Lactobacillus Plantarum GKM3 podporuje dlouhověkost, zachování paměti a snižuje stres z oxidace mozku u myší SAMP8, část 1

Abstraktní: (1) Pozadí: S věkem podmíněný kognitivní pokles běžně ovlivňuje život starších osob se symptomy spojenými s progresivním poškozením paměti a učení. Bylo navrženo, že probiotika mohou modulovat neurologické poruchy související s věkem prostřednictvím osy střevo-mozek. (2) Metody: Ke zkoumání účinku probiotického Lactobacillus plantarum GKM3 proti stárnutí byly provedeny jak testy přežití, tak kognitivní experimenty na myším modelu SAMP8. Šestiměsíční SAMP8 (n{{1{16}}}} v každém pohlaví) byli krmeni probiotikem GKM3 v dávce 5,1 × 109 a 1,0 × 109 cfu/kg BW/den až do jejich přirozené smrti. Poté se zkoumala životnost. Tříměsíčnímu SAMP8 (n=10 v každém pohlaví) byl podáván GKM3 po dobu 14 týdnů. Poté byly zaznamenány testy chování a oxidační parametry. (3) Výsledky: Skupiny GKM3 vykazovaly významně zvýšenou latenci v testu pasivního vyhýbání a dobu úspěšného vyhýbání se v testu aktivního vyhýbání se. TBARS a 8-OHdG z mozků myší také ukázaly významné snížení ve skupinách léčených GKM3. Navíc byla zjištěna nižší akumulace amyloidního proteinu v mozcích myší SAMP8 s doplňkem GKM3. (4) Závěry: Tyto výsledky ukázaly, že L. plantarum GKM3 oddaluje proces stárnutí, zmírňuje kognitivní poruchy související s věkem a snižuje oxidační stres.

Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: myš náchylná k senescenci 8 (SAMP8); probiotika; 8-hydroxy-20 -deoxyguanosin (8-OHdG); látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS); amyloid- (A); stárnutí

1. Úvod

Problémem bylo, že kognitivní porucha trpící populací se zvětšila po nárůstu počtu starších jedinců v posledním desetiletí [1]. Podle zprávy Světové zdravotnické organizace (WHO) počet lidí s poklesem kognitivních funkcí, kterých bylo v roce 2015 více než 46,8 milionu, dosáhne v roce 2030 více než 74,7 milionu, což se během patnácti let zvýší téměř o polovinu [2]. . Stárnutí, uznávané jako silná korelace s kognitivní poruchou, je obecně považováno za spojené s oxidačním stresem, který se podílí na hromadění volných radikálů a podporuje mnoho fyziologických dysfunkcí, zejména v mozku, orgánu citlivém na kyslík, vedoucí k degenerativní symptomy, jako je ztráta paměti a pokles schopnosti učit se [3–5].

Vzhledem k tomu, že stárnutí je nevyhnutelné a jeho relativní negativní symptomy jsou komplikované, lidé vyhledávají léčbu proti stárnutí, od dietních terapií až po léčbu více než léky [6,7]. Například extrakt z kořene ženšenu (Panax quinquefolius) prokázal zlepšené kognitivní funkce a byl Korejci označen jako oblíbený [8]. Extrakt z Ginkgo biloba, další příklad, si Japonci oblíbili pro své funkce při zlepšování kognitivních funkcí a snižování oxidace [9]. Ačkoli mnoho zpráv naznačovalo, že rostlinná strava poskytuje antioxidační účinky a zpomaluje proces stárnutí, existují zajímavější zaměření na střevní mikroflóru nebo dokonce na skupinu specifických bakterií ve střevech, které by mohly metabolizovat tato nutraceutika a poskytovat pozitivní multimodulaci. účinky na hostitele, včetně dlouhověkosti [10–14]. Střevní bakterie mohou ze stravy produkovat mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA), jako je acetát, propionát nebo butyrát [15]. Děti, které konzumovaly rostlinnou enterální výživu, vykazovaly ve vzorcích stolice vyšší SCFA než normální děti [16]. Tyto SCFA mohou hrát důležitou roli v lidském gastrointestinálním epitelu [17]. Acetát může procházet hematoencefalickou bariérou a indukovat hypotalamo-neuronální aktivaci [18]. Kromě toho byl butyrát studován s ohledem na účinek potlačení zánětu tlustého střeva v lidském střevě [19]. Záleží tedy na tom, jaký druh mikrobioty či konkrétních bakterií se v lidském střevě nachází, zejména z hlediska ovlivnění tělesného zdraví a dlouhověkosti [20,21].

Střevní mikroflóra může také ovlivnit osu střevo-mozek a oddálit proces stárnutí, čímž zabrání progresi onemocnění souvisejících s věkem, jako je amnézie, demence nebo dokonce Alzheimerova choroba [22,23]. Neurotransmiter gama-aminomáselné kyseliny (GABA) by například mohl být produkován určitými bakteriálními kmeny, u kterých byla popsána proliferace epiteliálních kmenových buněk ve střevě a zlepšení depresivního chování u myší [24,25]. Se současnými podpůrnými údaji je přidání probiotik jako preventivní metody trendem u těchto neurologických poruch souvisejících s věkem [26,27].

Lactobacillus je nejběžnějším probiotikem, které vykazovalo vysokou možnost rozvoje funkční potravy, jak se v lidské potravě vyskytuje již dlouhou dobu [28]. Jednotlivé bakteriální druhy však mají jedinečné biologické aktivity, od kmene ke kmeni, které vyžadují experimentální potvrzení. V našich předchozích studiích jsme izolovali probiotický kmen Lactobacillus plantarum GKM3 z nakládaných listů (Brassica juncea), také známý jako zelenina dlouhověkosti v tchajwanské společnosti Hakka, a provedli jsme funkční studie na posílení gastrointestinálního traktu a imunity in vivo [29–31]. . Proto jsme očekávali pravděpodobnost, že L. plantarum GKM3 zmírní proces stárnutí a kognitivní poruchy související s věkem.

2. Materiály a metody

2.1. Předměty

L. plantarum GKM3 byl izolován z čínské hořčice (Brassica juncea) a konzervován v Bioresource Collection and Research Center, Taiwan (BCRC), s číslem sbírky 910787. Nejprve byl GKM3 kultivován v bujónu MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) při 37 ◦C po dobu 18 hodin ve zkumavce. S {{10}}.01% inokulací byla očkovací kultura GKM3 zvýšena v 50 l fermentoru při pH 6.0 kontrola při 37 ◦C po dobu 18 hodin s navrženým médiem (5 procent glukózy, 2 procenta kvasnicového extraktu, 0,05 procenta MgSO4, 0,1 procenta K2HPO4 a 0,1 procenta Tween 80). Poté byly fermentované bakterie sklizeny centrifugací při 3800 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, dvakrát promyty fosfátovým fyziologickým pufrem a peleta byla smíchána s 10% mlékem pro lyofilizaci. Dávky lyofilizovaného prášku L. plantarum GKM3 v této studii byly upraveny na 5,1 x 109 cfu/kg tělesné hmotnosti/den jako vysoká dávka a 1,0 x 109 cfu/kg tělesné hmotnosti/den jako nízká dávka pro myší model pomocí sondy. .

Myši P8 (SAMP8) s urychleným stárnutím byly v této studii představeny jako stárnoucí zvířecí model. Všechny myši SAMP8 byly aplikovány a udržovány při 12h cyklu tma/světlo pod 25 ± 2 °C, 65 ± 5 procent RH s potravou a vodou ad libitum. Následující experimentální postupy byly schváleny Výborem pro řízení zvířat Ministerstva výživy a výživy, Providence University (Taichung City, Taiwan), s číslem IACUC 20170629-A02.

2.2. Test přežití

V testu přežití byly šestiměsíční myši SAMP8 rozděleny do skupin 20 samic a 20 samců následovně: kontrola, skupina s vysokou dávkou GKM3 a skupina s nízkou dávkou GKM3. Ošetřovaným myším bylo denně podáváno probiotikum L. plantarum GKM3 až do jejich přirozené smrti. Živé/mrtvé myši SAMP8 v každé skupině byly zaznamenány a byla vypočtena průměrná délka života.

2.3. Návrh experimentu pro věkově podmíněné kognitivní poruchy

Tříměsíční myši SAMP8 byly umístěny pro experiment s kognitivní poruchou. Samci i samice myší SAMP8 byli seskupeni následovně (n=10 v každém pohlaví): kontrolní skupina, skupina s vysokou dávkou GKM3 a skupina s nízkou dávkou GKM3. Myším v ošetřovaných skupinách byl orálně podáván L. plantarum GKM3 po dobu 14 týdnů. Pohybová aktivita byla prováděna v 11. týdnu experimentu. Test pasivního vyhýbání a test aktivního vyhýbání se prováděly 13. a 14. týden a poté byly myši usmrceny pro biochemickou analýzu a histologické vyšetření.

2.4. Pohybová činnost

Každá myš byla umístěna do středu kyvadlové klece (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) a jejich lokomoce byly zaznamenávány analyzátorem video-cesty monitoru aktivity. po dobu 10 min. Průměrná doba pohybu myši byla analyzována každých 5 minut (s/5 min). Tento průvod byl veden za šera a ticha.

2.5. Test pasivního vyhýbání

Klec raketoplánu (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) byla rozdělena do tmavé a světlé místnosti. Mezi oběma místnostmi byly gilotinové dveře (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA). V cvičném testu pro test pasivního vyhýbání se myš byla umístěna do světlé místnosti na minutovou adaptaci a poté byla otevřena gilotinová dvířka. Když myš vstoupí do temné místnosti, dostane elektrický šok 0,5 µA po dobu 0,5 s. K šoku neustále docházelo třikrát každých pět sekund. Myš byla nahrazena stejnou operací 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin po tréninkové relaci pro test paměti, kromě toho, že nebyl aplikován žádný výboj. Byly měřeny průměrné doby pobytu myší ve světlé místnosti. Byla nastavena horní mezní doba 180 s.

2.6. Test aktivního vyhýbání

V tréninkovém testu pro test aktivního vyhýbání by myš obdržela 10 s podmíněný stimul (CS) na základě světla a zvuku a poté 5 s 0,3 mA elektrický šok (bezpodmínečný stimul, UCS), pokud myš zůstala ve stejné místnosti, zatímco při přesunu do druhé místnosti nedošlo k žádnému šoku. Každá myš měla 5 cyklů CS a UCS. Myš byla testována za stejné operace (systém CS/UCS) s 15–20minutovými intertriálními intervaly čtyřikrát denně a nepřetržitě testována po dobu čtyř dnů. Průměrná doba vyhýbání se byla měřena jako účinek paměti učení.

2.7. Analýza oxidačního stresu

Pro detekci 8-hydroxy-20 -deoxyguanosinu (8-OHdG) z mozkové mitochondriální DNA bylo extrahováno 30 mg mozkové tkáně Miniprep systémem pro extrakci genomové DNA krve a tkání (Viogene Biotek Corp., Taipei, Taiwan) a vysoce citlivý 8-OHdG Check ELISA Kit (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Japonsko) byl aplikován s absorbancí při 450 nm. Pro analýzu látek reaktivních s thiobarbiturovou kyselinou (TBARS) bylo 25 mg mozkové tkáně rozemleto s 250 ul RIPA pufru a centrifugováno při 16,000× g po dobu 10 minut při 4 ◦C. Celkem se shromáždilo 100 ul supernatantu a přidalo se 100 ul roztoku SDS a 4 ml barevného činidla, pak se před ochlazením hodinu vařilo. Ošetřené vzorky byly centrifugovány při 16,000× g po dobu 10 minut a umístěny na 30 minut při teplotě místnosti. Obsah TBARS (mM/g proteinu) z každého 150 ul vzorku byl měřen při absorbanci 535 nm se standardní křivkou.

2.8. Měření mozkového amyloidu - proteinu

Amyloid- (A) protein z řezu mozkové tkáně byl obarven metodou imunohistochemie. Procento akumulace A bylo analyzováno obrazovým systémem (Leica, Q500, Wetzlar, Německo) s mikroskopem pod 40× polem. Výpočet byl založen na procentech akumulační plochy A v celém mozku: (-plocha depozice amyloidu/celá oblast mozku) × 100 procent.

2.9. Histologie

Mozky byly vyříznuty a fixovány 10% formalínem. Hipokampální tkáň byla zpracována procesem dehydratace, čištění, infiltrace a uložení pro řezání. Poté byla tkáň oblasti hipokampu vyšetřena barvením hematoxylinem a eosinem (H&E).

2.10. Statistický

V této studii byla použita statistická stolice SPSS 19.0. Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM a vyhodnocena jednocestnou ANOVA pro srovnání průměrů mezi různými skupinami. Významný rozdíl byl uvažován, když p-hodnota byla menší než 0,05 podle Duncanových testů více rozsahů. V testu přežití byl pro analýzu použit Kaplanův–Meierův test a pro ověření rozdílů mezi skupinami byl proveden log-rank test.

3. Výsledky

3.1. Vliv L. plantarum GKM3 na test přežití SAMP8

V experimentu přežití byla pozorována délka života myší SAMP8 až do jejich přirozené smrti a dokončení všech jednotlivých záznamů trvalo 21 měsíců. Průměrná délka života neléčených samců myší SAMP8 byla 11,90 ± {{10}},18 měsíců a u samic to bylo 11,20 ± 0,21 měsíce. Ve skupinách krmených probiotiky GKM3 se průměrná délka života mužů prodloužila na 12.{31}}5 ± 0,15 měsíců a 13,50 ± 0,14 měsíců při léčbě nízkými a vysokými dávkami GKM3. Dávkově závislý účinek probiotika GKM3 na prodloužení délky života u žen mohl být také pozorován u 12,15 ± 0,21 měsíce ve skupině s nízkou dávkou a 14,30 ± 0,17 měsíce ve skupině s vysokou dávkou (data neuvedena).

Abychom shrnuli očekávanou délku života, byla odhadnuta míra přežití. S 50 procentní mírou přežití byla nízká dávka GKM3 u mužské skupiny 12,67 měsíce a vysoká dávka mužské skupiny GKM3 byla 13,33 měsíce, zatímco mužská kontrolní skupina vykazovala pouze 12,50 měsíce (obrázek 1A). Podobně jako u samic myší SAMP8, 12.00 měsíců a 15,50 měsíců s 50% mírou přežití bylo prokázáno ve skupinách krmených probiotikem GKM3 v dávce 1,0 × 109 CFU/kg tělesné hmotnosti/den a 5,1 × 109 CFU/kg tělesné hmotnosti/den; avšak 10,50 měsíce s 50% mírou přežití bylo pozorováno v kontrolní skupině žen (obrázek 1B). Samice myší SAMP8 vykazovaly kratší očekávanou délku života než samci jako základ v tomto experimentu; zajímavé je, že účinek L. plantarum GKM3 z hlediska délky života měl větší dopad na samice. Předpokládá se, že L. plantarum GKM3 může prodloužit životnost u myší SAMP8 obou pohlaví, zejména u samic.

3.2. Tělesná hmotnost, příjem potravy a příjem vody u myší SAMP8

V experimentu s věkem souvisejícím kognitivním poškozením nebyly žádné významné rozdíly ve spotřebě energie a změně hmotnosti u všech myší SAMP8 z různých léčebných skupin před usmrcením (tabulka 1). To znamená, že probiotikum GKM3 neovlivnilo tyto metabolické parametry v modelu staré myši.

3.3. Vliv L. plantarum GKM3 na udržení paměti a zlepšení učení

Test lokomoční aktivity ukázal, že mezi všemi myšími SAMP8 nebyl v prvním 5-minutovém intervalu žádný významný rozdíl, bez ohledu na pohlaví (tabulka 2). Ačkoli došlo ke snížení v druhém 5-min intervalu, ve srovnání s prvním 5-min intervalem, nedošlo k žádné významné změně mezi léčenými a neléčenými skupinami.

Testy pasivního vyhýbání se prováděly na skupinách samců a samic myší SAMP8 (obrázek 2). Během zkušebního testu nebyly mezi všemi skupinami žádné významné rozdíly (p > 0.05). Latence samců myší SAMP8 krmených probiotikem GKM3 byla významně zvýšena ve srovnání s kontrolní skupinou první den (p < 0.05) (obrázek 2A). Doba pobytu samic myší SAMP8 ve světlé místnosti se také prodloužila první den při léčbě GKM3, s hodnotou p menší než 0,05 ve skupině s nízkou dávkou a s hodnotou p menší než 0,01 ve skupině s vysokou dávkou. -dávková skupina ve srovnání s kontrolou. Po druhém dnu pasivního vyhýbacího testu však nebyly žádné významné rozdíly. Delší latence provedená ve skupině s krmením GKM3, a to jak u samců, tak u samic myší SAMP8, ukázala, že probiotikum GKM3 by mohlo přispět k udržení paměti související s věkem a zlepšení učení.

Při aktivním vyhýbání se myším bylo požadováno, aby podnikly jakékoli kroky, aby se vyhnuly škodlivému stimulu. Ve zkušební den testu aktivního vyhýbání se samci i samice myší SAMP8 krmených GKM3 vykazovali tendenci k vyšší úspěšnosti ve vyhýbání se (obrázek 3), ale nedosáhli statistického rozdílu (p > 0). 9}}5) ve srovnání s kontrolní skupinou. Výsledky prvního a druhého dne testu aktivního vyhýbání se však ukázaly, že úspěšný čas se významně zvýšil u samčích skupin s krmením GKM3 ve srovnání s neléčenými samci myší SAMP8 (obrázek 3A) (p < 0,05). Podobný výsledek byl také pozorován u ženských skupin (obrázek 3B). Zajímavé je, že mezi kontrolní a probiotickou skupinou nebyly žádné statistické rozdíly (p=0.157) ve výsledcích čtvrtého dne. To znamená, že kontrolní myši potřebovaly trénink po dobu čtyř dnů, aby dohnaly přítomnost myší krmených probiotiky. Předpokládá se, že přidání probiotika GKM3 do stravy by mohlo pomoci kognitivním schopnostem hostitele, což má dopad na vhodné chování u obou pohlaví.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】