních peptidů, které vykazovaly silné vazebné intenzity (nad průměrem 1 SD intenzit signálu všech testovaných vzorků) s trend klesající reaktivity (pozitivní změny četnosti nad 20 %) mezi vzorky séra od pacientů s COVID-19 v průběhu času, v souladu s obecným trendem slábnutí humorálních imunitních odpovědí. Tyto epitopy jsou umístěny ve 3 dominantních antigenech: ORF1ab, S a N proteiny (obr. 6, A; a viz tabulka E5 v online úložišti na www.jacionline.org). Kromě toho bylo pozorováno významné snížení intenzity signálu 4 peptidů z proteinů ORF1ab (peptidy 784-IgG, 1617-IgM a 1986-IgM) a N (peptid 2457-IgG) mezi vzorky z časného období odběru vzorků (dny 10-60 po nástupu onemocnění) a pozdější fáze časových bodů odběru (dny 100-150 nebo dny 180-220 po nástupu příznaků) (obr. 6 , B). Pozoruhodné je, že i přes do značné míry se navzájem překrývající 2 peptidy S proteinového peptidu 510 (dominantní a perzistentní; Obr. 3, B) a peptidu 511 (vysoká intenzita signálu a klesající pozitivní četnost v průběhu času; Obr. 6, A) vykazovaly různé vzory reaktivita mezi vzorky séra pacienta v průběhu času. Sekvenční a lokalizační analýza ukázala, že peptid 510 obsahuje místo štěpení S2' a další aminokyseliny 813-SKRS-816, zatímco peptid 511 je zcela v rámci FP s rozšířenou 828-LADA{{29 }} zbytky, které jsou plně exponovány na povrchu trimerního proteinu S (obr. 6, C). Tyto výsledky odhalily nové vlastnosti epitopů, které mohou v konečném důsledku přispět k déletrvající a silnější humorální imunitě proti SARS-CoV-2.
DISKUSE
Systematická charakterizace dlouhodobých imunitních odpovědí na infekci SARS-CoV-2 je zásadní pro vývoj vylepšené diagnostiky, účinných terapeutických intervencí a vakcín. V současné studii jsme provedli komplexní longitudinální analýzu pacientů s COVID-19 během 180 až 220denního sledování, která prokázala přetrvávající humorální imunitní reakce a aktivovanou produkci cytokinů po virové infekci.
Je významné, že využitím mikročipu založeného na peptidech pokrývajícího proteom SARS-CoV-2 jsme dále odhalili kinetiku rozpoznávání epitopů a identifikovali panel dominantních epitopů schopných zprostředkovat dlouhodobou humorální imunitu. Zjištění, která zde uvádíme ohledně dlouhověkosti humorálních imunitních odpovědí po infekci SARS-CoV-2, potvrzují některá dříve publikovaná data5,10,12,13,42, ale rozšiřují je provedením hlubokého sérologického profilování a epitopového screeningu pomocí longitudinálních vzorků séra od jedinců s COVID{11}} prostřednictvím přístupu mikročipů pro celý proteom. V této studii jsme identifikovali 4 dominantní epitopy (peptidy 318, 356, 510 a 530) v proteinu SARS-CoV-2 S, které byly schopny trvale reagovat s více než 80 % pacientů s COVID{21}} testované vzorky, až 180 až 220 dnů po nástupu příznaků. Peptid 510 (S, aa 813-827), obsahující místo štěpení S2 a FP podjednotky S2, byl běžně identifikován v předchozích studiích jiných skupin.26,28,32-34 Funkční analýzy indikovaly protilátky zacílení na tuto oblast může vykazovat omezenou neutralizační schopnost proti SARS-CoV-226,33 navzdory tomu, že je vysoce exponován na povrchu proteinu S (obr. 4, AC). V případě peptidu 530 (S, aa 893-907), který je umístěn mezi FP a oblastí první sedmičlenné repetice podjednotky S2, jsou zbytky obecně pohřbeny uvnitř trimerní struktury proteinu S, což ho činí obtížně přístupné prostřednictvím robustních neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2 (obr. 4, AC). Dále byly vybrány 2 S1-NTD-řízené peptidy, které by mohly zprostředkovat dlouhodobé protilátkové odpovědi SARS-CoV-2. Analýzy týkající se peptidové sekvence a umístění ukázaly, že zbytky těchto 2 peptidů – peptidu 318 (S, aa 45-59) a peptidu 356 (S, aa 197-211) – jsou v těsné blízkosti hlášených rozpoznávaných epitopů protilátkami zesilujícími infekci23,25, ale kromě klíčových míst vysoce účinných neutralizačních protilátek zacílených na NTD podjednotky S1,16,19,43 naznačuje možnost rozpoznání epitopu neneutralizujícími protilátkami proti těmto 2 identifikovaným peptidům. Kromě podrobností uvedených výše, imunizace myší vybranými peptidy dále ukázala nízkou účinnost těchto lineárních peptidů s doménou nevázající receptory při indukci robustních reakcí neutralizačních protilátek (obr. 4, G). Souhrnně tato data naznačují, že dominantní lineární epitopy zprostředkovávající dlouhodobé humorální imunitní reakce na infekci SARS-CoV-2 pravděpodobně indukují protilátky s žádnou nebo omezenou neutralizační schopností. Plnější pochopení epitopového prostředí protilátek SARS-CoV-2, zejména epitopů zaměřených na S protein, poskytuje nový pohled na funkční disekci protilátek, což dále usnadňuje inovativní a racionální návrh vakcín. Neutralizační protilátky poskytují ochranu pro eliminaci virových infekcí, zatímco neneutralizující protilátky mohou hrát prospěšnou, neutrální nebo dokonce škodlivou roli během odstraňování virů. Neneutralizační protilátky poskytují další ochranu in vivo prostřednictvím řady efektorových funkcí zprostředkovaných Fc v kontextu fagocytózy závislé na protilátkách a cytotoxicity závislé na protilátkách. Naproti tomu některé studie navrhovaly možnost patogenní role neneutralizujících protilátek při infekci koronavirem. Předchozí studie využívající více typů kandidátů vakcíny na SARS-CoV a MERS-CoV pozorovaly zvýšenou imunopatologii u očkovaných malých zvířat a primátů kromě člověka po infekci virem.24,44-50 Nedávno studie 2 skupin uvedly, že protilátky namířené proti NTD proteinu SARS-CoV-2 S byly schopny zesílit virovou infekci in vitro prostřednictvím mechanismů nezávislých na Fcg receptoru,23,25 ačkoli se ukázalo, že pasivně podávané protilátky zesilující infekci na zvířecích modelech chrání proti SARS -Infekce CoV-2 in vivo. Vezmeme-li v úvahu kontroverzní role protilátek během koronavirové infekce, jsou zapotřebí další výzkumy k ověření potenciální role protilátek při rozpoznávání těchto dominantních a perzistentních epitopů v boji proti virové infekci in vivo. Další fáze racionálního návrhu vakcíny proti SARS-CoV-2 by mohla být koncipována vyvoláním vysoce účinných neutralizačních protilátek a ochranných neneutralizačních protilátek spolu s omezením prezentace epitopů zesilujících infekci nebo imunodominantních epitopů, které nemají žádné blahodárné účinky. Přestože se řada předchozích studií zaměřovala pouze na protein S SARS-CoV-2 s cílem vymezit funkce protilátek ohledně neutralizace, provedli jsme komplexní mapování epitopů pro celý proteom a identifikovali jsme panel epitopů v polyproteinu ORF1ab, které byla konzistentně rozpoznána vysokým podílem vzorků séra pacientů v průběhu času. Ačkoli tyto peptidy zaměřené na ORF1ab distribuované na mnoha nestrukturálních proteinech nemusí vyvolat funkční protilátky zacílené na SARS-CoV-2 virion, mohly by být použitelné jako diagnostický nástroj, který pomůže odlišit přirozenou infekci od očkování. S rostoucím počtem příjemců vakcín na celém světě čelí současné sérologické testy založené na proteinu S a proteinu N výzvám jako účinný přístup k pomoci molekulárním testům pro detekci infekce SARS-CoV-2 a také pro stanovení imunitního stavu po virové infekci. Díky využití nejběžnějších a trvale reaktivních peptidů v rámci ORF1ab u jedinců infikovaných COVID{101}} bude sérologická diagnostika přirozené infekce provedena bez zohlednění stavu očkování zahrnujícího S protein na bázi vazebné domény receptoru přístupy založené na vakcínách založených na a inaktivovaných virech. Budoucí studie jsou potřebné k posouzení reaktivity, citlivosti a specificity identifikovaných peptidů ORF1ab ve větších kohortách zahrnujících jedince infikované SARSCoV–2 i příjemce vakcíny. Kromě toho bude zapotřebí další hodnocení účinnosti detekce prostřednictvím strategií četných kombinací peptidů, aby se překonala nižší citlivost peptidů ve srovnání s proteinem plné délky a možná zkřížená reaktivita mezi běžnými lidskými koronaviry. Hlavním omezením naší studie je relativně málo vzorků získaných z malé kohorty pacientů a většina účastníků prodělala nezávažná onemocnění COVID{106}}. Ty mohou omezovat některé z našich závěrů s ohledem na četnost pozitivní odezvy a velikost imunitních odpovědí, které se mohou lišit podle závažnosti onemocnění. Údaje prezentované v této studii nicméně poskytují cenné poznatky o kinetice imunitních reakcí v průběhu času po infekci SARS-CoV{108}} a rysech dominantních epitopů schopných zprostředkovat trvalou humorální imunitu u jedinců s COVID{109}}. Tato zjištění společně nabízejí hlubší pochopení dlouhověkosti přirozené imunity vyvolané virovou infekcí a mají široké důsledky pro inovativní vakcinační strategie a zlepšené diagnostické přístupy.
REFERENCE
1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H a kol. Genomická charakterizace a epidemiologie nového koronaviru 2019: důsledky pro původ viru a vazbu receptoru. Lancet 2020;395:565-74.
2. Světová zdravotnická organizace (WHO). Panel WHO koronavirus (COVID-19), 2021. Dostupné na: https://COVID19.who.int/. Zpřístupněno 30. listopadu 2021.
3. Wu Z, McGoogan JM. Charakteristika a důležitá ponaučení z propuknutí koronavirové nemoci 2019 (COVID-19) v Číně: shrnutí zprávy o 72 314 případech z Čínského centra pro kontrolu a prevenci nemocí. JAMA 2020;323:1239-42.
4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Antigenově specifická adaptivní imunita vůči SARS-CoV-2 u akutního COVID-19 a souvislosti s věkem a závažností onemocnění. Buňka 2020;183:996-1012.e19.
5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, a kol. Infekce SARS-CoV-2 indukuje trvalé humorální imunitní reakce u pacientů v rekonvalescenci po symptomatickém COVID-19. Nat Commun 2021;12:1813.
6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK a kol. Protilátkové reakce na SARS-CoV-2 u pacientů s COVID-19. Nat Med 2020; 26:845-8.
7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L a kol. IgA dominuje časné neutralizační protilátkové odpovědi na SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.
8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y a kol. Spike-specifické cirkulující T folikulární pomocné buňky a zkříženě neutralizující protilátkové odpovědi u pacientů v rekonvalescenci COVID-19. Nat Microbiol 2021;6:51-8.
9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q a kol. Neutralizační protilátky proti SARS-CoV-2 jsou robustnější u pacientů s těžkým onemocněním. Eerg Microbes Infect 2020; 9:2091-3.
10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Kinetika a koreláty reakce neutralizačních protilátek na infekci SARSCoV-2 u lidí. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.
11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H a kol. Klesající hladiny neutralizačních protilátek proti SARS-CoV-2 u pacientů v rekonvalescenci COVID-19 jeden rok po nástupu příznaků. Front Immunol 2021;12:708523.
12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Přirozeně zvýšená neutralizační šíře proti SARS-CoV-2 jeden rok po infekci. Příroda 2021;595:426-31.
13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE a kol. Imunologická paměť na SARS-CoV-2 hodnocená po dobu až 8 měsíců po infekci. Science 2021;371:eabf4063.
14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Zrání a přetrvávání odpovědi paměťových B buněk anti-SARS-CoV-2. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X a kol. Lidské neutralizační protilátky vyvolané infekcí SARS-CoV-2. Příroda 2020; 584:{14}}.
16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q a kol. Silné neutralizační protilátky proti více epitopům na špičce SARS-CoV-2. Příroda 2020;584:450-6.
17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP a kol. Silně neutralizující a ochranné lidské protilátky proti SARS-CoV-2. Příroda 2020; 584:443-9.
18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X a kol. Konformační dynamika trimerního spike glykoproteinu SARS-CoV-2 v komplexu s receptorem ACE2 odhalená pomocí cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.
19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC a kol. Antigenní mapování N-terminální domény odhaluje místo zranitelnosti SARSCoV-2. Buňka 2021;184:2332-47.e16.
20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ a kol. Strukturální základ pro širokou neutralizaci koronaviru. Nat Struct Mol Biol 2021; 28:478-86.
21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE a kol. Ultrapotentní lidské protilátky chrání proti SARS-CoV-2 pomocí několika mechanismů. Věda 2020; 370:950-7.
22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Křížová neutralizace SARS-CoV-2 lidskou monoklonální protilátkou SARS-CoV. Příroda 2020;583:290-5.
23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Místo zvyšující infekčnost na spike proteinu SARS-CoV-2 cílené protilátkami. Cell 2021; 184:3452-66.e18.
24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H a kol. Anti-spike IgG způsobuje vážné akutní poškození plic zkreslením reakcí makrofágů během akutní infekce SARS-CoV. JCI Insight 2019;4:e123158.
25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM a kol. In vitro a in vivo funkce protilátek zvyšujících a neutralizující infekci SARS-CoV-2. Buňka 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS a kol. Dva lineární epitopy na spike proteinu SARS-CoV-2 vyvolávají u pacientů s COVID{10}} neutralizační protilátky. Nat Commun 2020;11:2806.
27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC a kol. Těžba epitopů na spike proteinu SARS-CoV-2 od pacientů s COVID-19. Cell Res 2020;30:702-4.
28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL a kol. Profilování epitopů odhaluje vazebné znaky imunitní odpovědi SARS-CoV-2 při přirozené infekci a zkřížené reaktivitě s endemickými lidskými CoV. Cell Rep 2021;35: 109164.
29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y a kol. Profilování virových epitopů pacientů s COVID-19 odhaluje zkříženou reaktivitu a koreluje závažnost. Science 2020;370:eabd4250.
30. Zámečník ČR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, multiplexní diagnostické potrubí, zkoumá lidská séra na antigeny SARS-CoV-2- 2. Cell Rep Med 2020;1:100123.
31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Mapování epitopů ve vysokém rozlišení a charakterizace protilátek SARS-CoV-2 u velkých kohort pacientů s COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.
32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H a kol. Systematické hodnocení odpovědí IgG na peptidy odvozené od spike proteinu SARS-CoV-2 pro monitorování pacientů s COVID-19. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.
33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY a kol. Krajina lineárního epitopu spike proteinu SARS-CoV-2 vytvořeného z 1051 pacientů s COVID{5}}. Cell Rep 2021;34:108915.
34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D a kol. SARS-CoV-2 Proteom Microarray pro mapování interakcí COVID-19 protilátek při rozlišení aminokyselin. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.
35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y a kol. Funkční mapování B-buněčných lineárních epitopů SARS-CoV-2 v rekonvalescentní populaci COVID-19. Eerg Microbes Infect 2020; 9:1988-96.
36. Národní zdravotní komise a Národní správa tradiční čínské medicíny. Diagnostický a léčebný protokol pro nový koronavirový zápal plic (zkušební verze 7). Chin Med J (Anglie) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.
37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC a kol. Profilování repertoáru longitudinálních sérových autoprotilátek identifikuje biomarkery související s chirurgickým výkonem u plicního adenokarcinomu. EBioMedicine 2020;53:102674.
38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y a kol. Protilátkové reakce na SARSCoV-2 u pacientů s novým koronavirovým onemocněním 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.
39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M a kol. Podélné analýzy odhalují imunologické selhání u těžkého onemocnění COVID-19. Příroda 2020;584: 463-9.
40. Moore JB, červen CH. Syndrom uvolnění cytokinů u těžkého onemocnění COVID-19. Věda 2020; 368:473-4.
41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB a kol. Strukturální základ pro spojení helikáza-polymeráza v replikačně-transkripčním komplexu SARS-CoV-2. Buňka 2020;182:1560-73.e13.
42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Robustní neutralizační protilátky proti infekci SARS-CoV-2 přetrvávají měsíce. Věda 2020; 370:1227-30.
43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M a kol. Neutralizační lidská protilátka se váže na N-terminální doménu spike proteinu SARS-CoV-2. Věda 2020; 369:650-5.
44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL a kol. Imunizace vakcínami proti koronaviru SARS vede k plicní imunopatologii při stimulaci virem SARS. PLoS One 2012;7:e35421.
45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M a kol. Dvojitě inaktivovaná vakcína proti koronaviru těžkého akutního respiračního syndromu poskytuje u myší neúplnou ochranu a indukuje zvýšenou eozinofilní prozánětlivou plicní odpověď po expozici. J Virol 2011;85:12201-15.
46. Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Imunizace modifikovaným virem vakcínie rekombinantní vakcínou na bázi Ankary proti těžkému akutnímu respiračnímu syndromu je spojena se zvýšenou hepatitidou u fretek. J Virol 2004;78:12672-6.
47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. Předchozí imunizace nukleokapsidovým proteinem koronaviru (SARS-CoV) souvisejícím s těžkým akutním respiračním syndromem (SARS) způsobuje u myší infikovaných SARS-CoV těžkou pneumonii. J Immunol 2008;181:6337-48.
48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A a kol. Účinnost vakcíny u senescentních myší vystavených rekombinantním variantám epidemie SARS-CoV a zoonotických špiček. PLoS Med 2006;3:e525.
49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T a kol. Imunodominantní epitopy koronaviru SARS u lidí vyvolaly jak zesilující, tak neutralizační účinky na infekci u primátů kromě člověka. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.
50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH a kol. Imunizace inaktivovanou vakcínou proti koronavirovému respiračnímu syndromu na Středním východě vede k plicní imunopatologii při expozici živým virem. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.