- Kyselina lipoová zvyšuje syntézu a ukládání kolagenu v ledvinách nediabetických a diabetických potkanů

Nevena Grdović a kol

Kyselina lipoová (ALA) je široce používána jako doplněk výživy a terapeutické činidlo při léčbě diabetu. Dobře zavedené antioxidační a hypoglykemické účinky ALA byly považovány za zvláště důležité v boji proti diabetickým komplikacím, včetněledvinovézranění. Tato studie hodnotila potenciál ALA ovlivňovat profibrotické příhody vledvinakteré by mohly změnit jeho strukturu a fungování. ALA byla podávána intraperitoneálně (10 mg/kg) nediabetickým a streptozotocinem indukovaným diabetickým samcům potkanů ​​Wistar po dobu 4 a 8 týdnů. Účinky ALA byly hodnoceny počínaje strukturními/morfologickými změnami přes změny, které charakterizují profibrotické procesy, až po regulaci exprese kolagenového genu vledvina. Zde jsme prokázali, že ALA zlepšila systémovou hladinu glukózy a močoviny, snížila tvorbuledvinovépokročilé glykační koncové produkty (AGE) a udržovaly renální strukturální integritu u diabetických potkanů. Profibrotické příhody vyvolané u diabetu však nebyly ALA zmírněny, protože syntéza/ukládání kolagenu a exprese transformujícího růstového faktoru- 1 (TGF- 1) a -aktinu hladkého svalstva (-SMA) zůstaly zvýšené v ALA- léčených diabetických potkanů, zejména po 8 týdnech nástupu diabetu. Navíc 8 týdnů léčby nediabetických potkanů ​​ALA vedlo k rozvoji profibrotických rysů odrážejících se ve zvýšené syntéze/ukládání kolagenu. Kromě TGF- 1 downstream signalizace, další mechanismus, který je základem upregulace kolagenu IV u nediabetických potkanů ​​léčených ALA, zahrnuje sníženou metylaci DNA jejího promotoru, která by mohla vzniknout ze zvýšené exprese Tet1. Tato zjištění zdůrazňují terapeutickou opatrnost při použití ALA, zejména u pacientů sledvinovédiabetikkomplikace.

Další informace: ali.ma@wecistanche.com

Kliknutím získáte prášek z extraktu Cistanche pro onemocnění ledvin

1. Úvod

Diabetikledvinaonemocnění (DKD) nebo diabetická nefropatie je jednou z mikrovaskulárních komplikací s incidencí 20-40 procent mezi diabetickými pacienty, která je doprovázena progresivními strukturálními změnami a ztrátou funkcí ledvin [1]. Patofyziologický mechanismus, který je základem DKD, je komplexní a začíná chronickou hyperglykémií, která následně spouští oxidační stres, tvorbu pokročilých konečných produktů glykace (AGE), aktivaci signálních drah MAPK/PKC a následnou expresi několika prozánětlivých a profibrotických mediátorů [2, 3]. Přeslechy mezi těmito událostmi mají za následek akumulaci proteinů extracelulární matrix (ECM) v mezangiu a tubulointersticiu s klasickým histopatologickým vzoremledvinovéfibróza. Začíná strukturálními změnami, jako je ztluštění bazální membrány a mezangiální expanze, postupně přechází v glomerulosklerózu a intersticiální fibrózu, která nakonec vyvrcholíledvinovéselhání[4, 5].

Signalizace transformujícího růstového faktoru- 1 (TGF{1}}) je součástí procesu hojení ran, který se po trvalém zánětu, hyperglykémii nebo oxidativním stresu, který je charakteristický pro diabetes, přeměňuje v patofyziologickou fibrózu [6] . TGF- 1 je centrálním mediátorem patogeneze DKD a je hlavním regulátorem exprese proteinu ECM u pacientů s diabetem, pravděpodobně v důsledku hyperglykemického a narušeného oxidačního prostředí [7–10]. TGF- 1 indukuje akumulaci ECM stimulací kolagenu typu I a IV, aktinu hladkého svalstva (-SMA), syntézou lamininu a fibronektinu a také inhibicí enzymů degradujících ECM [11].

Kolagen typu IV je nejhojnější složkou bazální membrány [12], za fyziologických podmínek je exprimován v glomerulárních a tubulárních bazálních membránách [13]. Diabetická nefropatie je však doprovázena aberantní expresí kolagenu typu IV, která zahrnuje nadměrnou produkci a nepravidelnou distribuci přes intersticium a mezangium [14–16]. Mezi šesti izoformami kolagenu typu IV (1- 6) jsou 1(IV) a 2(IV) univerzálně přítomné ve všech bazálních membránách. Řetězce kolagenu 1(IV) a 2(IV) jsou kódovány geny Col4a1 a Col4a2, jejichž transkripční regulace se opírá o dobře popsané cis-trans interakce [17], ale nedávné objevy zdůrazňují důležitou roli epigenetických mechanismů, včetně metylace DNA, v regulace jejich projevu [18–20].

Vzhledem k patofyziologickým mechanismům, které stojí za DKD, jsou léčebné strategie přímočaré a zaměřují se na hyperglykémii a oxidační stres. Bylo zjištěno, že hypoglykemický a antioxidační potenciál ALA, což je jeden z široce používaných antioxidantů, zlepšujeledvinovépatologické změny spojené s diabetickou nefropatií [21–23]. V souvislosti se stárnutím kůže však byly popsány příznivé účinky ALA prostřednictvím zvýšené syntézy kolagenu typu I v lidských dermálních fibroblastech [24]. Vzhledem k patofyziologii DKD by podobný účinek ALA mohl být škodlivý pro diabetické pacienty sledvinovékomplikace. Na tomto pozadí byla tato studie zaměřena na hodnocení účinků ALA na renální strukturní/morfologické rysy a profibrotické procesy s důrazem na expresi genu kolagenu typu IV u diabetických a nediabetických potkanů.

2. Materiál a metody

2.1. Zvířata, léčba a experimentální nastavení.Všechny experimenty byly provedeny na 2,{1}}měsíčních samcích albínských potkanů ​​Wistar o hmotnosti mezi 220 a 250 g. Všechny postupy na zvířatech schválené Etickou komisí pro používání laboratorních zvířat Institutu pro biologický výzkum „Siniša Stan-ković“, Univerzita v Bělehradě, byly v souladu se směrnicí 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných k pokusným a jiné vědecké účely. Zvířata v této studii byla usmrcena fyzikální metodou eutanazie za použití gilotiny v souladu se všemi doporučeními pokynů pro eutanazii zvířat. Smrt nastává okamžitě a zvířata netrpěla. Eutanazie byla provedena na operačním sále, odděleném od ustájovací místnosti, jedno zvíře po druhém (zbytek pokusných zvířat byl držen v experimentální místnosti, která je oddělena od operačního sálu, kde byla eutanazie provedena, aby se předešlo stresu pro druhé zvířata). Eutanazii prováděli dobře vyškolení a zkušení lidé. Zařízení použité k dekapitaci bylo v dobrém provozním stavu (pravidelné služby zajišťují ostrost čepelí).

Diabetes byl vyvolán opakovanými injekcemi nízké dávky (40 mg/kg) streptozoticinu (STZ) (MP Biomedicals) po dobu pěti po sobě jdoucích dnů; kontrolním krysám bylo injikováno samotné vehikulum (0,1 M pufr citrát sodný, pH 4,5). Hladina glukózy v krvi byla měřena 24 hodin po poslední injekci STZ krevním glukometrem Accu-Chek Active a zvířata byla považována za diabetická, když hladina glukózy v krvi nalačno přesáhla 20 mmol/l. Potkani byli náhodně rozděleni do čtyř experimentálních skupin: kontrola (kontrola, n=8), kontrola léčená ALA (ALA, n=8), diabetická (STZ, n=10) a diabetická skupina léčená ALA (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i synovial, Bělehrad, Srbsko) byla podávána intraperitoneálně (10 mg/kg) každý den po dobu 4 a 8 týdnů, počínaje poslední injekcí STZ. Po obětování a odběru krve byl proveden břišní řez a obojíledvinybyly odstraněny. Jedenledvinabyla zmražena v kapalném dusíku, udržována na -80 stupni a použita k izolaci proteinu, DNA a RNA, zatímco druhá byla fixována v 10% pufrovaném formalínu pro histologická vyšetření.

2.2. Biochemická analýza.Potkani se před obětí přes noc postili. Krevní sérum bylo odebráno po srážení krve a centrifugaci při 2,000 g po dobu 10 minut. Sérum bylo použito pro stanovení koncentrací glukózy komerční soupravou (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), hladina triglyceridů v séru metodou GPO-PAP pomocí enzymatické soupravy (Randox Laboratories, UK), hladina močoviny metodou Urea Assay Kit (Abcam, USA) a koncentrace kreatininu pomocí Cayman's Creatinin Assay podle pokynů výrobce.

2.3.Histologická analýza a imunobarvení.Formalín - opravenoledvinatkáně byly dehydratovány klesající sérií xylolu a alkoholů pro posteriorní zařazení do paraffinových bloků. Tkáňové bloky byly nařezány na 5 μm na rotačním mikrotomu (RM 2125RT; Leica Microsystem). Aby bylo možné pozorovat změny v morfologii ledvin, byly tkáňové řezy barveny metodou Periodic Acid–Schiff (PAS). Dále byly obarvené řezy analyzovány pomocí mikroskopu Olympus (BX-51) vybaveného mikroaktuátorem, motorizovaným stolkem a kamerou řízeným novým stereologickým softwarovým balíčkem CAST Visiopharm Integrator System. Oblasti tubulárního lumenu byly získány při objektivním zvětšení 40x a vyjádřeny jako procento (procenta) na vyšetřovanou oblast. Frakce mezangiální matrice byla vyhodnocena jako plocha pozitivního barvení PAS, vyjádřená v procentech na celkovou glomerulární plochu (objektivní zvětšení 100x).

Pro detekci kolagenových vláken byly tkáňové řezy obarveny barvivem Masson trichrome. Po obarvení byly řezy pozorovány pod světelným mikroskopem (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Německo, vybavený CCD kamerou Leica DFC 320; zvětšení objektivu 40x). Analýza obrazu byla provedena softwarem ImageJ (verze 1.52p, National Institutes of Health). Snímky byly převedeny na zásobníky RGB a bylo použito manuální prahování pro vyhodnocení podílu plochy kolagenu na plochu tkáně.

Imunohistochemická analýza byla provedena tak, jak je popsáno v [25] s použitím polyklonální protilátky vypěstované proti N(a)-(karboxymethyl)lysinu (CML) (ředění 1:50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) a sekundární protilátky křenové peroxidázy (1: 100) (Santa Cruz Biotechnology). Tkáňové řezy byly obarveny 3,3'-diaminobenzidinem (DAB), kontrastně obarveny hematoxylinem a upevněny a pozorovány pod světelným mikroskopem (Leica DM RB Photo-mikroskop; zvětšení objektivu 40x). Analýza obrazu byla provedena softwarem ImageJ (verze 1.52p, National Institutes of Health). Obrázky byly zpracovány barevnou dekonvolucí s možností vektoru H DAB. Signalizace CML byla vypočtena jako průměrná intenzita šedé barvení DAB normalizovaná na počet jader (získáno pomocí možnosti Analyzovat částice).

2.4. Analýza Western Blot.25 ugledvinahomogenáty byly separovány pomocí SDS-PAGE, přeneseny na polyvinylidendifluoridové membrány a sondovány polyklonální protilátkou proti GAPDH (FL-335) a monoklonálními protilátkami proti potkanímu TGF- 1 (3C11) a SMA (CGA7), všechny z Santa Cruz Biotechnology a vše zředěné v poměru 1:1,000. Detekce byla provedena vylepšeným chemiluminiscenčním detekčním systémem (Santa Cruz Biotechnology). Kvantifikace imunoreaktivních pásů byla provedena pomocí softwaru TotalLab (Phoretix) pro elektroforézu (verze 1.10) a normalizována na GAPDH použitý jako kontrola nanášení.

2.5. Kvantitativní PCR v reálném čase (RT-qPCR).Celková RNA byla izolována zledvinypomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen). Pro syntézu cDNA byl 1 ug celkové RNA ošetřen DNázou I a reverzně transkribován pomocí RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Kanada) s použitím směsi náhodných hexamerů a oligo (dT) primerů. Hladiny mRNA byly kvantifikovány pomocí 2x Maxima SYBR Green/-ROX qPCR Master Mix (Fermentas) na systému QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) byl použit k návrhu primerů (uvedených v doplňkové tabulce S1) pro hodnocení Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b a Exprese genu Tet1. Tepelné cykly sestávaly z počáteční denaturace při 95 stupních/10 min a 40 cyklů dvoukrokové PCR při 95 stupních/15 sa 60 stupních/60 s. Hladiny exprese mRNA sledovaných genů byly normalizovány na hladinu exprese mRNA Actb jako referenčního genu metodou 2-dCT.

2.6. Izolace genomové DNA a bisulfitová konverze DNA.Genomová DNA byla izolována pomocí přístupu Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26], podle protokolu pro extrakci DNA ze savčí tkáně (dostupný online na https://bomb.bio/protocols/). Genomová DNA byla podrobena BOMB bisulfitovému konverznímu protokolu (dostupnému online na https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7. Měření globálních úrovní methylace DNA.Globální hladiny metylace DNA byly měřeny pomocí soupravy 5-mC DNA ELISA kit (Zymo Research, California, USA) podle pokynů výrobce. Purifikovaná genomová DNA (100 ng) izolovaná zledvinyze všech experimentálních skupin a každý vzorek byl testován v duplikátech. Statistická významnost byla odhadnuta pomocí jednocestné ANOVA s blokováním, přičemž každá destička ELISA byla považována za blok.

2.8. Methylation-Specific PCR (MSP).Páry primerů pro analýzu MSP, navržené na promotorové oblasti Col4a1 zahrnující místo počátku transkripce (TSS), byly navrženy pomocí MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (doplňková tabulka S2 ). Pozice primerů (vzhledem k TSS pro Col4a1, označené jako plus 1) použitých pro analýzu MSP jsou následující: M fw (-35, -14), M rev (plus 44, plus 64), U fw (-35, -14) a U rev (plus 45, plus 69). Protože každý primer pokrývá 2 CpG, byly testovány celkem 4 CpG na methylační stav na pár primerů. Reakční směs pro MSP obsahovala Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng bisulfitově konvertované DNA a 0,5 μM každého primeru specifického pro methylovanou (M) a nemethylovanou (U) DNA v konečném objemu 10 μl. MSP bylo provedeno na systému QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems). Podmínky cyklování PCR byly následující: počáteční denaturační kroky při 95 stupních/10 min a následované 40 cykly denaturace při 95 stupních/15 s a žíhání a prodlužování při 58 stupních/60 s. Relativní hladina methylované DNA byla vyjádřena pomocí metylačního indexu definovaného jako 2 (demethylovaný cyklus Ct) − (metylovaný cyklus Ct) [27].

2.9. Statistická analýza.Data byla vyjádřena jako průměr ± SD (standardní odchylka) pro všechny studované parametry. Studentův t-test byl použit k porovnání průměrů normálně rozdělených proměnných mezi dvěma skupinami. Statistické rozdíly mezi skupinami byly analyzovány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA), následované Tukeyho vícenásobným srovnávacím testem pomocí GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

3. Výsledky

3.1. Vliv ALA na biochemické indexy u diabetických potkanů.Glukóza, triglyceridy, močovina a kreatinin byly stanoveny v séru kontrolních, diabetických a ALA léčených nediabetických a diabetických potkanů ​​(obrázek 1). Diabetický stav byl sledován 4 týdny a 8 týdnů, aby byl zahrnut časový průběh nutný k manifestaci škodlivých procesů. Obě skupiny diabetických potkanů ​​byly charakterizovány hyperglykémií, stoupajícími trendy hladiny triglyceridů a kreatininu, avšak bez statistické významnosti, a významně zvýšenými hladinami močoviny. U diabetických potkanů ​​vedla 4týdenní léčba ALA ke snížení hladiny glukózy v séru na kontrolní hodnotu, zatímco po 8 týdnech hladina glukózy klesla, ale stále zůstala významně zvýšená ve srovnání s kontrolami. V obou diabetických skupinách léčených ALA se triglyceridy a kreatinin významně nezměnily. Léčba ALA významně snížila hladinu močoviny u diabetických potkanů ​​po 4 týdnech, zatímco po 8 týdnech sérová hladina močoviny u diabetických potkanů ​​klesla ve srovnání s diabetickými kontrolami, ale bez statistické významnosti. Podávání ALA kontrolním krysám významně neovlivnilo zkoumané biochemické parametry.

3.2. Morfologické hodnocení struktury ledvin a tvorby CML po léčbě ALA.Barvení PAS zvýraznilo charakteristické renální histopatologické rysy spojené s diabetem (obrázek 2(a)). Ztluštění glomerulární bazální membrány se objevilo po 4 týdnech nástupu diabetu, zatímco expanze mezangiální matrix a tubuly s rozšířeným lumen byly pozorovány po 8 týdnech nástupu diabetu. Histologická analýza odhalila, že tubulární lumen, glomerulární a mezangiální matrix se významně zvýšily u 8týdenních diabetických potkanů ​​ve srovnání s kontrolními potkany a kontrolními potkany léčenými ALA. Po léčbě ALA se však tubulární dilatace a expanze mesangiální matrix významně snížily, ale stále zůstaly nad kontrolními hodnotami, zatímco glomerulární oblast se zcela vrátila na kontrolní úrovně. U kontrolních potkanů ​​léčených ALA bylo zjištěno, že frakce mezangiální matrice byla zvýšena, což naznačuje, že dlouhodobé užívání ALA by mohlo ovlivnit některé strukturální rysy vledviny(Obrázek 2(a)).

AGE jsou patogenní faktory, které přispívají k poškození ledvin u diabetu. Aby bylo možné zkontrolovat, zda ALA ovlivňuje akumulaci produktů AGE vledvinyu diabetických potkanů ​​byl renální obsah CML hodnocen imunohistochemickým barvením u kontroly, diabetických potkanů ​​(4 a 8 týdnů) a kontrolních potkanů ​​léčených ALA a diabetických potkanů ​​(4 a 8 týdnů) (obrázek 2(b)). Barvení na CML bylo pozitivní u obou skupin diabetických potkanů, což odhalilo, že CML se hromadí hlavně v tubulointersticiu a v menší míře v glomerulech. Podle kvantifikace obsahu CML byly tyto změny statisticky významné ve srovnání s odpovídajícími kontrolami (obrázek 2(b)). Po léčbě ALA diabetických potkanů ​​(4 a 8 týdnů) se jak tubulointersticiální, tak glomerulární CML imunoreaktivita výrazně snížila, zatímco u kontrolních potkanů ​​léčených ALA zůstala pozitivita CML nedetekovatelná jako u kontrol.

3.3. Vliv ALA na ukládání kolagenu a expresi genu Col4a1.Barvení Massonovým trichromem odhalilo ukládání kolagenu v tubulointersticiálních oblastech a v glomerulech, zejména v bazálních membránách obou kompartmentů u diabetických (4 a 8 týdnů) skupin krys (obrázek 3(a)). Léčba ALA (4 a 8 týdnů) u nediabetických potkanů ​​byla také spojena se zvýšenou depozicí kolagenu charakterizovanou glomerulárními a tubulointersticiálními oblastmi obsazenými matricí barvenou kolagenem, ale bez statistické významnosti. U diabetických potkanů ​​léčených ALA (4 a 8 týdnů) depozice kolagenu trvale zůstávala, protože nebyl detekován signifikantní pokles ve srovnání s diabetickými potkany. Pro ověření zvýšení syntézy kolagenu byla hladina exprese genu Col4a1 hodnocena pomocí RT-PCR (obrázek 3(b)). Bylo zjištěno signifikantní zvýšení exprese genu Col4a1 v ledvinách diabetických potkanů ​​v obou časových bodech, stejně jako v ledvinách diabetických a nediabetických potkanů ​​léčených ALA z obou experimentálních skupin (4 a 8 týdnů) ve srovnání s příslušnými kontrolami. .

3.4.Profibrotické změny spojené s diabetem a léčbou ALA.Analýza Western blot odhalila, že hladina proteinu TGF{0}} se po 4 týdnech významně neměnila bez ohledu na léčbu (obrázek 4(a)). Po 8 týdnech diabetu však byla detekována statisticky významná indukce TGF- 1 proteinu, která byla mírně snížena léčbou ALA, ale zůstala významně zvýšená ve srovnání s kontrolou. Kromě toho byla podobná indukce TGF- 1 pozorována u nediabetických zvířat léčených ALA (obrázek 4(a)). Aby se zjistilo, zda byla indukce TGF- 1 doprovázena výskytem fibrotických markerů, byla přítomnost SMA analyzována pomocí Western blotu (obrázek 4(b)). Diabetický stav spustil expresi SMA, která byla detekována od čtvrtého týdne po začátku diabetu a dále. Léčba ALA u diabetických potkanů ​​snížila SMA na kontrolní úroveň po 4 týdnech, ale po 8 týdnech byla neúčinná. Léčba ALA neovlivnila SMA u nediabetických potkanů ​​po 4 týdnech, zatímco po 8 týdnech vedla ke zvýšené expresi SMA vzhledem ke kontrole, ale toto zvýšení nebylo statisticky významné (obrázek 4(b)).

Léčba nediabetických potkanů ​​pomocí ALA měla za následek podobné otisky týkající se profibrotických rysů ve srovnání s diabetickými potkany, což ukazuje na potřebu odhalit mechanismy, které jsou základem pozorovaných fibrotických změn v ledvinách u nediabetických potkanů ​​léčených ALA. Aby bylo možné prozkoumat možnost, že epigenetické modifikace představují další mechanismy zapojené do pozorované profibrotické krajiny indukované ALA u nediabetických potkanů, v konkrétním zvýšení exprese Col4a1 byly ledviny kontrolních a nediabetických potkanů ​​léčených ALA dále podrobeny analýze stavu methylace DNA. .

3.5. Vliv ALA na stav methylace DNA.Globální úroveň methylace DNA a genové exprese hlavních hráčů podílejících se na methylaci DNA (Dnmt1, Dnmt3a a Dnmt3b) a demetylaci (Tet1) byla hodnocena v ledvinách nediabetických kontrolních potkanů ​​a potkanů ​​léčených ALA po dobu 4 a 8 týdnů (obrázek 5 ). Pouze hladina Tet1 mRNA vykazovala statisticky významný nárůst po 8 týdnech léčby ALA, zatímco exprese Dnmts a globální úroveň metylace DNA nevykazovaly významný rozdíl ani po 4 nebo 8 týdnech léčby ALA ve srovnání s kontrolami.

Další experiment byl zaměřen na zkoumání lokální úrovně metylace DNA genu Col4a1. Hlavní forma kolagenu IV obsahuje dva řetězce 1(IV) a jeden řetězec 2(IV), kódované geny Col4a1 a Col4a2, které jsou uspořádány v orientaci hlava-hlava tvořící jedinečnou transkripční jednotku a transkribované v různých směrech od vzájemného promotor [17]. Col4a1 je transkribován ze 130 bp dlouhé intergenové oblasti obsahující dvě místa Sp1, CAAT a CTC boxy [17] (obrázek 6(a)). Stav methylace DNA promotoru Col4a1/Col4a2 byl hodnocen pomocí analýzy MSP a pozice primerů je znázorněna na obrázku 6(a). Oba páry primerů, specifické pro methylovanou a nemethylovanou DNA, pokrývaly 2 CpG na primer. Výsledky MSP ukázaly, že ALA neovlivnila methylační stav promotoru Col4a1/Col4a2 po 4-týdenní léčbě (obrázek 6(b)). Po 8 týdnech léčby ALA byl však pozorován statisticky významný pokles indexu metylace DNA (obrázek 6(b)), což naznačuje potenciál ALA modulovat expresi Col4a1 během změny vzoru methylace DNA jeho promotoru.

4. Diskuze

Vzhledem k epidemickému podílu diabetu se DKD stává celosvětově nejčastější příčinou terminálního onemocnění ledvin a nejindikativnějším faktorem předčasné mortality u pacientů s diabetem [28, 29]. Výskyt DKD u diabetiků se v posledních desetiletích nesnížil navzdory intenzivní léčbě zaměřené na kontrolu krevního cukru [28, 30]. Mezi potenciální léčebné strategie, které prokázaly přínos proti DKD, je cílení na oxidační stres a v tomto termínu bylo zjištěno, že ALA může zlepšit renální funkce u diabetu [29, 31, 32]. Výsledky získané v této studii potvrdily hypoglykemické účinky ALA, ale ukázaly na neúčinnost ALA proti narušeným hladinám močoviny u dlouhodobého diabetu.

Zvýšení glykémie samotné nebo v kombinaci s oxidačním stresem je jedním z mechanismů podílejících se na vzniku AGE, jejichž akumulace v glomerulárních a tubulointersticiálních kompartmentech korelovala se stupněm renálního poškození v experimentálním modelovém systému diabetické nefropatie [33, 34]. . CML je jedním z hlavních AGE in vivo [35], jehož hladina se zvyšuje v oběhu a orgánech včetně ledvin diabetických pacientů [36] a hraje důležitou roli v patogenezi diabetické nefropatie [37]. Naše výsledky ukázaly, že depozice CML se hromadí především v tubulointersticiálním a v menší míře v glomerulárním kompartmentu ledviny diabetického potkana, který se po léčbě ALA výrazně snížil. Podle publikovaných údajů by tubuly obohacené o CML mohly být nejvážněji poraněným renálním kompartmentem [38–40]. V rozporu s naším výsledkem byly popsány omezené účinky ALA na obsah CML u diabetických potkanů, detekované imunobarvením i chemickou analýzou [40] a tato nekonzistence může vyplynout z experimentálního uspořádání studie.

Histologická analýza struktury ledvin pomocí barvení PAS potvrdila ochranné účinky ALA u diabetu. Příznivé antioxidační účinky ALA proti oxidačnímu poškození ledvin vyvolanému diabetem byly dobře prokázány [22, 31, 32]. Bylo zjištěno, že léčba ALA zabraňuje renální insuficienci a zmírňuje renální strukturální patologické změny včetně expanze glomerulární mesangiální matrix a glomerulosklerózy díky jejímu kombinovanému antioxidačnímu a hypoglykemickému potenciálu [21, 22]. Vzhledem k tomu, že vysoká glukóza, oxidační stres a tvorba AGE jsou považovány za důležité faktory pro indukci profibrotických změn v ledvinách [41], dobře zavedené antioxidační a hypoglykemické účinky a schopnost ALA snižovat obsah CML, silně podporuje potenciál ALA zmírňovat fibrotický proces v diabetických ledvinách. Naše výsledky však odhalily, že v Massonově obarvených řezech ledvinové tkáně se stupeň ukládání kolagenových vláken po léčbě ALA u diabetických potkanů ​​významně nezměnil. Navíc léčba ALA ukázala tendenci zvyšovat syntézu/obsah kolagenu u nediabetických potkanů. V souladu s našimi zjištěními byly popsány škodlivé účinky ALA na kontrolní/zdravé ledviny [42]. Při studiu renoprotektivních mechanismů ALA u diabetické nefropatie autoři neočekávaně zjistili, že léčba ALA byla spojena s rozvojem glomerulosklerózy, tubulointersticiální fibrózy a poklesem renálních funkcí u nediabetických ledvin. Nezávislé studie odhalily, že vyšší dávky ALA vyvolávají oxidační poškození proteinů u starých potkanů ​​[43] a dokonce pokles renálních funkcí u diabetu [40]. V souladu s tím byl prooxidační účinek ALA prokázán nejen ve studiích na zvířatech, ale také u pacientů trpících konečným stádiem renálního onemocnění, kterým bylo intravenózně podáváno železo [44].

V kontextu pozorovaných účinků ALA na ukládání kolagenu naše výsledky navíc ukázaly, že ALA nesnížila hladinu dvou fibrotických markerů, TGF{0}} a -SMA, u diabetických potkanů ​​po 8 týdnech a dokonce indukovala TGF - 1 exprese u nediabetických potkanů ​​po 8 týdnech léčby. V souladu s tím byla genová exprese kolagenu typu IV signifikantně vyšší u diabetiků i u diabetických a nediabetických potkanů ​​léčených ALA ve srovnání s kontrolami. Již dříve bylo prokázáno, že oxidační stres indukuje TGF- 1 a jeho následné cílové geny, jako je kolagen typu I, III a IV, a také fibronektin [9, 45] a že antioxidanty potlačují TGF{{ 10}} výraz [46]. Na rozdíl od obecné představy o ochranné a antifibrotické úloze antioxidantů naše výsledky naznačují, že ALA by mohla mít mnohočetné účinky na faktory zapojené do fibrotického procesu v diabetických ledvinách. Zdá se, že ALA specificky indukuje expresi některých genů souvisejících s fibrózou, jako je TGFB1 a zejména Col4a1, jejichž zvýšená exprese byla detekována již po 4 týdnech léčby ALA v diabetických a nediabetických ledvinách. Po léčbě ALA v lidských dermálních fibroblastech byla pozorována zvýšená exprese a ukládání kolagenu typu I [24]. Studie odhalila, že upregulace kolagenu typu I je výsledkem downstream signalizace TGF-receptoru I, což naznačuje nový farmakologický účinek ALA zapojený do stárnutí kůže. Vezmeme-li v úvahu zde prezentované výsledky, upregulace kolagenů může být běžnou buněčnou odpovědí na ALA spíše než specifickým mechanismem charakteristickým pro dermální fibroblasty.

Syntéza kolagenu typu IV je regulována na dobře zavedených transkripčních, posttranskripčních a posttranslačních úrovních, ale objevují se další údaje týkající se role metylace DNA v expresi Col4a1. Studie provedená před 40 lety odhalila, že léčba buněk teratokarcinomu F9 pomocí DNA demetylačního činidla 5-azacytidin vede ke zvýšené expresi Col4a1, což poprvé naznačuje, že metylace DNA může hrát důležitou roli v jeho expresi [47]. Studie lidského methylomu a transkriptomu odhalily korelaci metylace promotoru Col4a1 s jeho expresí ve zdravých a jaterních buňkách aktivovaných k produkci ECM proteinů [20, 48]. Totéž bylo nalezeno v mezangiálních buňkách, kde po léčbě 5-azacytidinem hladiny mRNA Col4a1 významně vzrostly [49]. Navíc u pacientů s chronickým onemocněním ledvin bylo zjištěno, že hladina metylace DNA genů Col4a1 a Col4a2 je významně nižší ve srovnání se zdravými subjekty a v korelaci se zvýšenou expresí mRNA a proteinů [50]. Naše výsledky potvrdily silný důkaz regulace exprese Col4a1 prostřednictvím metylace DNA, protože jsme zjistili, že exprese Col4a1 koreluje se stavem metylace jeho promotoru v ledvinách. Je třeba poznamenat, že pozorované změny v methylačním stavu promotoru Col4a1 s největší pravděpodobností ovlivňují také expresi Col4a2, protože dva geny jsou regulovány prostřednictvím vzájemné obousměrné promotorové oblasti. MSP primery použité v našich experimentech byly navrženy tak, aby se částečně překrývaly se dvěma vazebnými místy Sp1 a snížení methylace DNA, které jsme pozorovali po ošetření ALA, by se mohlo odrážet na zlepšené vazbě Sp1 a upregulaci exprese Col4a1.

Naše zjištění, že exprese Col4a1 a její methylační stav jsou náchylné k působení ALA u nediabetických zvířat po 8 týdnech léčby ALA, navíc naznačuje potenciál ALA působit také jako epigenetický regulátor. Podle našich výsledků ovlivnila ALA enzym Tet1 po 8 týdnech léčby směrem k jeho zvýšené expresi, což naznačuje možnost, že by mohlo dojít k genově specifické demetylaci bez detekovatelného čistého efektu na metylaci DNA v celém genomu. Ačkoli existuje korelace mezi zvýšenou expresí Col4a1 a sníženou methylací jeho promotoru po 8 týdnech léčby ALA, přesto je obtížné jednoznačně uvážit, že demetylace DNA je jedinou příčinnou souvislostí mezi léčbou ALA a zvýšenou expresí kolagenového genu. po 4 týdnech nebyla zvýšená exprese Col4a1 spojena se změnou jeho methylačního stavu. Schopnost ALA regulovat určité geny epigeneticky byla navržena pro geny IL-1 a IL-6, jejichž down-regulované hladiny mRNA a proteinů byly spojeny s hypermethylací jejich promotorových oblastí [51, 52]. Ačkoli byla hypermetylace navržena jako jeden z mechanismů působení ALA, podrobné cesty epigenetické regulace řízené ALA nebyly dosud objasněny a čekají na potvrzení i pro ostatní geny. Spojení mezi zvýšenou syntézou/depozicí kolagenu, která může vést k patologickému fenotypu, a Tet zprostředkovanou DNA demethylací promotoru Col4a1 vyvolanou léčbou ALA tedy vyžaduje další prokázání a měla by poskytnout platformu pro budoucí studie.

5. Závěry

Ochranná role ALA proti poruchám funkce různých orgánů včetně ledvin souvisejících s diabetem je většinou připisována jejím antioxidačním a hypoglykemickým účinkům. Výsledky prezentované v této studii však naznačují, že renální ochrana u diabetu ALA by mohla být omezena v důsledku zvýšené syntézy/ukládání kolagenu v ledvinách. Analýzou účinků ALA na profibrotické procesy v ledvinách diabetických potkanů ​​jsme zjistili, že ALA nesnižuje ani syntézu kolagenu, ani profibrotické markery. Navíc léčba ALA přispěla k profibrotickým příhodám a syntéze kolagenu i v ledvinách nediabetických potkanů, což částečně souvisí se změnami stavu metylace DNA genu Col4a1. V důsledku toho je u pacientů s renální fibrózou zapotřebí opatrnosti při použití ALA, aby se předešlo zhoršení stávající renální komplikace. Navíc je třeba opatrnosti, pokud má být ALA použita ke zvýšení antioxidačního potenciálu u zdravého člověka nebo při léčbě jiných diabetických komplikací, protože příznivé účinky na jednu komplikaci by mohly být škodlivé pro druhou.

1Katedra molekulární biologie, Institut pro biologický výzkum "Siniša Stanković, " Národní institut Republiky Srbsko, Univerzita v Bělehradě, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Bělehrad, Srbsko

2Oddělení cytologie, Institut pro biologický výzkum "Siniša Stanković, " Národní ústav Republiky Srbsko,

Univerzita v Bělehradě, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Bělehrad, Srbsko

Korespondence by měla být adresována Aleksandře Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Přijato 4. listopadu 2020; Revidováno 19. února 2021; Přijato 27. února 2021; Publikováno 12. března 2021

Akademický redaktor: Alin Ciobica

Copyright © 2021 Nevena Grdović et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.

Dostupnost dat

V článku jsou zahrnuta všechna relevantní data použitá k podpoře zjištění této studie.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti se zveřejněním tohoto příspěvku neexistuje žádný střet zájmů.

Příspěvky autorů

Koncepce a design experimentů: MM, NG, AU; Manipulace se zvířaty a ošetření: MĐ, JAJ, AU, SD; Provedena histologická analýza, Imunobarvení a kvantifikace výsledků: JAJ, MĐ, ST. Provedená analýza Western blot: AU, SD, NG; Provedli experimenty RTqPCR: JR, MĐ; Provedeny experimenty methylace DNA: JR, AT, MV; Statistická analýza: NG; Interpretace dat a příprava obrázků: NG, MM; Příspěvek napsal: NG, AU; Kritická revize rukopisu: MV, SD. Všichni autoři schválili konečnou verzi k publikaci.

Poděkování

Tato práce byla podpořena Ministerstvem školství, vědy a technologického rozvoje Republiky Srbsko (grant č. 451-03-9/2021-14/200007).

Doplňkové materiály

Doplňková tabulka S1: Sekvence primerů použitých pro kvantitativní PCR analýzu v reálném čase Col4a1 (alfa 1 řetězec kolagenu typu IV), Dnmt1 (DNA methyltransferáza 1), Dnmt3a (DNA metyltransferáza 3 alfa), Dnmt3b (DNA methyltransferáza 13 beta), Tet113 beta (Tet methylcytosindioxygenase 1) a Actb (Aktin, beta) genová exprese. Doplňková tabulka S2: Sekvence primerů pro MSP analýzu methylace DNA promotorové oblasti genu Col4a1. Doplňkový obrázek S1: Reprezentativní snímky imunoblotu. Hladiny proteinu TGF- 1 (A) a SMA (B), dvou proteinů souvisejících s fibrózou, v ledvinách potkanů ​​léčených nebo neléčených ALA, kontrolních a diabetických potkanů, 4 a 8 týdnů po indukci diabetu, stanovené Western blotová analýza. (doplňkové materiály)

Reference

[1]RC Atkins, "epidemiologie chronického onemocnění ledvin," Kidney International. Dodatek, sv. 67, s. S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho a B. Masala, "Antioxidační strategie v managementu diabetické neuropatie," BioMed Research International, sv. 2015, ID článku 515042, 15 stran, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu a QB Li, "Terapeutické strategie diabetické nefropatie: nedávný pokrok a budoucí perspektivy," Drug Discovery Today, sv. 20, č. 3, s. 332–346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Anti-fibrosis therapy and diabetic nephropathy," Current Diabetes Reports, sv. 12, č. 4, s. 414–422, 2012.

[5]S. Yamagishi a T. Matsui, "Advanced glycation end products, oxidative stress, and diabetic nephropathy," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sv. 3, č. 2, s. 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal a P. Boor, "Extracelulární matrix v ledvinách: zdroj nových neinvazivních biomarkerů ledvinové fibrózy?", Fibrogenesis & Tissue Repair, sv. 7, č. 1, str. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono,A. Casaretto a FN Ziyadeh, "Klíčová role systému transformujícího růstového faktoru-beta v patogenezi diabetické nefropatie," Renal Failure, sv. 23, s. 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu a FN Ziyadeh, "Trankripční aktivace transformačního růstového faktoru- 1 v kultuře mesangiálních buněk vysokou koncentrací glukózy," Kidney International, sv. 54, č.p. 4, s. 1107–1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "Integrin-linked kinase mediates the peroxid vodík-dependent transforming growth factor- 1 up-regulation," Free Radical Biology & Medicine, sv. 61, s. 416–427, 2013.

[10]K. Sharma a TA McGowan, "TGF- při diabetickém onemocnění ledvin: role nových signálních drah," Cytokine & Growth Factor Reviews, sv. 11, č. 1-2, str. 115–123, 2000.

[11]FJ Lopez-Hernandez a JM Lopez-Novoa, "Role of TGF- in chronická choroba ledvin: integrace tubulárních, glomerulárních a vaskulárních efektů," Cell and Tissue Research, sv. 347, č.p. 1, s. 141–154, 2012.

[12]PD Yurchenco a JJ O'Rear, "Basal lamina Assembly," Current Opinion in Cell Biology, sv. 6, č. 5, s. 674–681, 1994.

[13]A. Nerlich a E. Schleicher, "Imunohistochemická lokalizace složek extracelulární matrix v lidských diabetických glomerulárních lézích," The American Journal of Pathology, sv. 139, č.p. 4, s. 889–899, 1991.

[14]RM Mason a NA Wahab, "Extracelulární matrix metabolismus u diabetické nefropatie," Journal of the American Society of Nephrology, sv. 14, č. 5, s. 1358–1373, 2003.

[15]RE Gilbert, A. Cox, LL Wu a kol., "Exprese transformujícího růstového faktoru-beta 1 a kolagenu typu IV v renálním tubulointerstitiu u experimentálního diabetu - účinky inhibice ACE," Diabetes, sv. 47, č.p. 3, s. 414–422, 1998.

[16]MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita a kol., "Syntéza kolagenu typu III a kolagenu typu IV tubulárními epiteliálními buňkami u diabetické nefropatie," Pathology, Research and Practice, sv. 191, č.p. 11, s. 1099–1104, 1995.

[17]JP Grande, DC Melder, DL Kluge a ED Wieben, "Struktura promotoru krysího kolagenu IV," Biochimica et Bio-Physica Acta, sv. 1309, č.p. 1-2, str. 85–88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti a kol., "Narušení vazebného místa miR-29 vedoucí k upregulaci COL4A1 způsobuje pontinní autosomálně dominantní mikroangiopatii s leukoencefalopatií," Annals of Neurology, sv. 80, č. 5, s. 741–753, 2016.

[19]M. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk a E. Dimitriadis, „nadměrná exprese miR-29c a downregulace COL4A1 v neplodném lidském endometriu snižuje adhezní kapacitu epiteliálních buněk endometria _in vitro{5}} implikující role v vnímavosti,“ Scientific Reports, sv. 9, č. 1, str. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner a kol., "Genomová analýza methylace DNA a vzorů genové exprese v purifikovaných, nekultivovaných lidských jaterních buňkách a aktivovaných jaterních hvězdicových buňkách," Oncotarget, sv. 6, č. 29, s. 26729–26745, 2015.