Deficit mitochondriálního transkripčního faktoru A cílený na epiteliální ledviny má za následek progresivní mitochondriální depleci spojenou s těžkým cystickým onemocněním
Mar 23, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi a kol.
ÚVOD
Mitochondriální (mt) dysfunkce je dobře známým patologickým rysem běžných onemocnění ledvin a může vyvolat poškození buněk, zánět a fibrózu. V ledvinách jsou tubulární epiteliální buňky vysoce závislé na adenosintrifosfátu (ATP) generovaném oxidativní fosforylací (OXPHOS), protože vykonávají více energeticky náročných epiteliálních transportních funkcí. Proto je udržení účinné produkce mt ATP nezbytné pro normální funkci ledvin a systémovou homeostázu elektrolytů. Nedávné důkazy navíc naznačují, že mitochondrie hrají hlavní roli v genové regulaci, buněčné signalizaci a diferenciaci buněk prostřednictvím tvorby intermediárních metabolitů a reaktivních forem kyslíku (ROS).2 Navzdory těmto pokrokům hraje roli mt signalizace v patogenezi běžná onemocnění ledvin není dobře pochopena.
Abychom prozkoumali funkci mt v renální homeostáze a patogenezi, mycílený mitochondriální transkripční faktor A(TFAM). TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)je jaderně kódovaný faktor nezbytný pro funkci mt, udržení počtu kopií mt a strukturální stabilitu mt DNA, protože reguluje replikaci a transkripci mt genomu ohýbáním promotorové DNA.3 Savčí mt DNA obsahuje 37 genů, z nichž 13 kóduje proteinové podjednotky komplexu dýchacího řetězce, 22 kóduje přenosové RNA a 2 ribozomální RNA. Tím pádem,TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)se přímo podílí na regulaci transportu elektronů mt a syntéze ATP prostřednictvím transkripce genů, jako je mitochondriálně kódovaný cytochrom b(MT-CYB), mitochondriálně kódovaná cytochrom c oxidázová podjednotka 1 (MT-CO1) a mitochondriálně kódovaná membránová podjednotka ATP syntázy 6 (MT-ATP6).3BezTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)buňky ztrácejí schopnost produkovat ATP prostřednictvím OXPHOS, nemohou generovat významné množství mt ROS a postupně se vyčerpávají mitochondrie. - Genetické studie ukázaly, žeTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)je nezbytný pro normální embryogenezi, protože je globální homozygotTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace vedla k intrauterinní letalitě do embryonálního dne 10,5, zatímco heterozygotní deficit, i když snížil počet mt kopií o -40 procent a vedl k deficitu dýchacího řetězce, nevedl k embryonální letalitě. Tedy genetické cíleníTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A) je užitečná experimentální strategie pro zkoumání role progresivní mt dysfunkce v buněčné diferenciaci a tkáňové homeostáze. Podmíněná inaktivace specifická pro buněčný typTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)navrhl, že generování OXPHOS a/nebo mt ROS je zásadní pro buněčnou diferenciaci, funkci a normální fyziologii.-1o
Primární poruchy mt způsobené nukleárními nebo mt genovými mutacemi se mohou projevovat onemocněním ledvin, které se nejčastěji projevuje jako tubulointersticiální poškození nebo izolovaná tubulární dysfunkce.1,12 Ačkoli se specifické mutace v TFAM podílejí na patogenezi určitých lidských onemocnění, jako jsou neurodegenerativní poruchy.(cílený mitochondriální transkripční faktor A)způsobující onemocnění ledvin nebyly hlášeny. V poslední době sníženoTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)exprese byla spojena s chronickým onemocněním ledvin. Ztráta integrity mt v důsledkuTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace způsobila tubulointersticiální onemocnění a selhání ledvin u myší, což bylo částečně způsobeno aktivací cyklické GMP-AMP syntázy (cGAS) stimulátoru zánětlivých odpovědí závislých na interferonových genech (STING) vyvolané stresem mt DNA.
Zde uvádíme, že myši s podmíněnýmTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A) inaktivace v nefronových progenitorových buňkách exprimujících homeobox 2 (SIX2) souvisejících se sine oculis se rozvine závažné cystické onemocnění a předčasně umírají na selhání ledvin jako mladé juvenilní myši.TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-myši byly charakterizovány defekty ve zrání nefronů, které byly spojeny s deplecí mt, snížením OXPHOS a metabolickým posunem směrem ke glykolýze vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7-renální epitel. Vzhledem k závažnosti cystického onemocnění vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7-myši, analyzovali jsme 2 myší modely polycystické choroby ledvin (PKD), které jsou výsledkem mutací buď polycystinu-1 (Pkd1) nebo cystinu-1 (Cys1), stejně jako lidských tkáně od pacientů s autozomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin (ADPKD). To stanovímeTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)je dysregulován v cystách z myších i lidských tkání PKD. Celkově vzato naše studie naznačují, že TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)dysregulace a deplece mt jsou charakteristické rysy renálních cystických onemocnění a mohou se podílet na jejich patogenezi.
VÝSLEDEK
TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace v buňkách linie SIX2 způsobuje závažné cystické onemocnění vedoucí k selhání ledvin
Abychom prozkoumali funkci mt v renálním epitelu, provedli jsme inaktivaciTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)v ŠESTI2-exprimujících progenitorových buňkách, které dávají vzniknout všem segmentům nefronů kromě sběrného kanálku (CD).15Za tímto účelem jsme překročiliTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)floxovaná alela s bakteriálními umělými chromozomovými transgenními myšmi, které exprimují zvýšený zelený fluorescenční protein/Cre rekombinázový fúzní protein (eGFP/Cre) pod transkripční kontrolou promotoru Six2 (obrázek la)."Myši homozygotní pro theTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)floxovaná alela a heterozygotní pro eGFP/Cre trans-gen (šest2-eGFP/Cre plus; T fam) jsou odsud označovány jako šest 2-Tfam-/- mutantů. Šest2-Tfam-/- myší se narodilo v očekávaných mendelovských poměrech a vizuální kontrolou při narození je nebylo možné odlišit od kontrolních skupin Cre-Litermate. Rozdíly v tělesné hmotnosti mezi šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A){{0}}mutanti a kontroly z vrhu Cre-Litermate se projevily v postnatálním dni(P)14(5,7±0,3g pro mutanty vs.7,5±0,3g pro kontroly,n{{11} } každý, P=0.004; Doplňková tabulka S1). Šest2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A) mutantní myši se vyznačovaly zvětšenými ledvinami ve srovnání s kontrolami (poměr ledvin/tělesná hmotnost 1,45 procenta ± 0,19 procenta pro mutanty vs.0,60 procenta ±0,02 procenta pro kontrolu , n=4 každého, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)U -7- mutantů se vyvinula významná albuminurie (poměr albumin/kreatinin v moči=362,4 ± 75,18 mg/g v šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)--mutanti vs. 43,58±3,39 mg/g u kontrol u P14, n=6 a 10, v tomto pořadí;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-'mutanti, myši s heterozygotyTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)deficit v SIX2 progenitorových buňkách vyvinutých normálně byly plodné a nevyvinulo se u nich zjevné onemocnění ledvin (doplňkový obrázek S1).
Obrázek 1|Inaktivace Tfam v buňkách linie SIX2 má za následek závažné cystické onemocnění a selhání ledvin.(a) Schéma ilustrující experimentální přístup a umístění cílených sekvencí v rámci alely Tfam floxed. Analýza polymerázové řetězové reakce celkové genomové ledvinové DNA izolované z kontroly ze stejného vrhu (Cre) a šesti{{0}}tfammic ve věku postnatální den (P) 7; nerekombinující floxovaná alela Tfam je označena 2-lox (2); rekombinovaná alela podle 1-lox, alela divokého typu podle wt; þ nebo - označují přítomnost nebo nepřítomnost transgenu Six2-eGFP/Cre. (b) Panely vlevo, fotografie ledvin z kontroly Cre a myší Six{7}}Tfam ve věku P20. Hmotnost ledvin (KW) je vyjádřena jako procento tělesné hmotnosti (BW) (n ¼ 4–14). Pravé panely, hladiny močovinového dusíku v krvi (BUN) u Cre kontroly (co) a Six{11}}Tfam myší ve věku P7 (n ¼ 7 a 6, v tomto pořadí) a Kaplan-Meierovy křivky přežití pro Cre kontrolu a Six{ {16}}Tfam myši ve srovnání s log-rank testem (n ¼ 10–13). (c) Reprezentativní snímky řezů ledvin fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu z kontroly Cre a myší Six{22}}Tfam ve věku P7 a P29 obarvených hematoxylinem a eosinem (H&E) a analyzovaných imunohistochemicky na a-aktin hladkého svalstva (ACTA2) a klastrový diferenciační (CD) antigen 31. Číselné znaky znázorňují cystické struktury a hvězdičky znázorňují glomeruly. Tyče ¼ 1 mm pro průřezy celých ledvin, 100 mm pro vysoce výkonné H&E snímky a 50 mm pro IHC snímky. Data jsou vyjádřena jako průměr SEM a byla analyzována 2-tailovým Studentovým t-testem. ***P < 0,001.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">www.kidney-international.org.
cistanche mužské výhody
Analýza šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-myši, které také exprimovaly reportérovou alelu ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, zde označovanou jako Six2-mT/mG;TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7 myší, což naznačuje, že velká většina cystických struktur vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-ledviny (doplňkový obrázek S3). Tyto nálezy jsou v souladu se zvýšenými hladinami fosforylované extracelulární signálem regulované kinázy (p-ERK) a -kateninu u Six2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/- ledvinová tkáň (doplňkový obrázek S3). Dohromady z našich údajů vyplývá, že šest2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ ledviny vykazují molekulární rysy, které jsou často spojeny s cystickými onemocněními ledvin.
Zrání nefronu je v Six2- vadnéTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/myši Protože u myší s tkáňově specifickými může trvat až několik týdnůTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace rozvíjet patologii, dále jsme zkoumali časový průběh vývoje onemocnění ledvin v šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A){{0}}myši. Odebrali jsme ledviny od kontrolních a mutantních myší ve věku P0, P7 a P14 a pro hodnocení jsme použili histologické metody, imunofluorescenční (IF) barvení a analýzu genové exprese v extraktech celých ledvin. Barvení IF na SIX2 a E-cadherin ve věku P0 prokázalo, že ledviny z kontroly a Sic2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-byly histologicky podobné. Tvorba struktur kortikálních nefrogenních zón, jako je mezenchym SIX2 plus cap, ureterické hroty exprimující E-kadherin a vznikající struktury nefronu, jako jsou ledvinové váčky a tělíska ve tvaru čárky a S, nebyla u Six blokována{{7} }TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7- ledvin (obrázek 2a). Tyto histologické nálezy byly v souladu s úrovněmi exprese genů kódujících nefrogenní markery. Hladiny mRNA Six2, párového boxu 2 (Pax2), LIM homeobox proteinu 1 (Lhx1) a spalt-like transkripčního faktoru 1 (Sall) se významně nelišily mezi kontrolou a Six2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/myši v celkových ledvinových homogenátech z P0 ledvin (obrázek 2b). To napovídaloTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace u SIX2 nefronových progenitorů významně neovlivnila tvorbu nefrogenních struktur.
Obrázek 2|U Six2-Tfam-7 myší je vadné zrání nefronu.(a) Reprezentativní snímky řezů fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu z kontroly Cre~ a Six2-Tfam-/ledvin ve věku po narození (P) 0. Řezy ledvin byly obarveny toluidinovou modří a analyzovány imunofluorescencí na expresi homeoboxu 2 (SIX2) a E-cadherinu (ECAD) souvisejícího se sinusovým okulí. Ureterické stromy jsou ohraničeny přerušovanými bílými čarami. Mezenchym uzávěru (CM), tělísko ve tvaru čárky (CSB), tělísko ve tvaru S (SSB) a hrot ureteru (UT) jsou označeny. (b)Levý panel, relativní úrovně exprese mRNA vývojových markerů kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v celkových ledvinových homogenátech ze šesti2-Tfam-/mutantů ve věku PO ve srovnání s kontrolami Cre sourozenců (n =6 každý ). Pravý panel, relativní genová exprese specifická pro glomerulární (glom) a nefronový segment v celkových ledvinových homogenátech ze šesti2-mutantů Tfam7 ve věku P7 ve srovnání s kontrolami ze stejného vrhu Cre (n =4 každá). PT, proximální tubulus; mTAL, tlustá vzestupná Henleho končetina; DT, distální tubulus; CD, sběrný kanál. (c) Řezy ledvin obarvené alciánovou modří/kyselinou jodistou-Schiff (AB-PAS) ve věku P0, P7 a P14. Šipky označují PAS-pozitivní tubuly se štětcovým okrajem, hvězdičky znázorňují glomeruly a číselné znaky označují cystické tubuly, úsečky=100 um pro snímky AB-PAS a 50 um pro snímky obarvené toluidinovou modří a snímky IF. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM;2-sledovaný Studentův t-test;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
cistanche recenze
Ačkoli formování rodící se struktury nefronů nebylo inhibováno, barvení alciánovou modří/kyselina jodistá-Schiff a lotosový tetragonolobus lektinem indikovalo defektní zrání terminálních nefronů v šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A){{0}}myši ve věku P0. Alciánská modř/kyselina jodistá-Schiff, která barví tubulární bazální membrány a kartáčový lem, a lektin lotosu tetragonolobus, který identifikuje specifické oligosacharidy v kartáčovém lemu buněk proximálního tubulu, byly u mutantních ledvin sníženy. Obrázek 2c ukazuje barvení alciánovou modří/kyselinou jodistou-Schiff v časových bodech P0, P7 a P14. Histochemie lektinu Lotus tetragonolobus a barvení IF pro protein Wilmsova tumoru 1 v časových bodech P0, P7 a P14 jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S4. Ve věku PO byla relativní plocha pozitivně obarvená lektinem lotosového tetragonolobusu 2,10 procent ±0,51 procenta a 0,39 procenta ± 0,1 procenta při věk P7 oproti 6,25 procenta ± 0,28 procenta a 6,2 procenta ± 1,1 procenta pro kontroly, v tomto pořadí (n=3-4, P=0,0004 a 0,0007, v tomto pořadí; doplňkový obrázek S4). V souladu s těmito histologickými nálezy je významný pokles exprese genů kódujících markery specifické pro glomerulární a nefronový segment podocin, nefrin, aquaporin 1 (Agp1), kotransportér fosforečnanu sodného 2a (NaPi2a), uromodulin, kotransportér sodíku a chloridu draselného 2 (Nkcc2) a kotransportér chloridu sodného citlivý na thiazidy (Ncc) v šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ myši (obrázek 2b). Dohromady tyto údaje naznačují, že Six2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/- ledviny vykazují progresivní redukci počtu zralých proximálních segmentů nefronu a glomerulů.
Protože výsledkem aktivity Six2-eGFP/CreTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-deficientní segmenty nefronu odvozené z mezenchymu čepice, předpověděli jsme, že dozrávání CD epiteliálních buněk, které jsou odvozeny z ureterických pupenů, nebude ovlivněno u šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ ledviny. V souladu s touto představou je, že barvení aglutininem Dolichos biflorus, který reaguje s N-acetyl-D-galaktózou v distálním tubulu a CD, indikovalo relativní nadměrné zastoupení aglutinin-pozitivních struktur Dolichos biflorus v šesti{5}}TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/- ledviny. Ve věku P7 tvořily pozitivně obarvené oblasti pro aglutinin Dolichos biflorus 13,91 procenta ±{5}},9 procenta celkové plochy pro mutanty oproti 1,93 procenta ± 0,1 procenta pro kontrolu (n {{11} }, P=0.0002; Doplňkový obrázek S4). Exprese mRNA epiteliální podjednotky 1 alfa sodíkového kanálu (Scnnla) nebo aquaporinu 2 (Agp2), které jsou oba exprimovány v epiteliálních buňkách CD, nebyla významně snížena ve srovnání s ovládací prvek (obrázek 2b). Na rozdíl od šestky2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-ledviny,TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace v progenitorových buňkách homeoboxu B7 (HOXB7), které vedou ke vzniku CD epiteliálních buněk, což vede ke ztrátě exprese CD nefronového markeru a mírné tubulární dilataci, ale ne cystogenezi (doplňkový obrázek S5). Celkově vzato naše data naznačují, že ztrátaTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)funkce v progenitorových buňkách SIX2 neblokuje vývoj nascentních nefronových struktur, ale inhibuje zrání terminálních nefronů.
TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-cysty mají nedostatek běžných markerů segmentu nefronů
Charakterizovat histogenetický původTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7renálních cyst, provedli jsme analýzy IFTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um byly charakterizovány intraluminálními depozity uromodulinu, které naznačovaly původ ze segmentů nefronu distálně od proximálního tubulu a sestupné Henleovy kličky (obrázek 3b).
Obrázek 3ITfam-/cysty neexprimují běžné markery specifické pro segment nefronů.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Reprezentativní snímky řezů ledvin fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu ze šesti2-mT/mG; Tfam-7myši ve věku P14 se barvily na eGFP a uromodulin pomocí IF. Hvězdičky znázorňují cysty s intraluminálním uromodulinem. Přítomnost intraluminálního uromodulinu byla vyšetřována u cyst s maximálním průměrem buď 50-100 um nebo u cyst větších než 100 um v maximálním průměru. Tyče =(a,b)100 um. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www ledviny-international.org.
Progresivní abnormality ve funkci a morfologii mt vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7-epiteliální buňky
Charakterizovat časový průběh metabolických následkůTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)delece, nejprve jsme zkoumali hladiny mRNATFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)aTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-regulované mt-Col, mt-Cyb a mt-Atp6 inTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-ledviny ve věku PO, P7 a P14. Podle očekávání,TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)Hladiny mRNA mt-Col, mt-Cyb a nt-Atp6 byly významně sníženy (obrázek 4a). Epiteliální buňky T fam-7- označené eGFP (šest2-mT/mG; myši Tfam{7}}) vykazovaly významné snížení exprese proteinu MT-CO1 (doplňkový obrázek S7). Počet kopií mt DNA se snížil o 63 procent, což je v souladu s vyčerpáním mt, což je charakteristický znakTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)nedostatek (obrázek 4a). Naproti tomu exprese jaderných genů kódujících nikotinamid adenindinukleotid: ubichinon oxidoreduktázová jádrová podjednotka 3 (Ndufs3) a flavoproteinová podjednotka A (Sdha) komplexu sukcinátdehydrogenázy nebyla ovlivněna ve věku P0, ale byla snížena ve věku P7 a P14 (Obrázek 4a). Tato zjištění z analýzy genu mt a proteinu jsou v souladu s progresivní ztrátou počtu kopií mt v Tfam-/-epitelu.
Dále jsme zkoumali metabolické účinkyTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)inaktivace v primárních epiteliálních buňkách proximálního tubulu (PTEC) izolovaných ve věku P7.TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7 PTEC vykazovaly významné snížení bazální spotřeby kyslíku (40,77 ± 4,10 pro mutanty vs. 61,75 ± 5,18 pmol/min/10 buněk pro kontroly, n=3 každá, P= 0,034 ),Dýchání vázané na ATP (33,11 ± 3,91 pro mutanty vs. 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* buněk pro kontroly, n=3 každý,P=0,093), maximální dýchání (116,8 ± 14,19 pro mutanty vs. 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* buněk pro kontroly, n= 3 každý, P=0,005) a náhradní respirační kapacitu (76,05 ± 10,18 pro mutanty vs. 163,7 ± 8,61 pmol/min/10* buněk pro kontroly, n=3 každá, P= 0,003; obrázek 4b).
cistanche reddit
Abychom dále charakterizovali stupeň vyčerpání a poškození mt, zkoumali jsmeTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/- ledvin transmisní elektronovou mikroskopií a 3-dimenzionální strukturovanou iluminační mikroskopií (3D SIM). Ve věku P7 vykazovaly mitochondrie nepravidelné tvary a balony, které jsou v souladu s předchozími nálezy vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)knockout myši. Analýza transmisního elektronového mikroskopu ukázala, že strukturální abnormality mitochondrií, jako je zvětšená velikost a abnormální kristy, progredovaly postnatálně, protože morfologické rozdíly mezi mutanty a kontrolou byly méně patrné ve věku P0 a s věkem se staly závažnějšími (obrázek 4c ).3D SIM byla použita ke zkoumání objemu mt a velikosti sítě v šesti2-mT/mG;TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ mutanty ve srovnání se šesti2-mT/mG kontrolními myšmi ve věku P7; Objem mt byl měřen v příčných řezech 5 až 8 tubulů na řez, přičemž bylo zkoumáno 25 až 4 0 eGFP-pozitivních kortikálních epiteliálních buněk obarvených na napěťově závislý aniontově selektivní kanál 1 barvením IF. Zjistili jsme, že celkový objem mt na eGFP-pozitivní buňku byl významně snížen (62,66 ± 16,46 um/buňku pro mutanty vs. 177,4 ± 30,17 μm'/buňku pro kontroly, n=3 každá , P= 0.0289) a byla spojena se změnou poměru celkového objemu mt na celkový objem buněk z 0,230 ±0,01 v kontrolách na 0,089 ± 0,016 v šesti 2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7 mutantů (n= 3 každého, P=0.0017; obrázek 4c). Maximální velikost sítě mt, která měří největší síť mt zaznamenanou ve všech zkoumaných eGFP-pozitivních buňkách, byla snížena v šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ ledviny (143,2 ± 23,2 μm² pro mutanty vs. 318,3 ± 49,45 um² pro kontroly, n= 3 každá, P= 0,0327）. Celkově vzato, ultrastrukturální a SIM nálezy a nálezy z mt genové a proteinové analýzy jsou v souladu s progresivní ztrátou počtu mt kopií vTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-7-epitel.
Obrázek 4| Tfam-/renální epitel je charakterizován progresivní mitochondriální deplecí.(a) Exprese mitochondriálního (mt) genu kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí ve věku po narození (P) {0}}, P7 a P14 (násobná změna oproti kontrole, n =6 každý) a Obsah mt DNA (P7) v celkových ledvinových homogenátech z kontrolní skupiny Cre~ (co) a šesti2-Tfam-/myší. (b) Míra spotřeby kyslíku (OCR) v primárních proximálních tubulárních epiteliálních buňkách (PTEC) izolovaných z Cre kontroly sourozenců a šesti2-7fam- ledvin ve věku P7 na platformě Seahorse XFe24. Reprezentativní měření OCR v kontrolních a Tfam{11}}PTEC ošetřených oligomycinem A (oligo A, inhibice adenosintrifosfát [ATP] syntázy), karbonylkyanidem-p-trifluormethoxyfenylhydrazonem (FCCP, uncoupler) a inhibitory oxidativní fosforylace rotenonem a antimycin A(AA). Také jsou uvedeny vypočtené bazální a maximální dýchání, dýchání vázané na ATP a náhradní respirační kapacita (n =3 každý). (c) Ultrastrukturální analýza mitochondrií transmisní elektronovou mikroskopií. Reprezentativní snímky řezů ledvin z transmisního elektronového mikroskopu od myší Crecontrol a Six2-Tfam{18}}ve věku P0 a P7, červené šipky znázorňují mitochondrie. Pruh=500 nm. (d) trojrozměrné strukturované iluminační mikroskopické snímky řezů ledvin z Six2-mT/mG (co) a Six2-mT/mG; Tfam-/-myši ve věku P7. Enhanced green fluorescent protein (eGFP), cytochrom c oxidasová podjednotka 4 (COXⅣ) a napěťově závislý aniontově selektivní kanál 1 (VDAC) byly detekovány imunofluorescencí.4',6-diamidino-2-fenylindol (DAP ) byl použit pro barvení jádra (modrá fluorescence).Bílé přerušované čáry znázorňují renální tubul v kontrolní a cystový lumen v mutantní ledvině a číselné znaky znázorňují tubulární lumen v kontrolní nebo cystové lumen v mutantní ledvině. Plocha mt byla kvantifikována pomocí Imaris software (Oxford Instruments, Abingdon, UK; n =3 každého). Celkový (celkový) objem mt (obj.) na eGFP-pozitivní buňku (25-40 analyzovaných buněk/vzorek), poměr celkového objemu mt na celkový objem buňky a maximální (max.) velikost sítě mt na buňku. Velikost sítě mt byla určena v trubkovém průřezu s 5 buňkami na průřez. Sloupce =4 um. Údaje jsou uvedeny jako průměr ± SEM a byly analyzovány Studentovým t-testem.*P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)nedostatek posouvá metabolismus ledvinového epitelu směrem ke glykolýze
PTEC v ledvinách využívají oxidaci mastných kyselin a OXPHOS pro tvorbu ATP a jsou glukoneogenetické.“ stupně Abychom získali další informace o metabolických změnách spojených s inaktivací Tam, provedli jsme analýzu sekvenování RNA ledvin ze šesti2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/-a Cre~ kontrolní myši ze stejného vrhu ve věku P7. Zjistili jsme, že klíčové regulační geny zapojené do glykolýzy, jako je hexokináza 2 (Hk2) a enoláza 2 (Eno2), byly upregulovány. Naproti tomu exprese většiny genů zapojených do cyklu trikarboxylových kyselin byla snížena (např. isocitrátdehydrogenáza 1[Idh1), stejně jako exprese genů zapojených do oxidace mastných kyselin, jako je acetylkoenzym A acyltransferáza 1B(Acaalb), acyl-koenzym A dehydrogenáza se středně dlouhým řetězcem (Acadm) (obrázek 5a a b, doplňkový obrázek S8). V souladu se sníženou expresí genů zapojených do kontroly cyklu trikarboxylových kyselin a mutantních ledvin ve věku P7 pomocí platformy Seahorse XFe24 (Agilent, Santa Clara, CA). Mutantní PTEC byly charakterizovány významným zvýšením bazální glykolýzy (rychlost odtoku protonů=117,4 ± 12.07 pmol/min pro mutanty a 73,34 ± 6,33 pmol/min pro kontrolu, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) a snížení poměru rychlosti spotřeby kyslíku mt k rychlosti odtoku glykolytických protonů z 0,73 ± 0,08 u kontroly na 0,34 ± 0,02 u mutantních PTEC (n=3,P=0,0074). Dohromady tomu tyto údaje naznačujíTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/- epiteliální buňky prošly metabolickým posunem od OXPHOS a oxidace mastných kyselin směrem ke glykolýze (obrázek 5d).
Obrázek 5]Deficit renálního epiteliálního mitochondriálního transkripčního faktoru A (TFAM) je spojen se zvýšenou glykolýzou a abnormálním metabolismem mastných kyselin.(a) Analýza metabolické genové exprese pomocí RNA sekvenování celé kůry ledvin izolované ze šesti2-Tfam-/- a Cre-kontrolních myší (co) ze stejného vrhu ve věku postnatální den (P) 7 (n {{6 }} každý). Jsou ukázány odlišně regulované metabolické geny zapojené do glykolýzy a cyklu trikarboxylových kyselin. Geny se statisticky významným zvýšením exprese mRNA jsou zobrazeny červeně a geny se sníženou expresí jsou zobrazeny zeleně.(b) Hladiny exprese mRNA vybraných odlišně regulovaných genů kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (n=4-6). (c) Změněný metabolismus mastných kyselin u šesti2-7Tfam-7mutovaných myší. Reprezentativní snímky řezů ledvin obarvených olejovou červení O od šesti2-Tfam-7 a kontrolních myší Cre- littermate ve věku P14. Šipky ukazují na olejově červené O-pozitivní buňky a číslo sian znázorňuje cenu. Sloupec=10 um.(d) Analýza glykolytického toku primárních proximálních tubulárních epiteliálních buněk (PTEC) izolovaných z kontroly Cre sourozenců a šesti2-Tfam-/ledvin ve věku P7 (n=4 každý ) na platformě Seahorse XFe24. Jsou zobrazena reprezentativní měření rychlosti efluxu glykolytických protonů (glyco PER) u kontroly a Tfam-7PTEC ošetřených 2-deoxyglukózou (2-DG) a inhibitory oxidativní fosforylace rotenonem a antimycinem A(AA) . Také jsou ukázány průměrné glyko PER na začátku a poměr mitochondriální (mt) rychlosti spotřeby kyslíku (OCR) ke glyko PER. Data jsou reprezentována jako průměr ± SEM a byla analyzována pomocí Studentova t-testu. (pokračování)
SníženáTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)exprese v myších a lidských tkáních PKD je spojena s deplecí mt
Protože šest2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ ledviny se silně podobaly ledvinám PKD, dále jsme hodnotili, zdaTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)byl dysregulován v tkáních PKD. Nejprve jsme zkoumaliTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)a TFAM-regulovaná genová exprese ve 2 dobře zavedených genetických PKD myších modelech.TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)Hladiny mRNA byly významně sníženy v homogenátech celých ledvin z myší Pkd1-/- a Cyspk/pk, které nesou mutace buď v Pkd1 nebo Cys1. To bylo spojeno se snížením exprese mitochondriálně a nukleárně kódovaných mt genů a také s dysregulovanou expresí glykolytického genu. Podobné jako Six2-TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)-/ledviny, Pkd1-7 a ledviny CysPkpk byly charakterizovány zvýšenými hladinami Eno2 a Hk2 a významně sníženými hladinami fosfoglycerátkinázy (Pkg)1, pyruvátdehydrogenázykinázy (Pdk)1 a Pdk4 (obrázek 6a).TFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)exprese proteinu, jak bylo hodnoceno barvením IF, byla snížena v epiteliálních buňkách výstelky cyst ve srovnání s epiteliálními buňkami ze sousedních necystických tubulů (obrázek 6b). To bylo spojeno se sníženou expresí mt-Co1 a mt-Atp6 fluorescenční RNA hybridizací in situ (obrázek 6b, doplňkový obrázek S9); Objem mt, stanovený pomocí 3D SIM, byl snížen o 55 procent ve srovnání s epiteliálními buňkami ze sousedních necystických tubulů nebo PTEC z normálních kontrolních ledvin. Rozdíly v objemu mt mezi normálními kontrolními PTEC a PTEC z necystických tubulů nebyly nalezeny (obrázek 6c).
Obrázek 6| Exprese mitochondriálního transkripčního faktoru A (TFAM) je u ledvinových cyst Pkd1-7-a CysPkepk snížena.(a)Relativní úrovně exprese mRNA (násobná změna oproti kontrole sourozenců Cre) mitochondriálně a v jádře kódovaných mitochondriálních a glykolytických genů v Pkd1-7a Cyskidney (n=3-5).(b)Reprezentativní snímky ledvin řezy z Pkd1-7a kontrolních myší ze stejného vrhu analyzované ve věku po narození (P)22. Ukázáno je imunofluorescenční (IF) barvení pro TFAM a fluorescenční in situ hybridizaci RNA (RNA-FISH) pro mitochondriálně kódované transkripty cytochrom c oxidázy 1 (mt-Co1) a mitochondriálně kódované membránové podjednotky 6 ATP syntázy (mt-Atp6). Bílé šipky identifikují epiteliální buňky výstelky cyst se silně sníženou expresí TFAM, mt-Co1 nebo mt-Atp6. Glomeruli jsou označeny gl. Tubulární struktury exprimující TFAM jsou identifikovány červenou fluorescencí. Hvězdičky znázorňují tubulární epiteliální buňky s detekovatelnými transkripty mt-Co1 a mt-Atp6. K barvení jader (modrá fluorescence) byl použit 4',6-diamidino-2-fenyindol (DAPI). Sloupce=25 um pro snímky IF a 10 μm pro snímky RNA-FISH. （c） Trojrozměrná strukturovaná osvětlovací mikroskopie. Ukázané jsou obrázky řezů ledvin z Pkd{28}}ledvin analyzované histochemicky s lektinem lotosu tetragonolobus (LTL) a IF pro cytochrom c oxidázovou podjednotku 4 (COXIV) a napěťově závislou expresi aniontově selektivního kanálu 1 (VDAC). Mitochondriální (mt) objem byl kvantifikován pomocí softwaru Imaris na základě barvení COXIV. Šipky znázorňují epiteliální buňky výstelky cyst, číselné znaky znázorňují světlo cysty a hvězdičky znázorňují necystické tubuly. Epiteliální buňky vystýlající cysty jsou vyznačeny přerušovanými čarami. Pruhy=10 μm pro levý panel a 3 μum pro pravý panel. Data jsou reprezentována jako průměr ± SEM a byla analyzována pomocí Studentova t-testu *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Chcete-li zjistit, zda ztrátaTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)exprese je společným molekulárním rysem lidské PKD, analyzovali jsme vzorky nefrektomie od 5 pacientů s ADPKD imunohistochemicky, IF barvením, RNA fluorescenční in situ hybridizací a 3D SIM. SníženáTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)exprese byla pozorována u 75,2 % ± 7,5 % renálních cyst analyzovaných imunohistochemicky. To bylo spojeno se sníženou expresí MT-CO1 a MT-ATP6 fluorescenční RNA hybridizací in situ (obrázek 7a, doplňkový obrázek S10); Objem mt v epiteliálních buňkách výstelky cyst se zmenšil přibližně o 70 procent, jak bylo hodnoceno pomocí 3D SIM (obrázek 7b). Dohromady to naznačovala analýza 2 myších modelů PKD a lidských tkání ADPKDTFAM(cílený mitochondriální transkripční faktor A)nedostatek a deplece mt jsou běžnými nálezy v tkáních PKD a pravděpodobně ovlivňují patogenezi cystického onemocnění ledvin.
Obrázek 7| Exprese mitochondriálního transkripčního faktoru A (TFAM) v renálních cystách pacientů s polycystickým onemocněním ledvin je snížena.(a) Reprezentativní snímky řezů zalitých ve formalínu fixovaných v parafínu z normálních lidských ledvin a ledvin od pacientů s polycystickým onemocněním ledvin (PKD) analyzované imunohistochemicky pro expresi TFAM, imunofluorescencí (IF) pro napěťově závislý aniontově selektivní kanál 1 (VDAC ) exprese a fluorescenční hybridizací RNA in situ pro mitochondriálně kódovanou cytochrom c oxidázu 1 (MT-CO1) a mitochondriálně kódovanou membránovou podjednotku ATP syntázy 6 (MT-ATP6) mRNA expresi, šipky identifikují epiteliální buňky cysty, číselné znaky znázorňují lumina cysty a hvězdičky zobrazují glomeruly. Pruh=100 μm pro snímky s nízkým zvětšením a 10 um pro snímky s vysokým zvětšením (b)Reprezentativní 3-rozměrné strukturované iluminační mikroskopické snímky lidských PKD ledvinových řezů analyzované pomocí IF na expresi VDAC.4',{ K barvení jader (modrá fluorescence) byl použit {17}}diamidino{18}}fenylindol (DAPl). Přerušované čáry označují tubuly a číselné znaky znázorňují tubulární nebo cystický lumina. Mitochondriální (mt) objem byl kvantifikován pomocí softwaru Imaris (n=5). Pruh =4 μm. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM a byla analyzována pomocí Studentova t testu.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
