Polycystické onemocnění ledvin

ali.ma@wecistanche.com

Část Ⅱ: Organoidy ledvin generované z erytroidních progenitorových buněk pacientů s autosomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice a kol.

Pozadí:ledvinyorganoidy byly široce získávány z komerčně dostupných indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC); byla však velkou výzvou účinně produkovat modely renálních organoidů od pacientů s autozomálně dominantní polycystickou chorobouledvinaonemocnění (ADPKD), které rekapitulují jak embryogenezi, tak mechanismy cystogeneze.

Kliknutím zobrazíte vedlejší účinky a přínos pro ledviny

Metody: Krevní erytroidní progenitory (EP) ze dvou ADPKD (autosomálně dominantní polycystickéledvinanemocných) pacientů a jednoho zdravého dárce (HC) byl použit jako srovnávací kontrola k normalizaci mnoha technických kroků pro přeprogramování EP a pro generování organoidů. EP byly přeprogramovány epizomálním vektorem na iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), které byly diferencovány na renální tubulární organoidy a poté stimulovány forskolinem k indukci tvorby cyst.

Výsledky: iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) odvozené z EP vykazovaly všechny charakteristiky pluripotence a byly schopné diferencovat se do všech tří zárodečných vrstev. 3D tubulární organoidy byly generovány z jednotlivých buněk po 28 dnech v Matrigelu. HC a ADPKD (autosomálně dominantní polycystickéledvinaorganoidy spontánně nevytvářely cysty, ale po stimulaci forskolinem byly cystám podobné struktury pozorovány v ADPKD (autosomálně dominantní polycystickéledvinachoroba) organoidy, ale ne v organoidech odvozených od HC.

Závěr: Výsledky této studie to ukázalyledvinaorganoidy byly úspěšně generovány z krevních EP buněk ADPKD (autosomálně dominantní polycystickéledvinanemoc) pacientů a zdravého kontrolního dárce. Tento přístup by měl přispět jako silný nástroj pro embryoledvinavývojový model, který je schopen rekapitulovat velmi rané patofyziologické mechanismy zapojené do cytogeneze.

PRO ROZDĚLENÍ KLIKNĚTE ZDEⅠ

Diskuse

V této studii jsme podrobně popsali postup generování ledvinových organoidů z lidských iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) získaných z krevních erytroidních progenitorových buněk pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin). Mnoho typů somatických buněk bylo úspěšně přeprogramováno na iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), včetně krevních buněk [Z]. Zde jsme se rozhodli použít krevní erytroidní progenitory jako výchozí typ buněk z řady důvodů, jako je jejich genomická integrita, epigenetická paměť a účinné přeprogramování [11,17,18]. Účinnost, kterou byly erytroidní progenitory převedeny na iPSC, byla až o dva řády lepší (7 procent -28 procent ) než účinnost diferencovaných typů krevních buněk (0.0 2 procenta -0,60 procenta) nebo fibroblasty (0,74 procenta)[Z]. Navzdory nízkému množství těchto buněk v periferní krvi je lze snadno izolovat a expandovat in vitro, aby se vytvořil dostatečný počet pro přeprogramování. Jednou z nejdůležitějších výzev při vytváření vhodných iPSC je jejich genotypová a fenotypová variabilita [6], existují však navržené technické strategie, jak takovou variabilitu obejít nebo snížit. V těchto experimentech jsme k přeprogramování použili neintegrující epizomální systém, který nevyžaduje integraci genomu pro expresi přeprogramovaných genů [10], což umožňuje menší imunogenicitu a činí buňky více geneticky stabilnějšími [19,20]. Navíc všechny vzorky byly odvozeny ze stejného zdroje, což pomáhá minimalizovat epigenetickou variabilitu [12] za předpokladu, že diferenciace výchozí buňky by mohla ovlivnit účinnost konečných výsledků. Analýza markerů pluripotence a schopnost iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) diferencovat se na všechny tři zárodečné vrstvy byly porovnány vedle sebe a byly také porovnány s embryonální buněčnou linií H9, která byla použita jako pozitivní kontrola. . Všechna tato srovnání neukázala žádné významné rozdíly mezi pacienty s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin), HCs a buňkami H9.

Bylo vyvinuto několik protokolů pro indukci diferenciace iPSC (indukovaných pluripotentních kmenových buněk) na ledvinové organoidy [13,21]. Na základě protokolů popsaných Cruz et al. [6] jsme získali struktury s charakteristikami proximálních tubulů, včetně exprese NHE3 a AOP1. Kromě toho organoidy exprimovaly NPHS2, což ukazuje na přítomnost buněk podobných podocytům.

Naopak AQP2 nebyl exprimován v těchto tubulárních organoidech. Toto zjištění je v souladu s předchozími studiemi poukazujícími na několik omezení ve vývoji struktur odvozených z ureterického pupenu (UB) in vitro, přičemž vývoj UB vyžaduje specifické protokoly, protože časové okno pro přidání specifického induktoru je velmi omezené [ 6,22,23].

V procesu generování ledvinových organoidů z iPSC (indukovaných pluripotentních kmenových buněk) je celá renální embryogeneze rekapitulována in vitro, zpočátku zahrnující tvorbu kavitovaných sféroidů z jednotlivých buněk [14]. Zjistili jsme, že nediferencované iPSCss (indukované pluripotentní kmenové buňky) jak od pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin), tak u zdravé kontroly vytvořily sféroidní struktury podobné epiblastům, které byly morfologicky podobné. Ačkoli v této studii nebylo provedeno sekvenování DNA genů PKD1 a PKD2, současné nálezy naznačují, že typ mutace nesený pacienty neměl žádný vliv na typickou morfogenezi epiblastů. K přesnějšímu hodnocení exprese klíčových molekul zapojených do této fáze embryonálního vývoje jsou stále zapotřebí další studie.

Podle protokolu vyvinutého Freedmanem et al. [14] jsme pozorovali, že sféroidy se diferencovaly na tubulární organoidy 26 dní po indukci diferenciace a načasování bylo podobné jak u pacientů s ADPKD (autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin), tak u pacientů s HC (obr.③). Přesto jsme zaznamenali určitou variabilitu, pokud jde o časový rozvrh exprese a úrovně diferenciačních markerů. Na druhou stranu, morfologie tubulárních struktur byla podobná a srovnatelná mezi vzorky od pacientů s ADPKD a HC. Naproti tomu při použití iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) pocházejících z renálních biopsií pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) skupina Cruz et al zjistila vyšší variabilitu ve schopnosti těchto buněk tvořit organoidy[6]. kromě obrovské rozmanitosti mutací, které jsou tomuto onemocnění vlastní, lze tyto rozdíly v účinnosti získávání organoidů vysvětlit také heterogenními buněčnými typy přítomnými ve vzorcích biopsie, na rozdíl od erytroidních progenitorů, které tvoří homogennější buněčnou populaci. Celkově tyto výsledky naznačují, že navzdory variabilitě a rozdílům v účinnosti různých klonů iPSC při tvorbě ledvinových organoidů může získání těchto organoidů od pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) představovat jedinečný model pro studium mnoha forem fenotypických projevů. tohoto onemocnění. Kromě toho je důležité poznamenat, že pokud existuje značná variabilita mutací v populaci postižené ADPKD, specifické iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), které jsou zcela imunitně kompatibilní, mohou být v budoucnu použity pro individuální regenerační terapie. Kromě toho, že umožňuje vývoj modelu in vitro k ověření, zda jsou velmi časné fenotypické projevy také tak rozmanité jako klinická prezentace.

Nestimulované organoidy odvozené od pacientů s HCor ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) netvořily spontánně cysty. Typická morfologie cyst a exprese markerů cystogeneze nebyly detekovatelné v žádném vzorku, dokonce i prodloužení organoidní diferenciace v kultuře až do dokončení 35 dnů. Bylo prokázáno, že samotná buněčná proliferace cysty neprodukuje[24]. K urychlení tvorby a růstu cyst in vivo je navíc zapotřebí třetí nezávislá událost (známá jako třetí zásah) [23]. Naopak, tvorba cyst indukovaná forskolinem se objevila v organoidech pacientů s ADPKD, ale ne u těch z HC. Je třeba poznamenat, že ačkoliv byly přítomny, cysty byly pozorovány v nízkém procentu ve vzorcích ADPKD i v přítomnosti forskolinu, jak také pozorovali Freedman et al. [14] v organoidech vytvořených z modelu CRISPR/Cas9 onemocnění ADPKD. K vysvětlení nízké frekvence cyst nalezených v tomto modelu lze vznést některé hypotézy. 1) Organoidy kultivované v 3D suspenzním prostředí vykazovaly mnohem vyšší účinnost cystogeneze ve srovnání s adherentními organoidy [6], což naznačuje, že mikroprostředí je přímo zapojeno do cystogeneze.2) Experimentální protokol použitý v této studii vytvořil organoidy proximálního tubulu, ale ne distální části nefronu [23]. Ačkoli všechny segmenty nefronů mohou pocházet z cyst včetně proximálních tubulů [25], zdá se, že ty odvozené ze sběrných kanálků jsou větší a ve větším počtu než segmenty z jiných segmentů [26], 3) Konečně bylo nedávno prokázáno, že původ cyst může souviset s přítomností více mutací PKD1, které určují závažnost onemocnění, a že tvorba cyst ve sběrných kanálcích byla spojena se závažností onemocnění [27, 28].

Na závěr, tato zjištění ukázala, že je možné generovat organoidy s trojrozměrnými strukturami podobnými architektuře progenitorů ledvin pomocí iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) přeprogramovaných z erytroidních progenitorů, které byly snadno izolovány z ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) pacientů a že tyto organoidy jsou schopny tvořit cysty pod stimulací forskolinem. Tato slibná metodologie odhaluje metodu pro zvýšení porozumění velmi časným genetickým, fenotypovým a fyziologickým krokům při tvorbě cyst v podmínkách ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin).

Reference

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin: Základní kurikulum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26605PM

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatická mutace v jednotlivých jaterních cystách podporuje model cystogeneze se dvěma zásahy u autosomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. Mol Cell,2:{{{101} 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatické PKD2 mutace v jednotlivých cystách ledvin a jater podporují model cystogeneze „dvou zásahů“ u autosomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin typu 2. JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Kritický vývojový přepínač definuje kinetiku tvorby cyst ledvin po ztrátě Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495, 2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD a kol.: Renální poškození je třetím hitem podporujícím rychlý rozvoj polycystické choroby ledvin u dospělých. Hum Mol Genet, 18:2523-2531, 2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK a kol.: Organoidní cystogeneze odhaluje kritickou roli mikroprostředí u lidských polycystických ledvin. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Indukce pluripotentních kmenových buněk z kultur fibroblastů. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ a kol.: Redukovaný ciliární polycystin-2 v indukovaných pluripotentních kmenových buňkách od pacientů s polycystickým onemocněním ledvin s mutacemi PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Odvození pluripotentních kmenových buněk indukovaných bez transgenů z jedné kapky krve. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Diferenciační stadium určuje potenciál hematopoetických buněk pro přeprogramování na indukované pluripotentní kmenové buňky. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM a kol.: Efektivní derivace lidských iPS buněk neintegrujícím plazmidem z krevních buněk s jedinečnými epigenetickými a genovými expresními signaturami. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotentní ledvinové organoidy odvozené z kmenových buněk: Technologie in vivo podobná in vitro. Eur J Pharmacol, 790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks ČR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Modelování onemocnění ledvin pomocí CRISPR-mutantních ledvinových organoidů odvozených z lidských pluripotentních epiblastových sféroidů. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, a kol; Jednotná kritéria pro ultrasonografickou diagnostiku ADPKD (autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: Inhibitor ROCK umožňuje přežití disociovaných lidských embryonálních kmenových buněk. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Vysoce účinný systém pro tvorbu a studium pluripotentních kmenových buněk indukovaných člověkem. Cel/ kmenová buňka. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420