Onemocnění ledvin: Jak nikl indukuje autofagii v ledvinách?

Další informace:{0}}

Část Ⅰ: Nikl indukuje autofagii prostřednictvím PI3K/AKT/mTOR a AMPK drah v myších ledvinách

Heng Yin, Zhicai Zuo a kol.

1. Úvod

Nikl(Ni), přírodní prvek, je široce distribuován v oblastech životního prostředí, včetně půdy, vody a vzduchu (Schrenk et al, 2020). Ni (Nikl)sloučenin a kovového Ni (Nikl)mají mnoho průmyslových a komerčních aplikací, jako je výroba slitin, galvanické pokovování, nikl-kadmiové baterie a katalyzátory v chemickém a potravinářském průmyslu (Genchi et al., 2020). Nicméně obrovské průmyslové využití Ni (Nikl)vede k rozsáhlému znečištění životního prostředí, což zvyšuje riziko expozice člověka Ni prostřednictvím potravin a pitné vody (Das et al, 2018). Ačkoli Ni (Nikl) je základní mikroživinou pro lidi a zvířata, nadměrná expozice Ni je extrémně nebezpečná pro lidské zdraví (Das et al., 2018).

S rostoucím výskytem Ni (Nikl)kontaminace v posledních letech přitahuje stále větší pozornost toxikologie Ni, včetně imunotoxicity, hepatotoxicity, nefrotoxicity a plicní toxicity (Gathwan et al., 2013; Deng et al., 2016; Hasanein a Felegari, 2017; Guo et al., 2020a 2020b). Theledvina, jako důležitý cílový orgán v Ni (Nikl)toxikologie, s akumulací Ni (Nikl)a Ni (Nikl)sloučeniny v nich prostřednictvím chronické expozice mohou vyvolat významné poškození ledvin (Elangovan et al, 2018). Stávající výzkum našeho výzkumného týmu prokázal indukci oxidačního stresu, apoptózy, zánětu a zastavení buněčného cyklu vledvinabrojlerů NiCl2 (Niklchlorid 2) v potravinách přesahujících 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a, 2016b). Několik studií naznačilo, že mechanismus toxikologie ledvin Ni zahrnuje oxidační poškození, zlomy řetězce DNA a apoptózu (Lee a kol., 2001; Chen a kol., 2010).

Hraje klíčovou roli v buněčné homeostáze,autofagiebylo zjištěno, že má souvislost s výskytem a patogenezí různých onemocnění (Martin et al, 2019). Nedávné studie ukázaly, že buněčná smrt může být zprostředkována mimo kontrolu nebo nadměrnou stimulacíautofagie(Denton a Kumar, 2019). Jako komplexní a vysoce uspořádaný intracelulární proces,autofagiezačíná tvorbou dvoumembránových vezikul známých jako autofagozomy, které pohlcují část cytosolu a organel (Martin et al, 2019). Následně se autofagozomy po přesunu do lysozomů účastní proteolýzy pohlcených látek.

Autofagieje citlivý na různé typy buněčného stresu, jako je nedostatek růstového nebo nutričního faktoru, hypoxie, poškození DNA, reaktivní formy kyslíku (ROS), agregace proteinů, intracelulární patogeny nebo poškození organel (Dodson et al, 2013). Je to extrémně složitý proces na regulaciautofagiezahrnující mnoho signálních drah, včetně adenosinmonofosfátem aktivované proteinkinázy (AMPK), fosfatidylinositol 3-kinázy-I (PI3K) a savčích cest rapamycinu (mTOR) (Cao et al2021). A dráha mTOR má klíčový účinekautofagiezahájení. Aktivita mTOR je hlavním kontrolním bodemautofagie, jehož inhibiční účinek vede k defosforylaci odlehčení ULK1autofagieinhibice (Parzvch a Klionsky, 2014). Kromě toho jsou PI3K/Akt a AMPK hlavními upstream regulátory mTOR (Gong et al, 2020; Xu et al, 2020). Předchozí výzkumy naznačovaly, že těžké kovy (jako Cd, Hg, Cu a Pb) mohou vyvolat výskytautofagie(Su et al, 2017). Přestože Huang et al.(2016) a Son et al. (2017) zjistili, že Ni (Nikl)expozice by mohla účinně vyvolatautofagiev buňkách bronchiálního epitelu je přesný mechanismus stále nejasný,

Účinek Ni (Nikl)naautofagiebyl zřídka hlášen a je k dispozici pouze několik studií o účincích Ni na ledvinyautofagiemyší in vivo. Současná práce si proto klade za cíl potvrdit, zda NiCl2 (Niklchlorid 2)léčba může vyvolatautofagiea vyhodnotit potenciální mechanismus NiCl (Niklchlorid)-indukovanýautofagievčetně drah AMPK a PI3K/AKT/mTOR.

Nikl ovlivňuje ledviny a způsobuje onemocnění ledvin

Klikněte na Cistanche pro onemocnění ledvin

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie a protilátky

Niklchlorid(NiCl) poskytla společnost Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, Čína). V imunoblotové analýze byly všechny protilátky zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology (CST, USA), včetně lehkého řetězce protein1 asociovaného s králičím mikrotubulem 3B (LC3B) (kat. č. 43566T), protikráličí p62 (SQSTM1) (kat. č. 5114D), protikráličí Beclin1 (kat. č. 3495T), protikráličíautofagiepříbuzný protein12 (Atg12) (kat. č. 4180T), anti-králičí Atg5 (kat. č. 12994T), anti-králičí Atg16L1 (kat. č. 8089T), anti-králičí Atg7 (kat. č. 8558T), anti-králičí Atg3 ( kat. č. 3415T), anti-králičí savčí cíl rapamycinu (mTOR) (kat. č. 2983T), anti-králičí p-mTOR (kat. č. 5536T), anti-králičí unc-51 jako kináza 1 (ULK1 )(kat.č.8054D), protikráličí p-UIK1(kat.č.5869T), protikráličí PI3K(kat.č.4292S),protikráličí p PI3K(kat.č.4228T,protikráličí Akt(kat.č. .9272S),protikráličí p-Akt (kat.č.4060T),protikráličí mTOR(kat.č.2972S), protikráličí p-mTOR (kat.č.5536S),antikráličí AMPK (kat.č.5831S anti-králičí p-AMPK (kat. č. 2535S) a -aktin (kat. č. 4970T).

2.2.Zvířata a léčba

Celkem 160 zdravých samců myší ICR ve věku osmi týdnů poskytla společnost Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Čína). Všechna zvířata byla držena za konstantních podmínek (teplota 25±2C; 12-h cyklus světlo-tma) v aseptickém prostředí a krmena standardní peletovou stravou a vodou ad libitum. Myši byly rozděleny do čtyř skupin náhodně, každá obsahovala čtyřicet myší po aklimatizaci po dobu sedmi dnů. Kontrolní skupině byla intragastricky podávána destilovaná voda, zatímco Ni (Nikl)(NiCl2 (Niklchlorid 2).6H2O) v dávkách 7,5, 15 a 30 mg/kg byl podáván zvířatům v experimentálních skupinách intragastricky. Ni přijatá zde byla stanovena podle hodnoty střední letální dávky (LD50, 306,11 mg/kg) dosažené při výzkumu akutní orální toxicity u samců myší. NiCl (Niklchlorid)1,6HZO byl před provedením experimentů zředěn použitím destilované vody. Čtyřem skupinám byla podávána žaludeční sonda dávka 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti jednou denně po dobu 28 dnů. Po ošetření po dobu 14 a 28 dnů byla všechna zvířata humánně usmrcena, aby se shromáždilaledvinavzorky pro analýzu v částech níže. Všechna experimentální zvířata a postupy byly provedeny na základě dohody, která byla schválena organizací pro péči o zvířata a etickou komisí na zemědělské univerzitě Sichuan (č. schválení:2012-024, Chengdu, Čína).

2.3. Stanovení indexu a funkcí ledvin

Všechny myši byly každý týden zváženy a humánně usmrceny po dokončení léčby a potéledvinybyly nařezány a zváženy. Theledvinapoužitý index byl poměr meziledvinahmotnost a tělesná hmotnost.

Výzkumníci měřili dusík močoviny v krvi (BUN) a hladiny sérového kreatininu (CRE) podle pokynů komerčních souprav vyrobených Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, Čína),

2.4. Stanovení akumulace Ni v ledvinách (Nikl)

ledvinyvzorky byly odebrány 28. den během experimentu. Potom 1 ml HCiO a 9 ml HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd., Čína) byly použity k mokrému trávení 0,5g části vzorků po dobu 24 hodin ve zkumavkách odolných vůči vysoké teplotě. Poté byly tyto zkumavky umístěny na horkou plotnu, aby se odpařila veškerá kapalina, a následně byl zbytek suspendován pomocí 10 ml 0,1 M/L HNO. Poté výzkumníci analyzovali vzorky z hlediska Ni (Nikl)pomocí plamenového atomového absorpčního spektrofotometru (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Histopatologické a ultrastrukturní pozorování

Po sesbírání a následné fixaci ve 4% paraformaldehyduledvinavzorky byly dehydratovány alkoholem, zality do parafínu, nakrájeny na 5 um a zpracovány k obarvení hematoxylinem a eosinem. K pozorování řezů a pořizování fotografií histopatologických změn byl použit digitální fotoaparát (Nikon DS-Ri1, Japonsko). Deset mikroskopických polí od každéholedvinabyly přezkoumány. Obrázky zobrazené v novinách byly reprezentativní.

Pro ultrastrukturální hodnocení bylo pro fixaci použito 2,5 procenta glutaraldehyduledvinatkáně (asi 1 mm5) při pokojové teplotě. Poté následovala dodatečná fixace těchto tkání v 1% oxidu osmičelém, dehydratovaném v acetonu a zalité v epoxidové pryskyřici. Připravené ultratenké plátky byly umístěny na měděné mřížky a poté obarveny pomocí octanu uranylu a octanu olovnatého. Ultrastrukturní snímky byly pořízeny pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEM-1400Flash (JEOL, Japonsko).

obnovit a zlepšit funkci ledvin: cistanche

2.6. Imunohistochemický

Po odparafinování pomocí xylenu byly plátky parafínu rehydratovány použitím odstupňované sady ethanolového roztoku. Poté následovalo promytí destilovanou vodou a PBS a 15 min blokování endogenních peroxidázových aktivit (EPA) prostřednictvím inkubace za použití 3% H20 v methanolu pro zhášení EPA. Abychom usnadnili vyhledávání antigenu, ošetřili jsme řezy mikrovlnným ohřevem po dobu 15 minut v 0.01 M pufru citrátu sodného s pH 6,0. Po nasycení normálním 10procentním kozím sérem po dobu 30 minut, řezy pak podstoupily inkubaci s použitím primárních protilátek přes noc při 4 stupních. 1% biotinylovaná kozí anti-králičí/myší IgG sekundární protilátka (Boster, Wuhan, Čína) byla použita k inkubaci řezů promytých PBS při 37 stupních po dobu 1 hodiny a poté při 37 stupních komplexu streptavidin-biotin (SABC; Boster , Wuhan, Čína) byl použit po dobu 30 minut. Poté následovalo ponoření řezů do diaminobenzidin hydrochloridu (DAB; Boster, Wuhan, Čína) pro vizualizaci imunoreakce. Nakonec, po světelném kontrastním barvení pomocí hematoxylinu, byly řezy dehydratovány ethanolem, vyčištěny xylenem a postupně upevněny.

Integrovaná optická hustota (IOD) byla použita pro kvantifikaci hladin proteinů LC3B a p62. Analytická metoda pro hodnotu IOD se odvolávala na Fangeta spol. (2018). Pro pořizování snímků byl použit digitální mikroskopický kamerový systém Nikon DS-Ril (Japonsko). Výzkumníci poté vybrali pět polí（0,064 mm²）v každé oblasti snímků každého řezu pro analýzu pomocí softwaru Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA ).

2.7. Western blotting

Extrakce bílkovin zledvinaVzorky byly provedeny pomocí RIPA lyzačního pufru a pro měření koncentrace bylo použito činidlo pro analýzu proteinů BCA (P0010S, Beyotime Technology, Čína). Poté byla provedena SDS-PAGE pro vzorky proteinů, které byly následně přeneseny na nitrocelulózové membrány. Blokované pomocí 5% odstředěného mléka po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, membrány byly inkubovány s primární protilátkou při 4 stupních přes noc. Po použití sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou k inkubaci po dobu 1 hodiny byl použit Chemidoc XRS k detekci proteinových pásů na membránách pomocí sady ECL (P0018A, Beyotime Technology, Čína).

2.8. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR)

Ledvinybyly odebrány a rozemlety kapalným dusíkem v hmoždíři pomocí paličky a poté konzervovány při nízké teplotě (-80 stupeň), celková renální RNA byla extrahována pomocí RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japonsko) podle doporučení od výrobce. Poté následovala syntéza komplementární DNA (cDNA) pomocí reagenční soupravy RR047A Prim-ScriptTM RT vyráběné společností Takara v Japonsku podle pokynů. Poté byla provedena qRT-PCR pomocí systému LightCycler ⑩ 480 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA) a soupravy SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japonsko). Primery použité pro PCR jsou uvedeny v tabulce 1. -aktin byl použit pro normalizaci genové exprese a relativní exprese mRNA byla vypočtena pomocí 2-4ac metody (Livak a Schmittgen, 2001).

2.9. Statistická analýza

Data byla vyjádřena ve formě průměru ± standardní odchylka a analyzována pomocí LSD nebo Dunnettovy T3 analýzy rozptylu. Pro všechny statistické analýzy pro okna byl použit software SPSS (verze 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA). P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tabulka 1: Sekvence primerů použitých ve studii,

3. Výsledky

3.1.NiClz (Niklchlorid)zhoršuje funkci ledvin

Jak je znázorněno na obr. 1A, tělesná hmotnost klesla ve třech skupinách léčených NiCl2 (Niklchlorid 2). A významný pokles byl také zjištěn v relativní hmotnostiledvina(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Sérové ​​CRE a BUN byly použity jako standardní biomarkery funkce ledvin. Výsledky funkce ledvin byly zobrazeny na obr. 1C a D a koncentrace CRE a BUN byly významně zvýšeny (P<0.05)in the=""> (Niklchlorid 2)-léčebné skupiny ve dnech 14 a 28 příbuzní ke kontrole.

Obr.1E ukazuje, že tři Ni (Nikl)léčebné skupiny mají významně vyšší koncentrace Ni v ledvinách (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Niklchlorid)- indukuje histopatologické variace ledvin

Obr.2 ukazuje, že NiClz (Niklchlorid)léčba způsobila histopatologické variaceledvinas dávkami a časem, zahrnující oteklý glomerulus spolu se zúženým kapsulárním prostorem, vakuolární a granulární degeneraci v renálním tubulárním epitelu.

Obr. 2. NiCl2 (Niklchlorid 2)vyvolává histopatologické změny v ledvinách.

Histopatologické léze zahrnovaly oteklý glomerulus spolu se zúženým kapsulárním prostorem (*), vakuolární degeneraci (černé šipky) a granulární degeneraci (bílé šipky) v renálních tubulárních epitelech. HE barvení, měřítko=50 µm.

3.3.NiCl (Niklchlorid)indukuje autofagii a zvyšuje geny a proteiny související s autofagií v ledvinách

LC3 a p62 jsou klíčové biomarkeryautofagie(Gomez-San-chez et al..2016). Ve srovnání s kontrolou, tři NiCl2 (Niklchlorid 2) léčebné skupiny byly svědky významného zvýšení hladiny proteinu LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagieje také stanovení pomocí TEM v této studii. Jak je znázorněno na obr. 3F, pozorování TEM ukázala, že počty autolyzozomů se zvýšily v renální tkáni po NiCl2 (Niklchlorid 2)vystavení.

Obr. 3. NiCl2 (Niklchlorid 2)zvyšuje autofagii v ledvinách myší.

(A) Výsledky western blotu LC3 a p62. (B, C) Kvantifikace LC3-II/I a p62. (DE) Exprese mRNA LC3 a p62. (F)

Ultrastrukturální struktura epiteliální buňky proximálního stočeného tubulu (pravé obrázky znázorňují částečné zvětšení levých obrázků; černé šipky označují autolyzozomální struktury).

Hodnoty jsou uvedeny s průměrem ± standardní odchylka (n {{0}}). Sloupce označené různými písmeny představují významné rozdíly (P <>

Dále byla imunohistochemie použita pro měření hladin proteinů LC3B a p62 vledvinatkáně v této studii. Jak je znázorněno na obr. 4, pozitivní buňky se zbarvily hnědě a LC3B a p62 byly exprimovány hlavně v cytoplazmě epiteliálních buněk renálních tubulů. Ve srovnání s kontrolou vykazovaly hodnoty IOD LC3B významný nárůst (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Niklchlorid) ve dnech 14 a 28. Kromě toho byly hodnoty IOD p62 významně sníženy (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Obr. 4. Imunohistochemické výsledky LC3B a p62 v ledvinách myší.

(A) Imunohistochemické snímky LC3B. (měřítko=50 µm) (B) Imunohistochemické snímky p62 (měřítko=50 µm)

(C) Integrovaná optická hustota (IOD) LC3B. (D) Integrovaná optická hustota (IOD) p62.

Hodnoty jsou uvedeny s průměrem ± standardní odchylka (n {{0}}). Sloupce označené různými písmeny představují významné rozdíly (P <>

Geny a proteiny související sautofagiea zapojený doautofagietok byl měřen pro další ověření účinků NiCl (Niklchlorid) naautofagie. Ty zahrnovaly Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 a Atg3 (Li a Zhang. 2019; Nishimura a Tooze, 2020). Jak je ukázáno na obr. 5A-C, ve srovnání s kontrolou, léčené skupiny Ni (Nikl)vykazují významně vyšší hladiny proteinů Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 a Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Obr. 5. NiCl2 (Niklchlorid 2)zvyšuje geny a proteiny související s autofagií v ledvinách myší.

(A) Výsledky Western blotu Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 a Atg3. (B&G) Kvantifikace exprese proteinů Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 a Atg3.

(HM) mRNA exprese Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 a Atg3. Hodnoty jsou uvedeny s průměrem ± standardní odchylka (n=8). Sloupce označené různými písmeny představují významné rozdíly (P <>

3.4.NiCl2 (Niklchlorid 2)indukuje dráhy PI3K/Akt/mTOR a AMPK v ledvinách

mTOR je nezbytným regulátoremautofagie(Wang et al., 2017). A dobře zavedené upstream regulační dráhy mTOR zahrnují PI3K/Akt a AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020). Tato studie tedy měřila protein drah AMPK a PI3K/Akt.

Jak ukazují Fg.6A a B, bylo zjištěno, že hladiny proteinů p-PI3K, p-AKT a p-mTOR mají významný pokles (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Niklchlorid 2)ve dnech 14 a 28 experimentu vzhledem ke kontrole. Ošetřené skupiny vykazovaly hladiny proteinu p-AMPK a p-ULK1 významně vyšší (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Niklchlorid 2)- u léčebných skupin bylo zjištěno významné snížení exprese mRNA PI3K, AKT a mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Tyto výsledky to ukazujíautofagieindukované NiCl2 (Niklchlorid 2)v myších ledvinách zahrnoval dráhy AMPK a PI3K/Akt/mTOR.

Obr. 6. NiCl2 (Niklchlorid 2)indukuje signální dráhy PI3K/Akt/mTOR a AMPK v ledvinách myší.

(A) Výsledky western blotu p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 a ULK1.

(BF) Kvantifikace exprese proteinu p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR a p-ULK1/ULK1. (G, K)

Exprese mRNA PI3K, AKT, AMPK, mTOR a ULK1. Hodnoty jsou uvedeny s průměrem ± standardní odchylka (n=8). Sloupce označené různými písmeny představují významné rozdíly (P <>

PRO ROZDĚLENÍ KLIKNĚTE ZDEⅡ