Lipidomika odhaluje změny renálních lipidů vyvolané cisplatinou během akutního poškození ledvin a jejich útlum cilastatinem
Feb 21, 2022
Abstraktní: Nefrotoxicita je hlavní komplikací chemoterapie na bázi cisplatiny, která vede k akutníporanění ledvinv ca. 30 procent pacientů bez preventivního zásahu nebo léčby dostupné pro klinické použití. Cilastatin nedávno vstoupil do klinických studií a prokázal nefroprotektivní účinek při terapiích cisplatinou na modelech in vitro a in vivo. Hlubší porozumění na molekulární úrovni indukované cisplatinoupoškození ledvina účinek potenciálních ochranných látek by mohl být klíčový pro vývoj úspěšných nefroprotektivních terapií a pro vytvoření nových biomarkerůpoškození ledvinanefroprotekci. Cílený lipidomický přístup pomocí LC-MS/MS byl použit pro kvantifikaci 108 druhů lipidů (zahrnujících fosfolipidy, sfingolipidy a volný a esterifikovaný cholesterol) vledvinaextrakty kůry a dřeně z krys léčených cisplatinou a/nebo cilastatinem. Bylo zjištěno, že až 56 a 63 druhů lipidů bylo změněno v kůře a dřeni po léčbě cisplatinou. Současná léčba cilastatinem zmírnila mnoho z těchto změn lipidů, buď zcela nebo částečně s ohledem na kontrolní hladiny. Multivariační analýza odhalila, že lipidové druhy lze použít k rozlišenípoškození ledvinanefroprotekciestery cholesterolu jsou nejrozlišovanějšími druhy spolu se sulfatidy a fosfolipidy. Potenciální diagnostické biomarkery indukované cisplatinou poškození ledvina cilastatinnefroprotekcibyly také nalezeny.
klíčová slova:lipidomika; cisplatina; akutní poškození ledvin; cilastatin; nefroprotekce; biomarkery; estery cholesterolu; sfingolipidy; fosfolipidy; chemoterapie
Úvod Nefrotoxicita je závažným vedlejším účinkem chemoterapie cisplatinou [1], s akutníporanění ledvin(AKI) vyvíjený v ca. 30 procent léčených pacientů [2]. To je také hlavní faktor omezující dávku a důležitý nedostatek terapií na bázi cisplatiny, jedné z nejdůležitějších léčebných postupů u solidních nádorů [2]. Cisplatina se hromadí a způsobuje poraněníledvinovéepiteliální buňky proximálního tubulu (RPTEC) a poškození se lokalizuje zejména v segmentu S3 proximálního tubulu, sestupně zledvinovékůry směrem ke kortikomedulární junkci a zevní dřeni [3]. Bylo však také navrženo přímé poškození medulární Henleovy kličky [4,5]. V souvislosti s tím se odehrává řada buněčných událostíledvinovépoškození tubulových buněk, po vychytávání cisplatiny, včetně oxidačního stresu, nitrosativního stresu, vaskulárního poškození, zánětu, mitochondriálního poškození nebo inhibice Na plus, K plus-ATPázy v buněčné membráně a stresu endoplazmatického retikula, následovaného smrtí buněk proximálního tubulu, zejména apoptóza (zahrnující vnitřní i vnější cesty) nebo nekróza vedoucí ke ztrátěfunkce ledvin[2,6,7]. To se projevuje poklesem rychlosti glomerulární fifiltrace (GFR) a sérových hladin hořčíku a draslíku se zvýšením dusíku močoviny v krvi (BUN) a sérového kreatininu [2].
Byly zkoumány různé přístupynefroprotekciběhem terapií cisplatinou jak in vitro, tak in vivo, na základě řady molekulárních cílů [7–9]. Možné narušení cytotoxického účinku cisplatiny na nádorové buňky a často neúplný ochranný účinek však vývoj renoprotektorů omezily [9]. V důsledku toho neexistuje žádná intervence pro klinické použití, která by úspěšně předcházela nebo léčila AKI vyvolanou cisplatinou [7]. Hlubší pochopení molekulárních drah souvisejících s AKI indukovanou cisplatinou a potenciálních cílů pronefroprotekcise v tomto ohledu jeví jako zásadní.
Bylo prokázáno, že cilastatin účinně chráníledvinaod poškození způsobeného několika látkami, včetně cisplatiny [10,11], gentamicinu [12], vankomycinu [13], cyklosporinu A a takrolimu [14], v modelech in vitro i in vivo. Cilastatin uplatňuje svůj ochranný účinek selektivní inhibicíledvinovédehydropeptidáza I (DHP-I) lokalizovaná v lipidových raftech na kartáčovém lemu RPTEC [11]. V důsledku toho jsou procesy zahrnující externalizaci membrány, jako je Fas-zprostředkovaná vnější apoptóza, narušeny cilastatinem a progresepoškození ledvinpo zadržení toxického inzultu [11]. Kromě vnějšího poškození apoptózy cilastatinem bylo zjištěno snížení oxidačního stresu, zánětu a akumulace nefrotoxických sloučenin [10–13,15,16]. Tím pádem,funkce ledvinzůstává zachována při současné léčbě cisplatinou a cilastatinem [11]. V nedávné době cilastatin úspěšně dokončil fázi I klinických studií pro jeho použití jako nefroprotektoru a chystá se vstoupit do fáze II studií. Slibná nedávná studie také odhalila, že cilastatin (podávaný jako imipenem plus cilastatin) může dosáhnout renoprotektivního účinku u pacientů s peritoneální karcinomatózou během hypertermické intraperitoneální léčby cisplatinou [17].
V posledních letech se omické technologie, zejména proteomika [18,19] a metabolomika [20–23], ukázaly jako užitečné pro objev nových časných diagnostických biomarkerů AKI, kromě BUN nebo kreatininu v séru [18,20]. Metabolomická analýza může navíc poskytnout cenné informace pro pochopení mechanismů nefrotoxicity cisplatiny [5,24] a terapeutického účinku potenciálních nefroprotektorů [25–27].
Zejména lipidomika může také poskytnout relevantní informace týkající senemoc ledvin[28], uvážíme-li, že lipidy hrají klíčovou strukturální, buněčnou signalizační a metabolickou roli a mohou být změněny v buňkách, tkáních a biofluidních tekutinách.ledvinovépatologických stavů [29,30]. V tomto ohledu byly zjištěny zvýšené hladiny triglyceridů a neesterifikovaných mastných kyselinledvinaběhem léčby cisplatinou [31], navíc k tal neutrálním lipidům [32]. Zvýšené hladiny sfingolipidů – ceramidů (Cer) a hexosylceramidů (HexCer) – byly také pozorovány vledvinovékortexu během AKI indukované cisplatinou [33]. Na druhé straně bylo zjištěno, že druhy fosfolipidů, včetně fosfatidylcholinu (PC), fosfatidylethanolaminu (PE) a lysofosfatidylcholinu (LPC), jsou také změněny vledvinová tkáňnebo buňky během léčby cisplatinou [26]. Bylo také zjištěno, že hladiny různých druhů LPC byly změněny v séru potkanů po podání cisplatiny [23]. Navíc necílený semikvantitativní přístup k zobrazování pomocí hmotnostní spektrometrie umožnil porovnat distribuci lipidů u potkanůledvinasekce a navrhli, že cis platina vedla ke změnám na různých fosfolipidech (PC, PE, fosfatidylglyceroly (PG), fosfatidylinosytoly (PI), fosfatidylseriny (PS), fosfatidové kyseliny (PA)), sulfatidy (Sulf) nebo kardiolipiny) [34] (vykazuje odlišné chování v kortexu a dřeni), zatímco současná léčba cilastatinem měla tendenci některé z těchto změn zmírnit [4].
V této práci jsme šli o krok dále a blíže jsme se podívali na důležité strukturální lipidy vledvinajako jsou fosfolipidy (PC, LPC a PE), sfingolipidy (Sulf, sfingomyeliny (SM), dihydrosfingomyeliny (dhSM), Cer, dihydroceramidy (dhCer), HexCer, dihydrohexosylceramidy (dhHexCer)) a volný cholesterol (FC) a jeho esterifikovaný formy (estery cholesterolu (CE)), pokrývající nové třídy a druhy lipidů a využívající spolehlivější cílený kvantitativní přístup založený na kapalinové chromatografii spojené s analýzou tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Na obou bylo kvantifikováno celkem 108 druhů lipidůledvinovéextrakty z kůry a dřeně z léčených potkanů, aby bylo možné lépe porozumět nefrotoxickému účinku cisplatiny a nefroprotektivnímu účinku cilastatinu. Nové informace o dopadu cisplatiny spojené s AKI naledvinovébyly získány druhy lipidů a byly získány další poznatky o ochranném účinku cilastatinu, což vedlo k zeslabení některých specifických změn lipidů způsobených cisplatinou buď vledvinovékůra nebo dřeň. Různé potenciální biomarkery indukované cisplatinoupoškození ledvinanefroprotekcis cilastatinem byly také nalezeny.
Výsledek
Cilastatin ochranný účinek proti poškození ledvin vyvolanému cisplatinou
Posouzenífunkce ledvinu potkanů léčených cisplatinou a/nebo cilastatinem byla nejprve provedena za použití několika biochemických indikátorů v séru a moči. Jak ukazuje tabulka 1, sérový kreatinin, BUN, bílkoviny v moči, objem moči a frakční vylučování sodíku a draslíku byly významně zvýšeny v důsledku léčby cisplatinou ve srovnání s kontrolní skupinou, zatímco současná léčba cilastatinem a cisplatinou vedla k jejich poklesu ve srovnání s s kontrolními úrovněmi. Na druhé straně, GFR byla snížena u potkanů léčených cisplatinou s ohledem na kontrolní vzorky, zatímco současné podávání cilastatinu tento účinek snižovalo. Tyto výsledky potvrzujípoškození ledvinindukovaná cisplatinou a ochrana cilastatinem. Cilastatin samotný nevykazoval žádný účinek nafunkce ledvinparametry.
Histopatologická analýza byla také provedena v řezech barvených hematoxylinem/eosinem ke studiu morfologických změn souvisejících spoškození ledvin. Obrázek 1 ukazuje cisplatinou indukované známky poškození v proximální oblastiledvinovétubulů, včetně otoku tubulů, oddělení úlomků buněk nebo ztráty membrány kartáčkového lemu (obrázek 1C,G,I). Kumulace proteinových odlitků byla také pozorována v kortexových a medulla tubulech (obrázek 1C, resp. G). To je v kontrastu s normální morfologií pozorovanou u kontrolních nebo cilastatinových skupin v kortexu (obrázek 1A, respektive B) a dřeni (obrázek 1E, v tomto pořadí). Současná léčba cilastatinem s cisplatinou vedla k jasné redukci všech těchto cisplatinou indukovaných změn v kůře a dřeni (obrázek 1D, H, J).
Cisplatina Změna globálních tříd renálních lipidů v kůře a dřeni. Ochranný účinek cilastatinu
Celkové hladiny různých tříd lipidů, včetně sterolů (CE, FC), fosfolipidů (LPC, PC, PE) a sfingolipidů (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) byly stanoveny vledvinovékůry a dřeně, aby se vyhodnotil globální účinek cisplatiny na lipidy během AKI. Kompletní výsledky analýzy lipidů jsou uvedeny v tabulce S1. Jak je vidět na obrázku 2A,B, docela podobné trendy byly pozorovány v kůře a dřeni u všech skupin. CE a Cer byly významně zvýšeny, zatímco SM, dhSM a PE byly sníženy, a to jak v kůře, tak v dřeni během léčby cisplatinou, s ohledem na kontrolní skupiny. Mezi nimi Cer a CE trpí nejvýraznějšími pozorovanými změnami vyvolanými cisplatinou. Navíc dhCer a HexCer byly významně zvýšeny v dřeni, zatímco v kortexu byly dhHexCer zvýšeny a LPC a Sulf byly sníženy během léčby cisplatinou.
Obrázek 1. Histopatologická analýza hematoxylinem/eosinem barvenéholedvinovésekce ukazuje ochranu cilastatinu proti poškození vyvolanému cisplatinou. Obrázky jsou zobrazeny při 20násobném zvětšení pro (A) kontrolní kůru; (B) cilastatinová kůra; (C) kůra cisplatiny; (D) cisplatina plus cilastatin kortex; (E) kontrolní dřeň; (F) dřeň cilastatinu; (G) medulla cisplatiny; a (H) cisplatina plus cilastatin medulla. Měřítko od A do H představuje 100 µm. Podrobné obrázkyledvinovétubuly při 60násobném zvětšení jsou zobrazeny pro (I) cisplatinu a (J) cisplatinu plus cilastatin. Měřítko pro I a J představuje 25 um.Renálníindikátory poškození jsou zastoupeny: →: akumulace proteinových odlitků vledvinovétubuly. & oblast: otok tubulů. *: ztráta membrány kartáčového lemu. #: oddělení úlomků buněk.
Současné podávání cilastatinu a cisplatiny mělo tendenci zmírňovat některé z těchto změn lipidů vyvolaných cisplatinou, což vedlo k žádnému rozdílu s ohledem na kontrolní skupiny v případě hladin Cer a dhHexCer v kortexu nebo dhCer, HexCer, SM, dhSM a PE úrovně v dřeni. Kromě toho v případě cisplatinou indukovaného zvýšení CE v kortexu vedl cilastatin podávaný současně s cisplatinou k signifikantně sníženým hladinám ve srovnání se skupinou s cisplatinou, ačkoli u skupin s koiatrolem bylo zotavení částečné. Zbytek lipidových tříd pozměněných cisplatinou zůstal neobnoven během současné léčby cilastatisi. Na druhé straně samotný cilastatin neměl žádný vliv na kůru mozkovou a dřeňové lipiky, s výjimkou LPC a dhCer v kůře, které se zdály být snížené, respektive zvýšené, ve srovnání s kontrolní skupinou. Celkové hladiny FC, PC a dhHexCer nevykázaly žádnou významnou změnu v kůře a dřeni po léčbě cisplatinou.
Obrázek 2C,D zobrazuje korelační tepelné mapy pro lipidové třídy v kůře a dřeni, v daném pořadí, nabízející podobné trendy.
Alitace jednotlivých druhů renálních lipidů léčbou cisplatinou. Cilastatin Atenuating Egect
Estery cholesteroluAnalýza pěti jednotlivých druhů CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 a CE 22:6) provedená vledvinovékůra a dřeň odhalily, že cisplatina významně zvýšila každou z nich ve srovnání s kontrolními hladinami (obrázek 3). Na druhé straně současné podávání cilastatinu a cisplatiny vedlo k obecnému poklesu hladin jednotlivých druhů CE s ohledem na léčbu cisplatinou, což bylo statisticky významné pro všechny druhy CE v kůře a CE 18:2 v dřeni, jak lze je vidět na obrázku 3. Toto zotavení u druhů CE mozkové kůry v důsledku společného sezení cilastatinu bylo částečné ve srovnání s hladinami v kontrolní skupině, zatímco u většiny druhů medella CE (kromě CE 18:2) nebylo pozorováno žádné statisticky významné zotavení při současném podávání cilastatinu ve srovnání s cisplatinou. Kompletní výsledky statistické analýzy lipidových druhů kůry a dřeně jsou uvedeny v tabulkách S2 a S3, v daném pořadí.
Sfingolipidy: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM a SulfCelkem bylo kvantifikováno 43 druhů sfingolipidůledvinovékůra a dřeň k vyhodnocení dopadu léčby cisplatinou a cilastatinem na jejich hladiny, jak je znázorněno na obrázku 4. Pokud jde o druhy Cer (obrázek 4A), dhCer (obrázek 4B), HexCer (obrázek 4C) a dhHexCer (obrázek 4D), jako lze vidět, že léčba cisplatinou vedla k významnému nárůstu u 19 druhů z těchto čtyř tříd vledvinovékůra a dřeň. Opět platí, že současná léčba cisplatinou a cilastatinem vykazuje tendenci oslabovat účinek cisplatiny s obecným poklesem hladin lipidů změněných cisplatinou v kůře a dřeni. Ve skutečnosti u druhů dhCer (obrázek 4B) a dhHexCer (obrázek 4D) nebyl pozorován žádný rozdíl mezi skupinami léčenými cisplatinou plus cilastatinem a kontrolními skupinami pro tyto druhy změněné cisplatinou, což ukazuje na úplné zotavení. V případě Cer (obrázek 4A) a HexCer (obrázek 4C) byl tento recoeery také případem některých změněných druhů, jako je HexCer 34:1 (kůra a dřeň) a HexCer 38:1 a HexCer 42:1 (dřeň ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 a Cer 42:2 v kortexu; a Cer 34:1 a Cer 42:2 v dřeni, které jsou buď zcela nebo částečně obnoveny. Naopak léčba cisplatinou plus cilastatinem stále vykazovala významné rozdíly ve srovnání s kontrolními skupinami pro Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 a HexCer 36:1 v dřeni, bez zotavení. k mnohem lepšímu regeneračnímu účinku vyvíjenému cilastatinem v kortexu než v dřeni u Cer a HexCer.
V případě druhů SM (obrázek 4E) a dhSMt (obrázek 4F) vedla cisplatina k poklesu kůry a dřeně u druhů s nejkratším a nejdelším řetězcem, což bylo statisticky významné pro SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 a dhSM 42:1. Naproti tomu účinek pozorovaný při léčbě cisplatinou na druhy SM se středním řetězcem a dhSM v kůře a dřeni byl nárůst, který byl statisticky významný pro dhSM 36:0 (v kůře i dřeni) a dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 a SM 40:1 v dřeni. Současné podávání cisplatiny a cilastatinu mělo v mnoha případech tendenci normalizovat hladiny druhů SM a dhSM, přičemž SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 a dhSM 42:1 nevykazují žádný rozdíl s ohledem na kontrolní skupiny v dřeni. Konečně, některé druhy Sulf byly také změněny léčbou cisplatinou vledvinovékůra a dřeň, jak je znázorněno na obrázku 4G. Zatímco bylo zjištěno, že Sulf 40:1 se po léčbě cisplatinou významně zvýšil jak v kůře, tak v dřeni, jiné druhy jako Sulf-OH 40:1 nebo Sulf-OH s dlouhým řetězcem 42:2, Sulf-OH 42:2 byly sníženy v kortexu, přičemž Sulf 42:0 a Sulf-OH 42:1 byly také sníženy jak v kortexu, tak v dřeni. Cilastatin podávaný společně s cisplatinou opět vedl k mírnému zotavovacímu účinku, zejména u Sulf 40:1 (kůra a dřeň) a Sulf 40:2 a Sulf-OH 42:1 (dřeň), což nevykazovalo žádný rozdíl ve srovnání s kontrolními skupinami.
Fosfolipidy: PC, PE a LPCKvantifikace 60 druhů fosfolipidů (28 PC, 20 PE a 12 LPC) byla provedena vledvinovékůra a dřeň pro hodnocení potenciálních změn vyvolaných cisplatinou a renoprotektivního účinku cilastatinu. Výsledky pro druhy PC jsou uvedeny na obr. 5A, resp. Jak je vidět, cisplatina významně změnila až 19 druhů PC buď v kůře, nebo v dřeni. Většina těchto druhů PC byla snížena cisplatinou, s výjimkou PC 40:2, PC 40:4 a PC 34:2, které byly zvýšeny v kortexu. Frakce vysoce nenasycených druhů PC byla významně snížena jak v dřeni, tak v kůře, zatímco frakce druhů obsahujících dvě dvojné vazby byla významně zvýšena, jak je vidět na obrázku 5C,D. Léčba jak cisplatinou, tak cilastem atinem vykazovala podobné účinky jako dříve pozorované, s určitým pozorovaným tlumícím účinkem, který v některých případech vedl k úplnému obnovení hladin PC, bez významných rozdílů oproti kontrolní skupině, nebo k částečnému zotavení. Toto zotavení bylo pozorováno hlavně v roce Výsledky pro stanovení druhů PE v kůře a dřeni jsou uvedeny na obrázku 6A, resp. Celkem 16 druhů PE bylo významně změněno cisplatinou buď v kůře, nebo v dřeni, přičemž nejvyšší počet změněných druhů byl nalezen v dřeni. Ve většině případů byly druhy PE sníženy léčbou cisplatinou, kromě PE 38:2, PE 40:6 a PE 40:4, které byly zvýšeny buď v kůře, dřeni nebo v kůře i dřeni. respektive. Vzhledem k celkové délce řetězců mastných kyselin v druzích PE v dřeni bylo celkové množství PE s 34, 36 a 38 C významně sníženo s cisplatinou, zatímco druhy 40 C byly zvýšeny, jak je znázorněno na obrázku 6C. . Souběžná léčba cilastatinem s cisplatinou zmírnila většinu změn vyvolaných cisplatinou u jednotlivých druhů PE nalezených v dřeni a nabídla hladiny bez významných rozdílů ve srovnání s kontrolními skupinami u 11 z 15 druhů změněných cisplatinou v dřeni, s 2 dalšími druhy PE částečně obnovena. Avšak v kortexu byly pouze 2 z 11 druhů pozměněných cisplatinou obnoveny pomocí cilastatinu na kontrolní hladiny, přičemž 2 další druhy PE byly částečně obnoveny. Podobně jako u pozorování u druhů PC byl podíl vysoce nenasycených druhů PE významně snížen v dřeni, zatímco podíl druhů obsahujících 1-3 dvojné vazby byl významně zvýšen, jak je znázorněno na obrázku 6D.
Pokud jde o analýzu druhů LPC, většina pozorovaných změn vyvolaných cisplatinou byla nalezena vledvinovékůra, kde LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 a LPC 22:5 byly významně sníženy s vzhledem ke kontrolním vzorkům, jak je vidět na obrázku 7A. Na druhé straně bylo zjištěno, že LPC 17:1 a LPC 18:2 se zvýšily v dřeni během léčby cisplatinou (obrázek 7B). Současná léčba cisplatinou a cilastatinem neměla žádný účinek na zotavení kortexových LPC druhů. Naopak LPC 17:1 a LPC 18:2 byly získány v dřeni, bez významných rozdílů ve srovnání s kontrolními vzorky.
Renální lipidy jako klasifikační proměnné proPoškození ledvina ochrana
Byla provedena multivariační analýza s použitím všech lipidových proměnných měřených v kůře a dřeni, aby se posoudilo, zda tyto druhy mohou sloužit pro skupinovou klasifikaci a rozlišování cisplatinou indukovanépoškození ledvinanefroprotekcipomocí cilastatinu. Analýza hlavní složky (PCA) a analýza rozlišování ortogonálních projekcí k latentním strukturám (OPLS-DA) byly provedeny s použitím odděleně buď kortexových nebo medulla lipidů, jak je znázorněno na obrázku 8. PCA analýza kůry (obrázek 8A) a dřeně (obrázek 8B) lipidy nabídly modelům schopnost prokázat jasné oddělení cisplatinové skupiny s ohledem na kontrolní a cilastatinové skupiny, přičemž poslední dvě se těsně shlukují. Na druhé straně skupina léčená cisplatinou plus cilastatinem měla tendenci se oddělovat od skupiny s cisplatinou a nacházela se mezi kontrolní skupinou a skupinou s cisplatinou, což naznačuje rozdíly mezi skupinami. Všechny modely PCA vykazovaly R2 vyšší než 0,7 a hodnoty Q2 vyšší než 0,5.
Víceskupinová OPLS-DA analýza také ukázala jasně oddělené shlukování různých skupin jak pomocí lipidových proměnných kůry (obrázek 8C), tak dřeně (obrázek 8D). Modely OPLS-DA vykazovaly přijatelné hodnoty Q2 a R2 vyšší než 0.7 a ukázaly se jako platné během testování permutace pro 100 iterací, jak je znázorněno na obrázku 8E,F. Vlastnosti s proměnlivou důležitostí v projekčních (VIP) skóre vyšším než 1 lze nalézt na obrázku 8G,H, což ukazuje na lipidy kůry, respektive dřeně, které mají vyšší vliv na separaci skupin. Ty zahrnovaly různé druhy lipidů ze třídy CE, sfingolipidů a fosfolipidů. Zjistit specifické lipidové rozdíly mezi jednotlivými skupinami související s léčbou cisplatinou anefroprotekcidalší OPLS-DA analýza byla provedena odděleně s kortexovými a medulla lipidy, jak je vidět na obrázcích 9 a 10, v daném pořadí. Modely OPLS-DA byly sestaveny pro cisplatinu ve srovnání s kontrolní skupinou, cisplatinu plus cilastatin ve srovnání s cisplatinou a také cisplatinu plus cilastatin ve srovnání s kontrolní skupinou. Nejdiskriminující modely OPLS-DA byly ty mezi kontrolní skupinou a skupinami léčenými buď cisplatinou nebo cisplatinou plus cilastatinem, s ohledem na jejich nejvyšší hodnoty R2 a Q2, se správnou validací na základě výsledků permutačních testů se 100 cykly (obrázek 9A,B,D, E a obr. 10A, B, D, E).
Na druhé straně modely OPLS-DA pro skupiny s cisplatinou plus cilastatinem a cisplatinou, oba využívající lipidy kůry (obrázek 9C) nebo dřeně (obrázek 10C), také umožnily skupinovou diskriminaci s přiměřenými hodnotami R2 a Q2 a příslušné validační výsledky z 100-testů permutace cyklu (obrázky 9F a 10F), přičemž lipidy dřeně jsou ty, které představují lepší předvídatelnost. S-grafy pro různé modely OPLS-DA jsou zahrnuty na obrázku 9G,H,I a obrázku 10G,H,I, pro vlastnosti lipidů kůry nebo dřeně. Druhy s |p(corr)| vyšší než 0,5 a VIP skóre vyšší než 1 byly označeny v S-grafech jako nejrelevantnější rysy pro diskriminaci skupin. Kompletní data včetně hodnot p(corr) a VIP z modelů OPLS-DA spolu s jednorozměrnými statistikami pro každý druh lipidů lze nalézt v doplňkových tabulkách S2 (kortexové lipidy) a S3 (lipidy dřeně). Zdá se to být jasnéledvinovélipidy kůry a dřeně mohou sloužit jako rozlišovací kritéria pro indukci cisplatinoupoškození ledvina pro cilastatinnefroprotekciběhem léčby cisplatinou.
Renální lipidy jako potenciální biomarkery renálního poškození indukovaného cisplatinou Za účelem výběru potenciálních lipidových biomarkerů renálního poškození
způsobené cisplatinou, byla použita kombinace více kritérií statisticky významných hodnot p z jednorozměrné analýzy cisplatiny versus kontrolní skupiny, stejně jako hodnoty p(corr) a VIP nalezené v odpovídajícím modelu OPLS-DA. Vybrané lipidy s p-hodnotami < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(oprava)|=""> 0,5 a VIP > 1 lze nalézt v tabulce 2 (kortexové lipidy) a tabulce 3 (lipidy dřeně), kde jsou také zahrnuty násobné změny (FC) a plochy pod křivkou (AUC) pro křivky provozních charakteristik přijímače (ROC).
Jak je vidět, v tabulkách 2 a 3 jsou vybrány až 4 0 lipidy z dřeně a 27 lipidů z kůry, zahrnující CE, sfingolipidy a fosfolipidové druhy. Hodnoty AUC pro křivky ROC získané pro každý lipid byly vyšší než 0,85 a ve většině případů se blížily 1, což ukazuje na dobré rozlišovací schopnosti druhu mezi cisplatinou a kontrolními skupinami. Je pozoruhodné, že druhy CE se zvýšeným obsahem cisplatiny (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 a CE 22:6) se zdají být nejvíce diskriminující rysy jak v dřeni, tak v kůře, vykazující nejvyšší hodnoty FC, VIP, p(corr) a AUC. dhHexCer 34:0 je další zvýšený lipid v kortexu s vysokým FC a relevantním skóre. Na druhou stranu, sulfatidy jako Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 nebo Sulf-OH 42:1 jsou také docela relevantní v kůře, zatímco PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5 nebo PC 36:6 jsou také velmi důležité v dřeni, všechny jsou během léčby cisplatinou sníženy.
Renální lipidy jako potenciální biomarkery cilastatinové nefroprotekce
K výběru potenciálních lipidových biomarkerů ochrany cilastatinu proti nefrotoxicitě cisplatiny byl použit stejný přístup s více kritérii jako v části 2.5 s použitím jednorozměrné analýzy cisplatiny plus cilastatinu versus cisplatinové skupiny a hodnoty p(corr) a VIP nalezené v odpovídajících OPLS- DA model. Vybrané lipidy s p-hodnotami < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(oprava)|=""> 0,5 a VIP > 1 lze nalézt v tabulce 4 (kortexové lipidy) a tabulce 5 (dřeňové lipidy), kde byly také vypočteny FC a AUC pro ROC křivky.
Jak je vidět v tabulce 4, všechny druhy CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 a CE 22:6) v cortex lze považovat za nejúčinnější ukazatele ochrany vyvíjené cilastatinem, který současně významně snižuje změny vyvolané cisplatinou. PE 36:5 a dhHexCer 34:0 v mozkové kůře jsou také důležité potenciální biomarkery ochrany cilastatinu, zejména u cilastatinu, který prochází celkovou obnovou díky cilastatinu směrem ke kontrolním hladinám. Pokud jde o lipidy dřeně, jak ukazuje tabulka 5, bylo zjištěno vyšší množství potenciálních biomarkerů ochrany cilastatinem než v kůře. Zejména Sulf 40:2 se zdá být nejnáročnějším druhem v dřeni, vezmeme-li v úvahu jeho nejvyšší skóre FC a VIP. Byly také nalezeny různé druhy PC a PE, včetně PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 a PC 36:6, abychom jmenovali alespoň některé, kromě Cer 42:2, dhHexCer 36:0 a HexCer 34:1 jako významné biomarkery ochrany cilastatinu v dřeni. Ve všech případech byly tyto lipidy spojeny buď s částečným nebo úplným obnovením kontrolních hladin vyvolaným cilastatinem ve srovnání s jejich změněnými hladinami cisplatinou. U všech druhů byly získané hodnoty AUC pro ROC křivky vyšší než 0,85, což dokazuje jejich dobré rozlišovací schopnosti
DiskuseV této práci jsme kvantifikovali celkem 108 druhů lipidů obsahujících důležité strukturální lipidy, jako jsou fosfolipidy, sfingolipidy a cholesterol, spolu s jeho esterifikovanými formami.ledvinakůra a dřeň z krys léčených cisplatinou a/nebo cilastatinem. To bylo provedeno za účelem lepšího pochopení nefrotoxického účinku cisplatiny a ochranného účinku cilastatinu. Bylo zjištěno, že až 63 druhů lipidů bylo významně změněno v dřeni léčbou cisplatinou, zatímco 56 druhů lipidů bylo ovlivněno v kůře, což odrážípoškození ledvinv obou regionech. Ačkoli se tradičně většina studií AKI indukovaných cisplatinou zaměřuje na buňky proximálního tubulu aledvinovépoškození mozkové kůry, kde je soustředěna především akumulace léčiva, nedávné studie poukazují na skutečnost, že poškození v dřeni může být dokonce tak závažné jako v kůře, na základě testů apoptózy TUNEL [5]. To může souviset s akumulací cisplatiny v segmentu S3 proximálních tubulů [3,5], sestupně směrem k vnější dřeni, kromě potenciálního přímého a sekundárního poškození Henleovy kličky [4]. Kromě toho byla dřeň označena jako nejcitlivějšíledvinovéoblasti pro pozorování změn globálních metabolitů souvisejících s cisplatinou ve srovnání s kůrou [5]. Naše předchozí výsledky také ukázaly na přímé poškození buněk dřeně (kromě sekundárního poškození) cisplatinou, které se odráží v různých fosfolipidových a kardiolipinových alteracích [4]. Tyto nové výsledky rozšiřují tato pozorování o další druhy a třídy lipidů pozměněné cisplatinou a posilují význam poškození dřeně u AKI indukované cisplatinou.
Přestože FC vledvinanebyla významně změněna léčbou cisplatinou, jak celkový CE, tak všechny měřené jednotlivé druhy CE byly pozoruhodně zvýšeny jak v kůře (osminásobné zvýšení celkového CE) a dřeně (čtyřnásobné zvýšení celkového CE) ve spojení s cisplatinou indukovanoupoškození ledvin.Cholesterol je klíčovou složkou plazmatických membrán, interlokuje se mezi fosfolipidy a ovlivňuje fluiditu, povrchový náboj a interakce polárních hlavových skupin [35,36]. Jeho přítomnost je také zásadní v lipidových raftech, vytváří hydrofobní interakce s SM a je nezbytná pro segregaci molekul a pro řízení jejich interakce s ostatními složkami v membráně [37]. Buňky udržují rovnováhu cholesterolu mezi de novo syntézou v endoplazmatickém retikulu (ER) a vychytáváním zprostředkovaným LDL. Většina cholesterolu se nachází v plazmatické membráně, ale může také cyklovat zpět do ER, kde může být FC přeměněn (prostřednictvím esterifikace zprostředkované ACAT) na CE, který je považován za cytosolickou zásobní formu cholesterolu [36]. CE může být také hydrolyzován zpět na FC, což představuje cyklus esterů cholesterolu [36]. Skutečnost, že FC se během léčby cisplatinou nezměnila, ale CE byla zvýšena jak v kůře, tak v dřeni, svědčí o změněledvinovémetabolismus cholesterolu spojený s AKI indukovanou cisplatinou. Předchozí studie ukázaly poměrně podobná pozorování jak u buněk HK-2 lidského proximálního tubulu, tak v kůře ledvin myší během akutní ischemické chorobyporanění ledvins nezměněným FC a zvýšenými hladinami CE [36]. V tomto případě se poškození plazmatické membrány, spouštějící zvýšený přenos FC z membrány do ER, zdálo být nejpravděpodobnějším vysvětlením, což vedlo k eskalaci generace CE. V tomto ohledu se zdálo, že poškození lipidových raftů bohatých na cholesterol spíše než plazmatické membrány je účinnější při zvýšeném přenosu cholesterolu do ER [36]. V těchto předchozích studiích byla také implikována cytoprotektivní role CE. U potkanů bylo také hlášeno zvýšení hladin CEledvinovékortexu v časném stadiu diabetické nefropatie [29]. Výsledky jsou také v souladu s globálním zvýšením neutrálních lipidů vledvinovéproximální tubuly hlášené během léčby cisplatinou [32]. Naše výsledky poprvé poukazují na globální nárůst celkového CE kromě jednotlivých druhů CE, a to jak v USAledvinovékůra a dřeň během AKI indukované cisplatinou. Na druhé straně se zdá, že samotný cilastatin mírně zvýšil CE 18:0 a CE 22:6 pouze v kortexu, ačkoli celkové hladiny FC nebo CE se nezměnily. Tento mírný účinek by mohl být způsoben tím, že jeho cíl, DHP-I, se nachází v lipidových raftech v proximálním tubulu (hlavně v kortexu) a během jeho interakce může dojít k určitému malému narušení membrány. Současné podávání cisplatiny a cilastatinu na druhé straně vedlo ke snížení všech druhů CE se zvýšeným cisplatinou v kortexu, zatímco v dřeni nebyl pozorován téměř žádný účinek na zotavení, pouze s částečným obnovením CE18:2 . To ukazuje na specifické působení cilastatinu v buňkách proximálního tubulu, který má významnou ochranu před expanzí buněčné smrti související s přímým poškozením cisplatiny na plazmatické membráně a lipidových raftech v kortexu, zatímco poškození buněk související s nerovnováhou cholesterolu v celé dřeni se zdá zůstat z velké části nechráněný.
Sfingolipidy jsou aktivní lipidy, které se nacházejí hlavně v buněčných membránách a jsou poměrně bohaté na lipidové rafty [37]. Ceramidy jsou centrální metabolity metabolismu sfingolipidů, které zahrnují různé molekuly a enzymy s důležitou rolí v buněčných procesech, včetně buněčného růstu, apoptózy, diferenciace, lékové rezistence a stárnutí [38,39]. Kromě toho se sfingolipidy účastní cest souvisejících se smrtí rakovinných buněk cisplatiny a AKI [33]. Ceramidy mohou být generovány několika cestami, včetně de novo syntézy, hydrolýzy sfingomyelinu nebo recyklace komplexních sfingolipidů [38]. De novo syntéza je hlavní cestou a probíhá v ER, z palmitoyl-CoA a serinu, přes řadu enzymatických drah k produkci sfinganinu, což vede k dihydroceramidům prostřednictvím dihydroceramid syntázy (CerS). Nakonec desaturace dhCer generuje Cer [40]. SM může být také hydrolyzován sfingomyelinázami, produkující Cer. Cer může být transformován na složitější sfingolipidy v Golgiho aparátu: fosforylován za vzniku Cer-1-P, signální molekuly; přeměněn na SM působením SM syntázy; nebo glykosylované za vzniku hesoxylceramidů (glukosyl- nebo galaktosylceramidy), prekurzorů sulfatidů [38]. Cer může být také degradován na sfingosin, prekurzor sfingosin-1-fosfátu (S1P), který hraje důležitou roli při přežití a proliferaci buněk, zánětech a rezistenci vůči lékům [39]. Konečně, degradace S1P na ethanolamin a hexadecenal je výstupní cestou z této cesty [38].
Během kvantifikace sfingolipidových druhů byl pozorován globální nárůst celkových hladin Cer, dhCer, HexCer a dhHexCer během léčby cisplatinou, což bylo zvláště relevantní pro Cer. Rozdíly s ohledem na ovládáníledvinabyly zřetelnější, když byly kvantifikovány jednotlivé poddruhy, přičemž 19 z 22 druhů bylo zvýšeno buď v kůře (11 druhů) a/nebo dřeni (18 druhů) při léčbě cisplatinou. To je v souladu s předchozími pozorováními poukazujícími na nárůst Cer a HexCer u myšiledvinovékortexu související s léčbou cisplatinou [33], ale zde jsme zjistili, že tímto účinkem je ovlivněna i dřeň.
Tato pozorování mohou odrážet zvýšenou metabolickou produkci Cer/dhCer a HexCer/dhHexCer. Na jedné straně by k tomu mohlo dojít prostřednictvím zvýšené aktivity CerS, ve světle předchozích pozorování vledvinovékortexu, kde byla během léčby cisplatinou měřena aktivita CerS s dlouhým řetězcem a inhibice CerS vedla ke snížení pozorované akumulace Cer/HexCer [33]. Kromě toho cisplatinou indukované snížení hladin SM/dhSM zjištěné v kůře a dřeni naznačuje další zvýšenou produkci Cer/dhCer hydrolýzou SM/dhSM cestou sfingomyelinázy (SMase) [38], se zvláštním dopadem na Cer/dhCer s dlouhým řetězcem, to vše je u modelů AKI škodlivé [40]. To by také bylo v souladu se skutečností, že druhy Cer s dlouhým řetězcem se zdají být relevantní během AKI [40] a s předchozími pozorováními zvýšené aktivity SMázy vledvinovékůry během léčby cisplatinou [33]. Cer se účastní apoptózy indukované cisplatinou prostřednictvím signalizace ve vnitřních i vnějších drahách [39]. Ve vnitřní mitochondriální dráze způsobuje cisplatina permeabilizaci mitochondriální vnější membrány. Zvýšení Cer, spolu s jeho downstream metabolity, může přispět k této permeabilizaci a tvorba kanálů Cerem usnadňuje apoptózu v mitochondriální membráně, což umožňuje vstup Bax do vnější mitochondriální membrány a také odtok cytochrom C [39]. Externí apoptóza zprostředkovaná Fas navíc využívá receptor Fas umístěný v lipidových raftech, přičemž jeho shlukování je zprostředkováno aktivací SMázy způsobenou cisplatinou a elevací Cer [39]. Cer určuje apoptózu u AKI indukovaných cisplatinou, zatímco jejich vyrovnání prostřednictvím jejich transformace na HexCer se zdá být protektivní [33] a je spojeno s rezistencí na cisplatinu [39]. Cer generovaný ve velkém množství může také ovlivnit fyzikální vlastnosti membrán a může vytlačovat cholesterol a řídit jeho esterifikaci [35]. Na druhé straně je SM přítomna především v plazmatických membránách a má přímou asociaci s molekulami cholesterolu, zvláště důležitá v lipidových raftech [41]. Nedostatek regenerace SM by mohl být negativní pro správnou funkci membrány [41].
Sulf jsou hojné vledvina,zejména v apikální membráně distálních tubulů [42]. I když pro normální nejsou zásadnífunkce ledvinbylo zjištěno, že nedostatek Sulfu je kompenzován zvýšenou tvorbou sulfatovaných glykolipidů a cholesterolu [42]. Sulfatid je klíčovým ligandem L-selektinu vledvina,se zásadní rolí při infifiltraci monocytů doledvinaintersticium [42]. Na druhé straně myelin a lymfocytární protein (MAL) spojený s lipidovým raftem tvoří komplexy se sulfatidy a glykosfingolipidyledvinovémembrány, přispívající ke stabilizaci a třídění mikrodomén obohacených o glykosfingolipidy [42]. Naše výsledky týkající se změn sulfátu v kůře a dřeni potvrzují předchozí studie, kde se také předpokládalo, že různé druhy sulfatidů mohou být ovlivněny cisplatinou v ledvinách [34].
Všechny druhy Cer, dhCer, HexCer a dhHexCer pozměněné v kortexu cisplatinou byly částečně nebo úplně obnoveny současným podáváním cilastatinu, zatímco v dřeni nebylo získáno velké množství druhů Cer s téměř úplnou regenerací dhCer , HexCer a dhHexCer. Vezmeme-li v úvahu zapojení druhů Cer do vnější apoptózy zprostředkované Fas a její blokování vazbou cilastatinu na DHP-I v lipidových raftech v proximálním tubulu, mohlo by to vysvětlovat ochranný účinek a obnovu Cer, ke které dochází hlavně v kortexových buňkách. Pokud jde o SM, dhSM a Sulf, obnova cilastatinu se zdá být významnější v dřeni než v kortexu, což naznačuje, že sekundární poškození je narušeno působením cilastatinu v proximálních tubulech zasahujících do vnější dřeně, kde většinapoškození ledvinje koncentrovaný [4].
Fosfolipidy jsou nejhojnějším druhem v buněčných membránách, kde převládá PC a v menší míře PE, s vyšší přítomností PC v luminální straně a PE je hojnější v cytosolickém cípu [35,43]. Lysofosfolipidy jsou na druhé straně signálními druhy, které lze generovat hydrolýzou glycerofosfolipidů včetně LPC [35]. Bylo zjištěno, že většina z 60 kvantifikovaných druhů PC, PE a LPC byla změněna léčbou cisplatinou, buď v kůře nebo dřeni, přičemž PC a LPC představovaly větší množství změn v kůře, zatímco změny spojené s PE byly četnější a prominentní v dřeni. ZměnyledvinovéDruhy PC, PE nebo LPC v důsledku léčby cisplatinou jsou v souladu s dříve hlášenými pozorováními vledvinaběhem AKI [4,5,26,34,44]. Naše výsledky ukazují, že většina pozměněných druhů PE, PC a LPC byla snížena cisplatinou jak v kůře, tak v dřeni. Pokud jde o nefroprotektivní účinek cilastatinu, překvapivě byl u cisplatinou změněných lipidů pozorován vyšší stupeň částečného nebo úplného zotavovacího účinku v dřeni než v kortexu. Dalším zajímavým faktem je, že všechny druhy PC, PE a LPC se zvýšeným cisplatinou v kůře a dřeni byly získány cilastatinem, zatímco většina druhů v kůře se sníženou cisplatinou byla stále změněna během současné léčby cilastatinem. To může naznačovat vyšší stupeň přímého poškození způsobeného akumulací cisplatiny v kortexu, která zůstává nechráněná cilastatinem a vede k buněčné smrti a souvisejícímu uvolnění PC, PE (hlavní složky buněčné membrány) a LPC v apoptotických tělech a tedy snížení jejich úrovně. Naproti tomu sekundární poškození spojené s vnější apoptózou a následnou akumulací proteinového obsazení v proximálních tubulech lze chránit cilastatinem. To by znamenalo, že druhy PC, PE a LPC se v dřeni snížily a více souvisí se sekundárním poškozením buněk vyvolaným cisplatinou. Na druhé straně zvýšené druhy PC, PE a LPC mohou být spojeny buď s regenerací buněčné membrány, nebo se signalizačními procesy, které podle těchto výsledků mohou spíše souviset se sekundární vnější apoptózou způsobenou poškozením cisplatinou chráněným cilastatinem.
Kromě toho byl také pozorován pokles procenta druhů PC a PE s vysoce nenasycenými mastnými řetězci vyvolaný cisplatinou, který může souviset s procesy peroxidace lipidů a byl by redukován cilastatinem [4,10,11].
Globálně, v rámci zde kvantifikovaných druhů lipidů, byl regenerační účinek cilastatinu pozorován u 26 z 56 cisplatinou změněných lipidů v kortexu a u 50 z 63 cisplatinou změněných lipidů v dřeni. Možná to odráží vysoký stupeň lipidových změn spojených s nechráněným přímým mitochondriálním poškozením vyvolaným cisplatinou hlavně v kortexu ve srovnání s dření, přičemž více lipidových změn spojených s ochranou sekundárního poškození bylo zjištěno v celé dřeni. Navíc multivariační analýza umožnila identifikaci potenciálních nových lipidových biomarkerů pro AKI indukovanou cisplatinou a cilastatinemnefroprotekci, včetně druhů CE, Sulf, PE, PC, Cer nebo HexCer, jak je popsáno v částech 2.5 a 2.6. Z našich zjištění jsou CE 18:2 a PE 36:5 možné kandidátské biomarkery schopné rozlišit současně poškození cisplatinou a cilastatinemnefroprotekcijak v kůře, tak v dřeni. Protože je však obnova těchto dvou druhů pomocí cilastatinu částečná, vhodnějšími druhy jako biomarkery by byly dhHexCer 34:0 v kůře a Sulf 42:0 v dřeni, aby bylo možné rozlišit obapoškození ledvina ochranu, přičemž cilastatin plně obnovil své hladiny změněné cisplatinou na hladiny v kontrolní skupině. To by mohlo být extrapolováno na jakékoli poškození ledvin zprostředkované Fas/Fas ligandem, ale mělo by to být potvrzeno v budoucích studiích. V posledních letech bylo navrženo několik nových biomarkerů AKI, zejména proteiny (např. KIM-1 [45] nebo NGAL [46]). Skutečnost, že jsme našli potenciální nové biomarkery AKI indukované cisplatinou a související ochranu cilastatinem, lipidové povahy vledvinatkáně, rozšiřuje dosavadní poznatky a poskytuje doplňkové možnosti pro lepší diagnostiku, prognózu a sledování. Ve skutečnosti by kombinace detekce biomarkerů mohla být dokonce potenciálně použita jako indikace specifické AKI způsobené buď konkrétní nefrotoxickou látkou (jako je cisplatina) nebo jinou příčinou, a dokonce by bylo možné rozlišit stav/progresi onemocnění. Dalším krokem by bylo určení, zda se naše výsledky změnilyledvinovélipidové vzorce se také odrážejí v cirkulujících lipidech v krvi nebo v moči. To by umožnilo detekci biomarkerů pro cisplatinou indukovanou AKI a cilastatinnefroprotekciu pacientů schůdnější.
Změny v hladinách lipidů související s AKI vyvolané cisplatinou jsou četné a různorodé, včetně důležitých strukturálních lipidů.ledvinovéstruktura: kůra a dřeň. Útlum mnoha z těchto změn cilastatinem ukazuje jeho velký potenciál pro zlepšenífunkce ledvina snížení strukturálních změn souvisejících s lipidy v korelaci s normalizovanýmiledvinovémorfologie. Opět se cilastatin ukázal jako užitečný pro rozpoznání nechráněného přímého poškození buněk způsobeného cisplatinou a sekundárních změn souvisejících s primárním poškozením, které může být narušeno v proximálních tubulech blokádou apoptotické dráhy zprostředkované cilastatinem.
Materiály a metody
ReagencieByl použit cilastatin (laskavě poskytnutý společností Merck Sharp a Dohme SA, Madrid, Španělsko) a cisplatina (Pharmacia Nostrum (Madrid, Španělsko). {{0}},9% roztok NaCl (Braun Medical SA, Barcelona, Španělsko) byl použit pro přípravu roztoků léčiv pro podání N-dodekanoyl-D-erythro-sfingosylfosforylcholin [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glukosyl- ß-1,10-N-dodekanoyl-D-erythro-sfingosin [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodekanoyl D -erythro sfinganylfosforylcholin [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimyristoleoyl-sn glycero-3- fosfocholin [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadekanoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3- fosfocholin [LPC (17:0)] a 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamin [PE 32:2 (16:1/16:1)] byly zakoupeny od Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA). Deuterovaný N-tetrakosanoyl- D-erythro-sfingosin [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoyl D-erythro-dihydrosfingosin [dhCer (36:0-d3)] a C16-30-sulfogalaktosylceramid [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] byly získány od Matreya LLC (State College, PA, USA). Cholesterol-d7 (FC-d7) a cholesteryl-d7 palmitát [CE (16:0-d7)] byly od Sigma-Aldrich.
Používala se výhradně rozpouštědla a činidla čistoty pro HPLC nebo LC-MS, včetně methanolu (MeOH), acetonitrilu (ACN) a isopropanolu (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barcelona, Španělsko), stejně jako chloroform, dichlormethan a amonium pro maté (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Španělsko). Ultračistá voda byla získána z čisticího systému Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Španělsko).
Zvířecí modelDospělí samci potkanů wistar (WKY, Criffa, Barcelona, Španělsko) byli chováni v Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Španělsko). Ty byly udržovány za podmínek kontrolované teploty, světla a vlhkosti s volným přístupem k potravě a vodě. Léčba byla podávána intraperitoneálně, jak bylo popsáno dříve [4,11], čtyřem skupinám potkanů (n=6 zvířat na skupinu): Skupina 1: Kontrola (CNT) – 0. 9 % NaCl bylo injikováno do krysy stejným způsobem jako u skupin 3 a 4; Skupina 2: Cilastatin (CIL) – injekčně (150 mg kg 1 tělesné hmotnosti (bw) za den); Skupina 3: Injekce cisplatiny (CISPL) (jedinečná dávka 5 mg kg 1 tělesné hmotnosti v den 0); a Skupina 4: Cisplatina plus cilastatin (CISCIL) – injekcí 5 mg kg 1 tělesné hmotnosti v den 0 a injekcí cilastatinu (150 mg kg 1 tělesné hmotnosti denně). Zvířata byla usmrcena pět dní po zahájení léčby. Předtím byla 24 hodinová moč odebírána do metabolických klecí od každého potkana. Krevní sérum bylo také izolováno centrifugací. Ledviny byly vyjmuty po perfuzi 0,9% fyziologickým roztokem při 4 °C s následnou dekapsulací. Kůra a dřeň vlevoledvinaa příčně řezanou polovinou pravéledvinabyly vyříznuty, bleskově zmraženy v kapalném N2 a nakonec skladovány při t 80 ◦C. Druhá polovina zpravaledvinabyl fixován ve 4% paraformaldehydu a zalitý v parafifinu pro histologické studie.
Histologické studieBarvení hematoxilinem/eosinem (Sigma-Aldrich, Steinhem, Německo) bylo provedeno na 5 um sagitální kryseledvinasekce. Pro pořizování mikrofotografií při 20× a 60× zvětšení, pro histologické vyšetření, byl použit inverzní mikroskop IX70 (Olympus, Hamburg, Německo).
Indikátory funkce ledvinAutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, Švýcarsko) byl použit pro stanovení BUN, kreatininu, sodíku a draslíku ve vzorcích séra. Rychlost clearance kreatininu byla použita pro výpočet GFR. Celková bílkovina byla stanovena v moči metodou kyseliny sulfosalicylové [47].
Homogenizace tkání ledvinyTkáně mozkové kůry a dřeně (přibližně 50 mg každá) byly přidány do 1,5 ml plastových zkumavek se šroubovacím uzávěrem obsahujících 800 ul roztoku lyzačního pufru: 50 mM Tris–HCl pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF, 1,4 mM Na4O7M3VO, Na407M3VO a inhibitor proteázy (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) a 1,5 mm zirkoniové kuličky. Tkáně byly disagregovány na BeadBug{19}} homogenizátoru (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, USA) při 4500 otáčkách za minutu, ve třech cyklech po 90 s. Homogenát byl dále sonikován po dobu 40 s při 10 procentech amplitudy a centrifugován při 600 x g po dobu 1 minuty při 4 °C. Alikvot výsledného supernatantu byl zředěn 1:10 pro stanovení celkového proteinu proteinovým testem bicinchoninové kyseliny (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Zbytek proteinového extraktu byl skladován při t 80 °C až do lipidomické analýzy.
Lipidomická analýza pomocí LC-MS/MSLipidy byly extrahovány z tkání (ekvivalent 250 µg celkového proteinu) podle Folchovy metody [48]. Před extrakcí lipidů bylo přidáno deset mikrolitrů směsi vnitřního standardu (IS), aby se získala relativní molární kvantifikace druhů lipidů, jak bylo popsáno dříve [49]. Směs IS se skládala z následujících: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) a Sulf (34 :1), v koncentracích uvedených v tabulce S4. Lipidové extrakty byly vysušeny pod proudem dusíku a rekonstituovány ve 250 ul acetonitrilu/isopropanolu (1:1, obj.:obj.), sonikovány po dobu 10 minut a poté přeneseny do injekční lahvičky.
Pět mikrolitrů lipidového extraktu bylo injikováno do LC systému Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA). Druhy byly separovány na koloně Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, UK) pracující při 55 ◦C. Eluce byla aplikována pomocí binární směsi rozpouštědla A (60 procent acetonitrilu ve vodě, 10 mM NH4COOH) a rozpouštědla B (90 procent isopropylalkohol v acetonitrilu, 10 mM NH4COOH) a lineárním gradientem od 60 procent A do 100 procent B v 12 min a 100 procent B až 60 procent A za 8 minut, při průtokové rychlosti 0,4 ml min~1. Pro detekci lipidů byl použit přístroj QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA) se softwarem Analyst 1.6.2. Dusík byl použit jak jako sušící plyn (T: 500 °C, tlak: 30 psi), tak jako nebulizační plyn (50 psi). Detekce byla nastavena v elektrosprejovém (ESI) pozitivním módu pro všechny lipidové třídy s výjimkou Sulf, který byl analyzován v ESI negativním módu. CE a FC byly analyzovány za použití zdroje chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) v režimu kladných iontů. Cílený přístup byl použit pro detekci lipidů nastavením přechodů sledování více reakcí (MRM) pro každý druh lipidu v jejich retenčních časech (tabulka S5). Chromatogramy píku LC-MS/MS byly zpracovány pomocí softwaru Skyline verze 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, USA) [50]. Druhy lipidů byly kvantifikovány přímým srovnáním plochy pro každý druh s plochou IS pro jejich lipidovou třídu, jak bylo popsáno dříve [49]. Výsledky byly vyjádřeny jako nmol/mg proteinu. Celkové hladiny lipidových tříd byly stanoveny jako součet kvantifikovaných druhů jednotlivých lipidových tříd. Druhy lipidů byly označeny podle doporučené notace [51].
Statistická analýzaHodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) byl použit pro deskriptivní statistiku a vyhodnocení statistických rozdílů v proměnných mezi skupinami pomocí analýzy rozptylu. Pro srovnání lipidových proměnných ve dvou nepárových skupinách byly po testování normality provedeny buď parametrické (dvoustranné nepárové Studentovo t) nebo neparametrické (Mann–Whitney) testy (Shapiro–Wilk). Benjamini-Hochbergova metoda byla použita pro korekci falešných objevů (FDR) p-hodnot při porovnávání více lipidových jednotlivých druhů. Oboustranná p-hodnota < 0.05="" a="" fdr="">< 0,1="" byly="" uvažovány="" pro="" identifikaci="" statisticky="" významných="" rozdílů,="" aby="" se="" zabránilo="" chybějícím="" potenciálním="" kandidátům="" na="" biomarkery.="" násobná="" změna="" skupiny="" x="" versus="" skupina="" y="" byla="" vypočtena="" jako="" poměr="" středních="" hodnot="" pro="" proměnné="" příslušných="" skupin="">
Multivariační analýza dat (MVDA) byla provedena pomocí SIMCA verze 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Švédsko) a MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (přístup 30 2. září {{20}}21)) [52], včetně PCA bez dozoru a OPLSDA pod dozorem. Chybějící hodnoty byly nahrazeny metodou k-nejbližších sousedů. Před MVDA byly proměnné log-transformovány a škálovány podle pareto. Modely byly hodnoceny podle jejich hodnot R2 a Q2. OPLS-DA byl validován permutačním testem (100 cyklů). VIP skóre a S-grafy z modelů OPLS-DA byly použity k identifikaci relevantních proměnných v diskriminaci skupiny CISPL versus CNT, CISCIL versus CNT a CISCIL versus CISPL. Současná shoda s VIP > 1, zatížení škálováno jako korelační koeficient |p(corr)| > 0,5 a oboustranná p-hodnota < 0,05="" a="" fdr="">< 0,1="" pro="" dvouskupinové="" srovnání="" byly="" kritéria="" použitá="" pro="" potenciální="" výběr="" biomarkerů.="" hodnoty="" auc="" byly="" získány="" z="" vynesení="" roc="">
PatentyNásledující patenty částečně souvisejí s prací prezentovanou v tomto rukopisu: "Použití cilastatinu ke snížení nefrotoxicity různých sloučenin" (čísla patentů EP2,143,429 B1; US 9,216,185 B2; US 9,522,128 B2; a US9,757,349 B2). Ty jsou přiděleny Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) a licencovány FIBHGM společnosti Telara Pharma SL Telara Pharma SL aktuálně uzavřela licenční smlouvu s Arch Biopartners.