KAEMPFEROL CHRÁNÍ PŘED DIABETICKOU KARDIOMYOPATIÍ INDUKOVANÉ STREPOZOTOCINEM U POKRAS HYPOGLYKEMICKÝM EFEKTEM A UPREGULACE SIRT1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Tato studie zkoumala, zda by kaempferol mohl zmírnitoxidačnízánětlivé a fibrotické poškození levých komor (LV) u streptozotocinových (STZ)-diabetických potkanů ​​modulací signalizace homologu 1 regulace informace o tichém párování (SIRT1). Dospělí samci potkanů ​​byli rozděleni do 5 skupin (n=12/každý) jako kontrola, kontrola plus kempferol, diabetes mellitus vyvolaný STZ (STZ-DM), STZ-DM plus kempferol a STZ-DM plus kempferol plus EX -527, inhibitor sirtuinu 1 (SIRT1). Podávání kempferolu diabetickým potkanům významně zachovalo systolické a diastolické funkce LK, které byly spojeny s významným snížením ukládání kolagenu v komorách, infiltracízánětlivé buňkya proteinová exprese Bcl2-asociovaného X proteinu (Bax), štěpené kaspázy-3 a cytochromu-C. U kontrolních i diabetických potkanů ​​kemferol zmírnil ztrátu tělesné hmotnosti, snížil hladověníhladiny glukózya zvýšené hladiny inzulínu nalačno a HOMA-b. Kromě toho kempferol snižoval hladiny reaktivních forem kyslíku (ROS),malondialdehyd(MDA), tumor nekrotizující faktor-a (TNF-a) a interleukin-6 (IL-6), downregulovaly transformující růstový faktor-b1 (TGF-b1) a snížily jaderné hladiny NF-kB p65. Souběžně s tím kemferol zvýšil LV hladiny mangan superoxiddismutázy (MnSOD) a glutathionu (GSH) a stimuloval celkové hladiny proteinu Bcl2, jadernou aktivitu SIRT1 a jaderné hladiny jaderného faktoru erytroidního 2-souvisejícího faktoru 2 (Nrf2). Tyto události byly spojeny se zvýšenou aktivitou deacetylázy a celkovými hladinami SIRT1 a paralelním poklesem acetylace Nrf2, NF-kB, smad2 a FOXO1. Závěrem: kaempferol zmírňuje diabetickou kardiomyopatii u potkanů ​​léčených STZ prostřednictvím svých hypoglykemických účinků a účinků uvolňujících inzulín, jakož i mechanismu nezávislého na srdci, který zahrnuje aktivaci SIRT1.

Kliknutím sem se dozvíte více

ÚVOD

Diabetická kardiomyopatie (DC), identifikovaná abnormalitami ve struktuře a funkci srdce při absenci jakýchkoli jiných rizikových faktorů nebo poruch, je hlavní hlavní příčinou srdečního selhání (HF) a zvýšené mortality u diabetických pacientů (1). Nedávné míry prevalence DC jsou alarmující a pohybují se celosvětově od 19 do 26 procent (2). Hlavní klinická manifestace DC u postižených jedinců však zahrnuje dysfunkční hypertrofii levé komory (LK), nepříznivou remodelaci a poruchu časných diastolických a pozdních systolických funkcí (2). Hyperglykémie zůstává hlavní příčinou zodpovědnou za rozvoj DC prostřednictvím aktivace několika vzájemně propojených drah, které indukují oxidační stres,

zánět, fibróza aapoptóza, hlavní znaky nemoci (2-4). Tyto dráhy zahrnují poškození mitochondriální oxidativní fosforylace a zpracování Ca2 plus, aktivaci lokálního systému renin-angiotensin, změněný srdeční metabolismus a signální dráhy, nadprodukci ROS, abnormálně snížené antioxidanty a změněné aktivity několika transkripčních faktorů ({{3} }). V současné době je dobře známo, že aktivace několika drah generování ROS, potlačení jaderného faktoru erytroidního 2-příbuzného faktoru 2 (Nrf2), hlavního antioxidačního transkripčního faktoru, aktivace jaderného faktoru kappaB (NF-kB) a posílení transformujících růstových faktorů-b1 (TGF-b1)/smad2/3, stejně jako aktivace vnitřní (mitochondriemi zprostředkované) buněčné apoptózy jsou hlavní související molekulární mechanismy zodpovědné za hyperglykémií indukované DC u zvířat i lidé (2, 7-11).

Proto kontrola hyperglykémie a/nebo potlačení těchto poškozujících drah zůstává nejpřijatelnější strategií k prevenci/zmírnění DC. Sirtuiny, rodina buněčných signálních proteinů, byly rozpoznány jako důležitý regulátor buněčné homeostázy v reakci na stresové podněty (12). Mezi všemi izoformami je SIRT1 (silent mateing type information Regulation 2 homolog 1), nikotinamid adenindinukleotid-(NAD plus)-dependentní deacetyláza, vysoce exprimována v srdci savců a hraje klíčovou roli ve vývoji a ochraně srdce (13). Ochranná role SIRT1 byla prokázána in vitro a in vivo na několika zvířecích modelech, jako je ischemie, ischemie/reperfuze (I/R), infarkt myokardu a HF (12-15). SIRT1 také chránil před rozvojem a progresí DC a následného srdečního selhání, kde bylo hlášeno, že jeho srdeční hladiny byly za těchto stavů významně sníženy (16-20). V souladu s tím několik studií ukázalo, že transgenní nebo farmakologická aktivace SIRT1 nejen zachovala srdeční funkci, ale také zabránila hyperglykémii indukovanému srdečnímu oxidačnímu stresu, zánětu, apoptóze a fibróze u diabetických srdcí (17, 20, 21). Celkově tyto studie dospěly k závěru, že ochranný účinek SIRT1 je připisován jeho schopnosti deacetylovat několik mediátorů a transkripčních faktorů, včetně Nrf2, Sch66, NF-kB RelA/p65, FOXO3, p53, PGC-1a a smad2/3 (12, 17, 18, 20, 22-26). V současné době má kardioprotektivní potenciál některé přírodníflavonoidy-Zprostředkováno upregulací/aktivací SIRT1 bylo prokázáno v literatuře a dostalo se mu velké pozornosti (17, 21, 27). Kaempferol je hlavní flavonoid, který se hojně vyskytuje v zelenině a má mnoho potvrzených klinických terapeutických potenciálů proti zánětlivým, jaterním, ledvinovým a kardiovaskulárním poruchám (21). Terapeutický potenciál kaempferolu je různorodý a zahrnuje antioxidační, protizánětlivé, antifibrotické a antiapoptotické účinky (21). V rámci tohoto pohledu několik autorů prokázalo silnou schopnost kaempferolu snižovat ROS a zánětlivé cytokiny, inhibovat NF-kB a TGF-b1 a stimulovat osu Nrf-2/antioxidant za různých podmínek (25, {{15 }}). Kromě toho byl kaempferol popsán jako antidiabetikum, které může zmírnit antihyperglykémii a stimulovat sekreci inzulínu (32-34). Pokud jde o jeho kardioprotekci, kaempferol zachoval srdeční funkci a integritu mitochondrií a potlačil zánět, fibrózu a apoptózu u různých zvířecích modelů poškození srdce, včetně poranění I/R, HF indukovaného doxorubicinem (DOX)/ANG II a DC (29 , 35-37). Ve velmi nedávné elegantní studii kaempferol zabránil vnitřní buněčné smrti vyvolané vysokou glukózou (HG)/hyperglykémií u buněk H9c2 a srdcích potkanů ​​léčených streptozotocinem (STZ) potlačením produkce zánětlivých cytokinů a aktivací NF-kB a TGF. -b1, stejně jako stimulace Nrf2 (31). V naší nejnovější studii jsme prokázali schopnost kaempferolu chránit před nefropatií vyvolanou STZ vychytáváním ROS, upregulací antioxidantů, aktivací Nrf2 a supresí NF-kB (36). Přes jeho dobře uváděné antioxidační a protizánětlivé účinky však zůstává přesný molekulární mechanismus (mechanismy) za kardioprotektivním účinkem kempferolu u diabetických potkanů ​​nejasný. Zajímavé je, že kaempferol zmírnil poškození kardiomyocytů vyvolané anoxií/reoxygenací; I/R-indukované poškození nervů a plic, chlorid kademnatý (CdCl2) - indukované hipokampální poškození a peroxid vodíku (H2O2) - indukované poškození sítnice aktivací SIRT1 (36, 38-42). Proto jsme v této studii a na základě těchto důkazů předpokládali, že chronické podávání kempferolu zachovává srdeční funkci a inhibuje oxidační stres, zánět, fibrózu a apoptózu u potkaního modelu DC indukovaných STZ aktivací SIRT1. Kromě toho jsme tuto hypotézu testovali společným podáváním EX527, selektivního inhibitoru SIRT1.

MATERIÁLY A METODY

Etické prohlášení Všechny postupy byly schváleny etickou komisí pro zvířata při KKU, která se řídí předpisy a směrnicemi publikovanými americkým Národním institutem zdraví. Zvířata Celkem 60 dospělých samců potkanů ​​Wistar (150 ± 5 g/7 týdnů starých) bylo dodáno ze zvířátka na College of Science na Univerzitě krále Khalida (KKU), Abha, Saúdská Arábie a udržela se tam během experimentálního postupu. Všechny krysy byly umístěny v plastových klecích jako 4 krysy/klec a měly vždy volný přístup ke své normální potravě a pitné vodě. Životní podmínky byly 21 ± 1 stupeň, vlhkost 60 procent a cyklus tma/světlo 12/12 h. Indukce diabetes mellitus (DM) DM byla indukována u vybraných potkanů, jak je popsáno jinými (43, 44). Stručně řečeno, každá krysa hladověla po dobu 12 hodin a poté byla ip injikována STZ (Ab142155, Abcam, UK, Cambridge) připraveným v 0.1 M citrátovém pufru (65 mg/kg/ pH 4,5). Během prvních 24 hodin po ošetření STZ byl všem potkanům dodáván 5% roztok glukózy, aby se zabránilo náhlé hypoglykémii. V den 3 byly měřeny hladiny glukózy v krvi pomocí dodané soupravy (kat. č. 10009582, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) a do studie byli zahrnuti krysy s glykémií vyšší než 300 mg/kg a považovány za diabetiky. . Experimentální design Krysy byly rozděleny do 5 skupin (n=12/každá) jako 1) Kontrolní skupina: nediabetičtí potkani a dostali pouze 0,1% roztok DMSO, orálně, jako vehikulum; 2) Kontrolní skupina a skupina léčená kaempferolem: byli nediabetičtí potkani a dostávali denní žaludeční sondou orální dávku kaempferolu (připraveného v 0,1% DMSO) (kat. č. K0133, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) (50 mg /kg); 3) STZ-indukovaná diabetická modelová skupina (STZ-DM): byli diabetici potkani, kteří dostávali pouze orální denní dávku 0,1 procenta DMSO; 4) STZ-DM plus kaempferol: byli diabetici potkani, kteří dostávali denní perorální dávku roztoku kaempferolu (50 mg/kg), a 5) skupina léčená STZ-DM plus kaempferol plus EX-527-: kteří byli léčeni EX{ {48}}, selektivní inhibitor SIRT1 v konečné dávce 5 mg/kg (ip dvakrát/týden). Všechna ošetření byla prováděna po dobu 8 týdnů, což je období, u kterého bylo prokázáno, že indukuje DC u hlodavců (31). Dávka kempferolu byla zvolena na základě předchozích studií, které prokázaly několik ochranných účinků při koncentraci a stimulační účinek na SIRT1 (38, 40). In vivo dávka EX-527 byla vybrána pro studii Eida et al. (45), kteří prokázali, že taková koncentrace může maximálně inhibovat srdeční SIRT1 bez jakýchkoli nežádoucích účinků (45). Měření srdeční hemodynamiky Měření hemodynamických parametrů byla prováděna tři dny po posledním ošetření. Stručně řečeno, všechny krysy byly nalačno po dobu 12 hodin a byly hluboce anestetizovány roztokem 80/12 mg/kg ketamin hydrochloridu/xylazin hydrochloridu (kat. č. K-113, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA). Po potvrzení anestezie byla každá krysa umístěna na vyhřívací stůl v poloze na zádech. Teplota byla monitorována pomocí anální sondy. Poté byla otevřena kůže krku a byla přidělena levá karotidartérie a byla uvolněna z okolních nervů a tkání. Tlakově kalibrovaný Millar katétr (model č. SPR 320), který je připojen k 16kanálovému systému sběru dat Power Lab (model č. 16/35, ADInstruments Pty Ltd., Bella Vista, NSW, Austrálie), byl zaveden přes krční tepnu do LV srdce. Signál tlaku LV byl zaznamenáván po dobu 20 minut a uložen. Uložený signál byl poté analyzován pomocí softwaru LabChart (verze 8, ADInstruments, Pty Ltd., Bella Vista, NSW, Austrálie) a byly odvozeny následující parametry: LVSP (LV systolický tlak) a LVEDP (LV enddiastolický tlak). Během analýzy nebylo zahrnuto prvních 5 minut záznamu a bylo považováno za stabilizační fázi.

Cistanche pro zlepšení paměti

Přímo po změření hemodynamických parametrů se otevřel hrudník a vzorky krve byly přímo odebírány ze srdce do obyčejných zkumavek, které byly centrifugovány při 1200 x g, aby se shromáždilo sérum. Všechny vzorky séra byly skladovány při –20 stupních pro další biochemickou analýzu. Poté byla srdce rychle extrahována, zvážena a umístěna na led. LV každého srdce byla odstraněna a nařezána na menší kousky. Některé kusy byly umístěny do 10% pufrovaného formalínového roztoku na 24 hodin a odeslány k histologickému zpracování. Ostatní tkáně každé LV byly bleskově zmraženy a skladovány při -80 stupních a později použity pro biochemickou a molekulární analýzu. Příprava tkáňových homogenátů a jaderných extraktů Části zmrazené LV byly homogenizovány v 9 objemech buď fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (PBS/pH=7,4) nebo 1X RIPA pufru (kat. č. 156034, Abcam, Cambridge, UK) plus 10 ug/ml inhibitoru proteázy (kat. č. 78429, ThermoFisher Sci, Waltham, MA, USA). Homogenáty byly odstředěny při 11 000 x g (4 stupně), aby se shromáždily supernatanty, které byly skladovány při -80 stupních a později použity pro biochemické a Western blotting, v daném pořadí. Části zmrazených LV byly také použity k přípravě jaderných a cytoplazmatických extraktů za použití komerčně dostupné soupravy (kat. č. 113474, Abcam, Cambridge, UK) podle pokynů výrobce. Čistota jaderných a cytoplazmatických frakcí byla testována westernovým přenosem s použitím VDAC a a-tubulinu a protilátek, v daném pořadí. Hladiny proteinů všech buněčných frakcí byly měřeny pomocí soupravy pro stanovení proteinů založené na Bradfordu (kat. č. 23200; Thermo-Fisher Sci., Waltham, MA, USA). podle pokynů výrobce. Biochemické měření v séru Hladiny glukózy nalačno v séru byly měřeny pomocí testovací soupravy (kat. č. 10009582 Cayman Chemicals Co., Ann Arbor, MI, USA). Hladiny inzulínu v séru nalačno byly měřeny pomocí soupravy ELISA (kat. č. ELR-Insulin-1; RayBiotech Inc., Peachtree Corners, GA, USA). Funkce endokrinních pankreatických b-buněk byla měřena pomocí indexu HOMA-b vypočteného podle následujícího vzorce: [inzulin nalačno (ng/ml) × 20]/[glukóza nalačno (mg/dl) – 3,5] (46) . Sérové ​​hladiny kreatininkinázy-MB (CKMB) byly měřeny pomocí souprav ELISA (kat. č. MBS2515061 a kat. č., MyBioSource, San Diego, CA, USA, v tomto pořadí). Sérové ​​hladiny troponinu-I byly měřeny pomocí ELISA (Ab246529, Abcam, Cambridge UK). Biochemické měření v homogenátech levé komory Celkové hladiny redukovaného glutathionu (GSH) a mangan superoxiddismutázy (MnSOD) v homogenátech LK byly měřeny soupravami ELISA (kat. č. MBS046356 a kat. č.

VÝSLEDEK

Hladiny glukózy v séru nalačno byly významně zvýšeny, zatímco hladiny inzulínu v séru nalačno, hladiny indexu HOMA-b a konečná tělesná hmotnost potkanů ​​byly významně sníženy u diabetických potkanů ​​vyvolaných STZ ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 1A{{3} }D). Na druhé straně sérové ​​hladiny glukózy nalačno byly významně sníženy, ale konečná tělesná hmotnost potkanů ​​a hladiny inzulínu nalačno a HOMA-b se významně zvýšily jak u kontrolních potkanů ​​s kaempferolem, tak u potkanů ​​léčených STZ plus kaempferolem ve srovnání kontrolním potkanům, respektive potkanům léčeným STZ (obr. 1A-1D). Naopak hladiny glukózy nalačno zůstaly významně vyšší a hladiny inzulínu a HOMA-b, stejně jako konečná tělesná hmotnost potkanů ​​zůstaly významně nižší u STZ plus kempferol ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 1A-1} D). Kromě toho nebyly žádné významné rozdíly v hladinách glukózy a inzulínu v séru nalačno, stejně jako v hladinách HOMA-b a konečné tělesné hmotnosti potkanů, když bylo provedeno srovnání mezi STZ plus kaempferol vs. STZ plus kaempferol plus EX{{ 13}} (inhibitor SIRT1) (obr. 1A-1D). Kaempferol zachovává strukturu levé komory a hemodynamickou funkci v srdcích krys s diabetem streptozotocinu způsobem závislým na SIRT1-. pozorované u kontrolních potkanů ​​a potkanů ​​léčených kaempferolem ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 2A a 2B). Kromě toho kontrolní a krysy léčené kaempferolem vykazovaly významné zvýšení LVSP, ale žádnou změnu v LVEDP a sérových hladinách CK-MB a troponinu-I ve srovnání s kontrolními krysami (obr. 3A-3D). Nicméně abnormálně orientované myofibrily se zvýšeným poškozením myofibril, hypertrofované kardiomyocyty, karyolytická jádra a infiltrace makrofágů byly pozorovány v LV diabetických potkanů ​​indukovaných STZ ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 2C a 2D). Kromě toho STZ-diabetičtí potkani měli také významně vyšší hodnoty LVSP a sérové ​​hladiny CK-MB a troponinu-I s paralelním významným snížením hodnot LVSP (obr. 3A-3D). Téměř normální struktura kardiomyocytů s významným snížením hodnot LVEDP a sérových hladin CM-MB a troponinu-I a významným zvýšením hodnot LVSP byla pozorována u potkanů ​​léčených STZ plus kaempferolem ve srovnání s kontrolními potkany ( obr. 2E a 3A-2D). Nicméně zlepšení ve všech těchto markerech u potkanů ​​léčených STZ plus kempferolem zůstalo významně odlišné mezi kontrolními potkany a potkany léčenými STZ plus kempferolem. Nicméně zrcadlové strukturální změny, jako jsou ty nalezené v LV STZ-diabetických potkanů, byly také pozorovány v životech potkanů ​​léčených STZ plus kempferol plus EX-527- (obr. 2F). Kromě toho nebyly pozorovány žádné významné odchylky v hladinách LVSP a LVEDP, stejně jako v sérových hladinách CK-MB a troponinu-I, když byly STZ-diabetické krysy srovnávány s krysami léčenými STZ plus kempferol plus EX-527- (obr. 3A-3D). Tyto údaje naznačují, že zlepšení struktury a funkce srdce po kaempferolu je závislé na SIRT1-. Kaempferol indukuje na SIRT1-závislou supresi fibrózy levé komory snížením regulace transformačního růstového faktoru-b1 V LV kontrolních a kontrolních potkanů ​​a potkanů ​​léčených kaempferolem bylo pozorováno několik normálních hladin kolagenových vláken (obr. 4A, 4B a 4G ). Zvýšená depozice kolagenu byla pozorována v LV diabetických krys indukovaných STZ ve srovnání s kontrolou nebo kontrolními plus krysami ošetřenými kempferolem (obr. 3C a 3G). Bylo však pozorováno zřejmé snížení ukládání kolagenu v LVs STZ plus kempferol a ve srovnání s potkany ošetřenými STZ (obr. 4D a 4E). Na druhé straně, zvýšená depozice kolagenu byla také pozorována v LVs STZ plus kaemferol plus EX-527 ve srovnání s STZ plus kaempferol (obr. 4F a 4G). Současně byly pozorovány zvýšené hladiny proteinu TGF-b1 v LV STZ-diabetických potkanů ​​ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 4H). Nicméně hladiny proteinu TGF-b1 byly významně sníženy v LV jak u kontroly plus kempferolu, tak u STZ plus kempferolu ve srovnání s kontrolními nebo STZ-diabetickými potkany (obr. 4H). Je třeba poznamenat, že při srovnání STZ-diabetických potkanů ​​s STZ plus kempferol plus EX-527 nebyla pozorována žádná významná změna v hladinách proteinu TGF-b1 (obr. 4H). Kaempferol inhibuje oxidační stres a zánět levé komory SIRT1-závislou upregulací Nrf2 a supresí NF-kB p65 Celkové hladiny ROS, MDA, IL-6 a TNF-a, stejně jako nukleární hladiny NF-kB p65 byly významně zvýšeny, ale celkové hladiny GSH a SOD, stejně jako jaderné hladiny Nrf2, byly významně potlačeny v LV potkanů ​​indukovaných STZ ve srovnání s kontrolními potkany (obr. 5A{ {94}}D a 6A-6D). Nicméně významné snížení celkových hladin ROS, MDA, IL-6 a TNF-a a jaderných hladin NF-kB p65 se současným zvýšením hladin SOD, GSH a jader hladiny Nrf2 byly pozorovány v LV jak kontroly plus kempferolu, tak STZ plus kempferolu ve srovnání s kontrolními nebo STZ-diabetickými potkany, v daném pořadí (obr. 5A{104}}D a 6A{106}}D). Nebyly však pozorovány žádné významné rozdíly v hladinách všech těchto parametrů u potkanů ​​léčených STZ plus kempferol a STZ plus kempferol plus EX{107}}, což naznačuje, že antioxidační a protizánětlivé účinky kempferolu jsou oba SIRT{109} }závislá (obr. 5A-5D a 6A-6D). Kaempferol inhibuje vnitřní buněčnou smrt kardiomyocytů v mechanismu závislém na SIRT{114}} Beze změn v hladinách cytoplazmatického proteinu cytochromu-C ani v hladinách celkového proteinu Bax a štěpené kaspázy-3, celkové hladiny proteinu Bcl2 se významně zvýšily .

STZ plus kempferol ve srovnání s kontrolními nebo STZ-indukovanými diabetickými krysami, v daném pořadí (obr. 8A, 8B a 9A-9C). Podávání EX-527, selektivního inhibitoru SIRT1, významně snížilo jadernou aktivitu a lokalizaci SIRT1 ve srovnání se všemi ostatními skupinami (obr. 8A, 8B a 9A- 9D). Kromě toho hladiny acetylu NF-kB p65 zůstaly významně vyšší, ale hladiny proteinu acetyl Nrf2 a FOXO1 se významně nelišily mezi STZ-diabetickými potkany a STZ plus kempferol plus EX-527 (obr. 9A-9C ).

DISKUSE

Údaje této studie potvrdily dříve publikovanou studii Chena a kol. (29) a podporují zjištění, která naznačují, že kardioprotektivní účinek kaempferolu proti STZ-indukovaným DC u potkanů ​​je zprostředkován hypoglykemickými, antioxidačními, protizánětlivými, antifibrotickými a antiapoptotickými účinky. Novým zjištěním této studie však je, že poprvé ukazujeme, že všechny tyto srdeční ochranné mechanismy, které poskytuje kaempferol, jsou závislé na SIRT1-, kde blokuje SIRT1 selektivním inhibitorem, EX-527 zrušil všechny příznivé srdeční účinky kempferolu. Souhrn mechanismů ochrany, kterou poskytuje kaempferol proti DC indukovaným STZ, je znázorněn na obr. 10. Hyperglykémie způsobená zvýšenou destrukcí b-buněk je hlavní příčinou rozvoje a progrese DC u lidí a experimentálních zvířat (2, 4, 47). STZ, cytotoxický analog glukózy, je nejběžnějším lékem, který vede k oxidační destrukci b-buněk a je široce používán k vytvoření DM u hlodavců, jak je ukázáno v této studii (48). Podávání kaempferolu kontrolním i diabetickým potkanům však významně snížilo hladiny glukózy a inzulínu v séru nalačno a významně zvýšilo hodnoty HOMA-b, hlavního indexu funkce pankreatických b-buněk, čímž se přizpůsobilo jeho silné hypoglykémii a inzulínu. - uvolňující účinky. Kromě toho zvýšil konečnou tělesnou hmotnost krys, což naznačuje zlepšené periferní působení inzulínu a zmírnění úbytku svalů a tukové tkáně vyvolané nedostatkem inzulínu. Přesný mechanismus, kterým kempferol snižuje hladiny glukózy v krvi a stimuluje hladiny inzulínu v krevním oběhu, však nebyl v této studii zkoumán a může být ovlivněn podobnými předchozími studiemi. V tomto ohledu kaempferol chránil oxidační poškození pankreatických buněk vyvolané STZ v důsledku

jeho antioxidační vlastnosti (32, 33). Pokud je to však správné, naše data naznačují, že takový antioxidační ochranný mechanismus pankreatických b-buněk není závislý na modulaci hladin a aktivity pankreatického SIRT1, protože normální metabolické parametry byly pozorovány u diabetických potkanů, kteří byli léčeni kaemferolem a inhibitorem SIRT1 (EX{ {5}}). Na druhé straně jiné studie ukázaly, že hypoglykemický účinek kempferolu je zprostředkován zlepšením periferní citlivosti na inzulín, stimulací exprese GLUT-4, zvýšením periferního vychytávání glukózy a potlačením jaterní glukoneogeneze (31, 33). Kromě toho by mohlo být možné, že hypoglykemické a inzulín uvolňující účinky kempferolu jsou zprostředkovány stimulací uvolňování inzulínu z přeživších b-buněk prostřednictvím modulace depolarizace buněčné membrány (tj. stimulace ATP-senzitivních K plus kanálů), což je účinek, který je podobný na sulfonylmočovinové léky (49, 50). Na druhé straně je nadprodukce ROS hlavním charakteristickým znakem během rozvoje DC a dalších komplikací vyvolaných DM a je hlavním patofyziologickým mechanismem, který je základem všech ostatních nežádoucích účinků včetně zánětu, fibrózy a apoptózy (10, 51). Ve skutečnosti blokování výroby,

ROS nadměrnou expresí nebo farmakologickou aktivací Nrf2 a dalších antioxidantů (tj. N-acetylcysteinu (NAC), katalázy a SOD) zmírnily většinu diabetických komplikací a inhibovaly zánětlivé a apoptotické dráhy v serválních tkáních včetně srdce (10, {{3} }). Obecně platí, že hyperglykémie indukuje srdeční ROS zvýšením stimulace autooxidace, peroxidace lipidů a dalších drah generujících ROS, jako je angiotensin II/NDAPH oxidáza, syntáza oxidu dusnatého (NOS), lipoxygenáza (LOX), volné mastné kyseliny/poškození mitochondrií a proteiny. kináza C (PKC), pokročilé glykační koncové produkty (AGE), hexaminové a polyolové dráhy (4, 5, 11, 51, 55, 56). Hyperglykémií indukovaná ROS může naopak stimulovat srdeční zánět zvýšením exprese několika zánětlivých cytokinů a adhezivních molekul, infiltrací monocytů/neutrofilů a aktivací zánětu NF-kB/NRLP3 (2, 7, 8, 56-58). Kromě toho mohou ROS a zánětlivé cytokiny stimulovat srdeční vnitřní a vnější buněčnou smrt a fibrózu stimulací exprese Bax, downregulací Bcl2 a aktivací signální dráhy TGF-b/Samd2/3 (2, 9, 59, 60). Kromě toho hyperglykémie inhibuje degradaci kolagenu zvýšením jeho glykosylace interakcí s AGE, což dále podporuje srdeční ztuhlost

(61). Zatímco však časná hyperglykémie stimuluje transaktivaci Nrf2, prodloužená hyperglykémie přemohla antioxidanty a potlačila aktivaci těchto transkripčních faktorů (39, 62). Po těchto studiích byla úloha ROS, oxidačního stresu, zánětu, fibrózy a apoptózy ve vývoji a progresi DC v našem zvířecím modelu také potvrzena zjevným poškozením LV u potkanů, ukládáním kolagenu, zvýšenými markery vnitřních buněk smrt (tj. vyšší Bax, štěpená kaspáza-3 a cytochrom-C a snížená Bcl2) a snížení funkce LK. Tyto nálezy byly také doprovázeny významným zvýšením srdečních hladin ROS, lipidových peroxidů a zánětlivých cytokinů a aktivací NF-kB p65 a TGF-b1. Kromě toho léčba STZ snížila jaderné hladiny Nrf2, stejně jako celkové hladiny GSH a SOD. Naopak, kaempferol byl schopen zachovat funkci LK, snížit ukládání kolagenu, potlačit srdeční fibrózu a zvrátit změny ve všech těchto biochemických dějích, což naznačuje silné antioxidační, protizánětlivé, antifibrotické a antiapoptotické účinky. Důležitým pozorováním v této studii je, že kaempferol byl také schopen snížit hladiny MDA a ROS, potlačit jadernou lokalizaci NF-kB p65 a stimulovat jaderné hladiny Nrf2 a celkové hladiny GSH a SOD, aniž by došlo ke změně exprese apoptotických/antiapoptotických markerů ani TGF-b1 v srdcích kontrolních krys. Na základě těchto dat můžeme silně tvrdit, že kardioprotektivní účinek kempferolu proti DC v tomto zvířecím modelu je zprostředkován antioxidačním a protizánětlivým potenciálem zprostředkovaným především aktivací/upregulací Nrf2 a supresí NF-kB p65. Tyto údaje mohou také naznačovat, že pozorovaný antifibrotický a antiapoptotický potenciál kempferolu v diabetických srdcích by mohl být sekundární k jeho antioxidačním a protizánětlivým účinkům. Tato data jsou podpořena nedávnou studií Chena et al. (31), kteří také prokázali, že kaempferol inhibuje oxidační stres, zánět, fibrózu a vnitřní buněčnou apoptózu v buňkách H9c2 vystavených vysoké glukóze, stejně jako v srdci diabetických potkanů ​​indukovaných STZ, hlavně upregulací Nrf2 a inhibicí NF- kB. Stejným způsobem byl ochranný účinek kaempferolu proti poškození srdce, ledvin a nervů u jiných zvířecích modelů připisován především jeho schopnosti vychytávat ROS a potlačení zánětu zprostředkovaného aktivací Nrf2 a supresí NF-kB (29, { {38}}, 40).

potenciál kaempferolu a jeho kardioprotekce u diabetických srdcí nebyly nikdy předtím testovány. Z tohoto důvodu bylo v našem zájmu prozkoumat účinek kempferolu na expresi SIRT1, hlavního proteinu, který hraje významnou roli během buněčné stresové reakce. Tato hypotéza byla založena na širokých účincích, antioxidačních, protizánětlivých, antifibrotických a antiapoptotických účincích SIRT1 (12). Kromě toho jsou hladiny a aktivita SIRT1 významně vyčerpány v srdci během pozdního DM a v selhávajících srdcích, zatímco aktivace SIRT1 zachovala srdeční funkci a zcela zrušila související srdeční oxidační stres, zánět a apoptózu (20, 21, 26). Také inaktivace SIRT1 v kardiomyocytech vedla ke klinickým symptomům, které vypadají velmi podobně jako DC, zatímco resveratrol, aktivátor SIRT1, to zvrátil. Kamferol může také aktivovat SIRT1 v mozku, plicích, sítnici a kardiomyocytech in vitro nebo in vivo na jiných zvířecích modelech (36, 40-42). Naše současné chápání systémové ochranné role SIRT1 je však v současnosti dobře zavedené a je připisováno jeho deacetylázové aktivitě (12). V souladu s tím může SIRT1 deacetylovat p53 na Lys373/Lys382 a antagonizovat p53-indukovanou Bax upregulaci a následnou aktivaci vnitřní buněčné apoptózy a předčasné stárnutí (12, 69). SIRT1 také inhibuje p300/CBP-associated factor (PCAF), který stabilizuje p53 (70). Kromě toho je protizánětlivý účinek SIRT1 zprostředkován deacetylací RelA/p65 podjednotky na Lys310 v NF-kB a následnou ztrátou NF-kB transkripční aktivity (71-73). Regulace redoxního stavu a antioxidační potenciál SIRT1 jsou však zprostředkovány deacetylací serválních transkripčních faktorů, včetně FOXO-3a a Nrf2, které oba stimulují syntézu několika antioxidantů, jako jsou antioxidační enzymy (např. kataláza, glutathionperoxidáza SOD) a GSH (20, 21, 25, 74). Ve skutečnosti, ačkoli některé studie ukázaly, že pro jeho aktivaci je nutná acetylace Nrf2 (75). Další dostupné důkazy ukázaly, že SIRT1-indukovaná deacetylace Nrf2 zvyšuje transkripci Nrf2 a jeho jadernou lokalizaci a stabilitu (76). Kromě toho může SIRT1 také modulovat srdeční strukturu a kontraktilitu tím, že zachovává expresi SERCA2 a inhibuje tvorbu ROS downregulací a inhibicí mitochondriální biogeneze zprostředkované psch66 a FOXO3/PGC-a (17, 77). SIRT1 může také přímo blokovat tkáňovou fibrózu deacetylací Smad2/3 (44, 78). Podobně jako u výše uvedených důkazů se zdá, že významné snížení aktivity jaderné deacetylázy a exprese SIRT1 v srdcích diabetiků se významně podílí na pozorovaných účincích poškozujících srdce 90 dní po indukci DM. Takové snížení hladiny/aktivity SIRT1 vedlo k významnému zřejmému zvýšení acetylovaných hladin smad2, NF-kB, FOXO3 a Nrf2, čímž se potencuje produkce ROS, snížení hladin antioxidantů, zánět a vnitřní buněčná smrt. Novým zjištěním v této studii však je, že kaempferol byl schopen upregulovat a aktivovat SIRT1 a deacetylovat, všechny tyto transkripční faktory v srdcích kontrolních i STZ-DM potkanů, čímž se potvrzuje dříve zmíněný důkaz, že kaempferol je účinný aktivátor. z SIRT1. Abychom otestovali, zda jsou mechanismy ochrany dostatečně indukovány SIRT1, podávali jsme společně s krysami s cukrovkou EX-527, selektivní inhibitor SIRT1, spolu s kempferolem. Jak se očekávalo, podávání EX-527 zcela zrušilo všechny kardiální a biochemické výhody, které kaempferol poskytuje. Tyto údaje naznačují, že pozorované účinné antioxidační, protizánětlivé a antifibrotické účinky a jejich následné antiapoptotické účinky kempferolu jsou závislé na SIRT1-.

REFERENCE
1. Gilbert RE, Krum H. Srdeční selhání u diabetu: účinky antihyperglykemické farmakoterapie. Lancet 2015; 385: 2107- 2017.
2. Jia G, Hill MA, Sowers JR. Diabetická kardiomyopatie: aktualizace mechanismů přispívajících k této klinické jednotce. Circ Res 2018; 122: 624-638.
3. Jia G, DeMarco VG, Sowers JR. Inzulinová rezistence a hyperinzulinémie u diabetické kardiomyopatie. Nat Rev Endocrinol 2016; 12: 144-153.
4. Nunes S, Rolo AP, Palmeira CM, a kol. Diabetická kardiomyopatie: zaměření na oxidační stres, mitochondriální dysfunkci a zánět. In: Cardiomyopathies-Types and Treatments, K. Kiraly (ed.) Intech 2017: 235-257.
5. Wilson AJ, Gill EK, Abudalo RA, Edgar KS, Watson CJ, Grieve DJ. Signalizace reaktivních forem kyslíku v srdci diabetika: objevující se vyhlídky pro terapeutické cílení. Srdce 2018; 104: 293-299.
6. Ritchie RH, Abel ED. Základní mechanismy diabetické srdeční choroby. Circ Res 2020; 126: 1501-1525.
7. Lorenzo O, Picatoste B, Ares-Carrasco S, Ramirez E, Egido J, Tunon J. Potenciální role jaderného faktoru kB v diabetické kardiomyopatii. Mediators Inflamm 2011; 2011: 652097. DOI: 10.1155/2011/652097.
8. Fuentes-Antras J, Ioan AM, Tunon J, Egido J, Lorenzo O. Aktivace toll-like receptorů a inflammasomových komplexů u zánětu spojeného s diabetickou kardiomyopatií. Int J Endocrinol 2014; 2014: 847827. DOI: 10.1155/2014/847827
9. Russo I, Frangogiannis NG. Srdeční fibróza spojená s diabetem: buněčné efektory, molekulární mechanismy a terapeutické možnosti. J Mol Cell Cardiol 2016; 90: 84-93.
10. Ge ZD, Lian Q, Mao X, Xia Z. Současný stav a výzvy Nrf2 jako potenciálního terapeutického cíle pro diabetickou kardiomyopatii. Int Heart J 2019; 60: 512-520.
11. Jubaidi FF, Zainalabidin S, Mariappan V, Budin SB. Mitochondriální dysfunkce u diabetické kardiomyopatie: možné terapeutické role fenolových kyselin. Int J Mol Sci 2020; 21: 6043. DOI: 10.3390/ijms21176043 12. D'Onofrio N, Servillo L, Balestrieri ML. Signální dráhy SIRT1 a SIRT6 v ochraně kardiovaskulárních chorob. Antioxid Redox Signal 2018; 28: 711-732.