Kaempferol zmírňuje poškození LD-mitochondrií podporou autofagie: Důsledky při Parkinsonově chorobě, část 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Objevující se důkazy naznačují, že neočekávané ukládání a peroxidace lipidových kapiček (LD) může urychlit stres organel a hraje klíčovou roli v patogenezi neurodegenerativních onemocnění (NDD). V naší předchozí studii jsme potvrdili, že kaempferol (Ka), přírodní malá molekula flavonoidu, vykazoval neuroprotektivní účinky na myši s LPS-indukovanou Parkinsonovou chorobou (PD). Předchozí studie navíc ukázaly, že autofagie hraje důležitou roli v regulaci buněčného ukládání LD. V současné studii jsme ukázali, že Ka chránila před ztrátou neuronů a behaviorálními deficity u MPTP/p-indukovaných PD myší, doprovázených sníženým lipidovým oxidačním stresem v substantia nigra pars compacta (SNpc). V kultivovaných neuronových buňkách Ka vykazoval relativně bezpečný rozsah koncentrací a významně potlačoval akumulaci LD a buněčnou apoptózu indukovanou MPP plus. Další studie ukázala, že ochranný účinek Ka byl závislý na autofagii, konkrétně lipofagii. Kriticky, Ka podporoval autofagii, aby zprostředkovával degradaci LD v lysozomech, což pak zmírnilo ukládání lipidů a peroxidaci a výsledné mitochondriální poškození, v důsledku čehož se snížila smrt neuronů. Kromě toho knockdown Atg5 zprostředkovaný AAV-shAtg{3}} zrušil neuroprotektivní účinky Ka proti oxidaci lipidů u PD myší. Tato práce ukazuje, že Ka zabraňuje dopaminergní neuronální degeneraci u PD prostřednictvím inhibice mitochondriálního poškození zprostředkovaného peroxidací lipidů podporou lipofágie a poskytuje potenciální novou terapeutickou strategii pro PD a související NDD.

Kliknutím sem se dozvíte více

1. Úvod

Parkinsonova nemoc (PD) je běžné neurodegenerativní onemocnění (NDD), které je patologicky charakterizováno progresivní ztrátou dopaminergních (DA) neuronů v substantia nigra pars compacta (SNpc). Přestože přesná etiologie a přirozený průběh této nemoci musí být dosud plně objasněny,četnéprocesy a dysfunkce na systémové úrovni, včetně mitochondriálních funkcí, homeostázy dopaminu, neurozánětu a autofagie, se podílejí na patogenezi PD [1,2]. Nedávné zprávy odhalily, že souvisí s lipidovými kapkami (LD).lipotoxicitase mohou podílet na patologii PD [3,4]. LD jsou vysoce dynamické organely, které vystupují z membrány endoplazmatického retikula (ER) a normálně slouží jako intracelulární místa ukládání neutrálních lipidů [5]. Nedávno se ukázalo, že LD hrají mnohem širší roli než ukládání mastných kyselin (FA) a účastní se mnoha onemocnění. Například myeloidní buňky, včetně makrofágů, leukocytů a eozinofilů, tvoří LD jako odpověď na zánět a stres a LD jsou místa produkce a ukládání zánětlivých cytokinů a dále se podílejí na prezentaci antigenu a clearance patogenů [6]. Důležité je, že u aterosklerózy bylo prokázáno, že pěnové buňky bohaté na LD jsou škodlivé ve všech stádiích onemocnění [7].

Cistanche může zlepšit imunitu

LD však nebyly rozsáhle studovány v centrálním nervovém systému (CNS), jen málo prací uvádí histologickou přítomnost LD v lidské mozkové tkáni [8,9]. I tak mohou mít LD důležité funkce v mozku, protože nedávné studie potvrdily, že agregované LD v glii urychlovaly neurodegeneraci v modelu Drosophila [10]. Nedávno bylo oznámeno, že u myší byly buňky nasycené lipidy obsahující olejovou červenou O-pozitivní, včetně neuronů, gliální fibrilární kyselý protein (GFAP) plus astrocyty a ionizovaná molekula adaptéru vázající vápník-1 (IBA{{7} }) plus mikroglie, jsou přítomny v mnoha oblastech mozku a bylo prokázáno, že se účastní procesů souvisejících s věkem [1]. Naše předchozí práce také prokázala zvýšenou akumulaci LD v mozku na modelu PD myší [12]. Celkově vzato tyto studie naznačují, že LD se mohou podílet na patogenezi PD, stejně jako jiných NDD.

Normálně jsou intracelulární LD degradovány vlysozomya dodávají FA do mitochondrií pro jejich spotřebu jako alternativního zdroje energie během období vyčerpání živin [13]. Neurony však mají nízkou kapacitu pro spotřebu mitochondriálních FA pro produkci energie [14]. Tato vlastnost činí neurony zvláště citlivé na akumulaci LD a peroxidaci. Kromě toho akumulace LD zvyšuje rychlost oxidace FA a vyvíjí trvalý tlak na mitochondriální elektronový transportní řetězec, což zvyšuje produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) komplexy elektronových transportních řetězců I a II [15] za účelem zesílení oxidačního stresu. Přetížení lipidů také vede k produkci ROS extramitochondriálními zdroji, jako jsou nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidázy a další oxidačníenzymy. V kombinaci se sníženou expresí antioxidačních enzymů a nízkou kapacitou spotřeby FA v neuronech akumulace LD zprostředkovává oxidační stres a může dále vést k poškození mitochondrií,lysozomální dysfunkce, defektní autofagie a aktivace zánětlivých odpovědí [6,17]. Pokud nemohou být nahromaděné LD inhibovány nebo odstraněny, vysoce aktivní neurony podléhají patofyziologii, což vede k neurodegeneraci [17]. Důkazy ukazují, že lysozomy zprostředkovaný katabolický proces zvaný autofagie hraje klíčovou roli při udržování buněčné homeostázy LD ve více tkáních [17,18]. Podrobně, LD mohou být selektivně sekvestrovány v autofagosomech a dopraveny do lysozomů k degradaci lysozomálními kyselými lipázami, což je proces specificky známý jako lipofagie [19]. Cílení na LD a jejich autofagickou cestu odstranění by proto mohlo představovat nový přístup ke zvládání neurodegenerace.

Studium přírodních produktů a dietních látek jako zdrojů pro potenciální léčbu a strategie NDD si v posledních letech získalo obrovský zájem [20]. Kaempferol (Ka) je přírodní polyfenolická malá molekula, kterou lze nalézt v řadě čínských léčivých bylin a potravinových zdrojích [21]. Bylo popsáno, že Ka má antibakteriální, anti-aging a imunomodulační účinky, stejně jako antioxidační a neuroprotektivní aktivity [20,22,23]. Dříve bylo popsáno, že Ka inhibuje zánět v mikrogliálních buňkách BV2 in vitro [24] a zvyšuje odolnost DA neuronů vůči neurozánětům in vivo [25]. Účinek Kaon LD u PD však dosud nebyl zkoumán.

Vzhledem k důležitosti LD a úzkému spojení mezi LD, mitochondriemi a autofagií [16], které jsou všechny zapojeny do PD, předpokládáme, že Ka inhibuje peroxidaci LD a zabraňuje neurodegeneraci DA u PD. V této studii jsme prokázali, že Ka významně chrání před neurodegenerací v myším PD modelu inhibicí akumulace LD. Další studie odhalila, že Ka spustil autofagii a snížil akumulaci oxidovaných LD, aby zmírnil mitochondriální dysfunkci a produkci mitochondriálních ROS (mtROS), čímž se zabránilo apoptotické smrti neuronů. Poznatky získané v této studii mohou pomoci řídit klinická rozhodnutí týkající se použití přirozené molekuly Ka u NDD, jako je PD.

2. Materiály a metody

2.1. Pokusná zvířata

Myši C57BL/6J (samci, 4-měsíční stáří) byly získány z Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Myši byly udržovány a chovány v Centru živočišných zdrojů Lékařské fakulty Nanjing Medical University a ve zvířecím zařízení v nemocnici Nanjing Drum Tower Hospital, myši mají volný přístup k potravě a vodě v místnosti s okolní teplotou 22 stupňů ± 2 stupně C a cyklus světlo/tma 12:12 h Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v přísném souladu s pokyny National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

2.2. Reagencie

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 procent ,96,353) pro experimenty in vitro bylo získáno od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) byly zakoupeny od Thermo Fisher Scientific. Pro pokusy na zvířatech byl Ka rozpuštěn v roztoku 10% DMSO v 16% SBE- -CD ve sterilním fyziologickém roztoku. Pro buněčné experimenty byl Ka připraven v DMSO (Sigma-Aldrich) a PBS (konečná koncentrace DMSO je 0,01 procenta), pH 7,4.

2.3. Indukce a léčba methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP)-indukovaného myšího modelu PD

Pro vyhodnocení účinků Ka v PD modelu MPTP/p-toxicity byly myši (samci, ve věku 4-5 měsíců) náhodně rozděleni do skupiny léčené fyziologickým roztokem, skupiny léčené MPTP a skupiny léčené MPTP plus Ka skupina a skupina léčená samotným Ka. Ve skupině léčené MPTP myši dostávaly chronické podávání MPTP s protokolem podobným tomu, který byl popsán dříve [26]: MPTP byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a injikován subkutánně v dávce 25 mg/kg a následně 250 mg/kg probenecidu (rozpuštěného v dimethylsulfoxidu). intraperitoneální (ip) injekce v intervalech 1 h každé 3,5 dne po dobu 5 týdnů. Kontrolní myši dostaly injekci fyziologického roztoku a probenecidu. Ve skupině léčené MPTP plus Ka myši dostávaly Ka (50 mg/kg, jedna injekce/den během experimentů, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Čína) intraperitoneálně (ip) denně 3 dny před léčbou MPTP a po dobu 5 MPTP injekční týdny. Jeden týden po poslední injekci MPTP byly myši podrobeny behaviorálnímu testování zaslepeně vůči skupinám. Poté byly všechny myši anestetizovány 40 mg/kg pentobarbitalu sodného a usmrceny pro detekci mozkových proteinů a imunohistochemii nebo analýzu qPCR.

2.4. Stereotaxická chirurgie in vivo a experimentální léčba

Stereotaxická operace v anestezii pentobarbitalem sodným (40 mg/kg, ip) byla provedena, jak je popsáno [25]. Myší Atg5 a kontrolní shRNA byly transfekovány balicími vektory (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP), aby se vytvořil AAV. Pro mikroinjekci se anestetizované myši umístí do stereotaxického zařízení. Byly injikovány 1μL AAV skleněnou elektrodou mířící na DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:-0.45 mm） při rychlost 0,25 μl/min. Potom byla jehla ponechána další 2-min. 2 týdny po mikroinjekci viru byly myši podrobeny MPTP-indukovanému PD modelovému vedení a ošetření (nebo)Ka.

Atg5 shRNA byla získána od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Pro umlčení Atg5 byly primery uvedeny v doplňkové tabulce 1.

2.5. Behaviorální analýza

Týden po poslední injekci MPTP nebo fyziologického roztoku byly provedeny rotační a tyčový test, jak bylo popsáno výše [27]. Pro test na rotarodu byly myši aklimatizovány na rotarod ve dvou pokusech (6 minut se zrychlenou rychlostí 12-20 rpm) za den po dobu 2 po sobě jdoucích dnů před začátkem experimentu. Poté byly myši testovány při 20 otáčkách za minutu po dobu 300 s po další 3 po sobě jdoucí dny. Latence k pádu byla zaznamenávána pomocí Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Čína). Pro test na tyči byly myši umístěny hlavou nahoru na vrchol svislé dřevěné tyče (drsný povrch, výška 50 cm, průměr 1 cm). Všechny myši byly na zařízení zvyklé 2 dny před testováním a poté byly třikrát testovány třetí den. Zaznamenával se celkový čas (T-total, dokud myš nedosáhla na podlahu svými čtyřmi tlapkami) a doba otočení (T-turn, aby se myš úplně otočila hlavou dolů). Experiment byl zaslepen na myších skupinách pro každé behaviorální testování a test byl proveden třikrát.

2.6. Sbírka vzorků mozku

Po závěrečných behaviorálních testech byly myši anestetizovány pentobarbitalem sodným (40 mg/kg, ip). Pro qPCR, western blotting a analýzu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byly ze zvířat rychle extrahovány celé mozky, poté byly rychle vypreparovány tkáně středního mozku a striatum, předem zmrazené kapalným dusíkem. Všechny vzorky byly skladovány při -80 stupních až do analýzy.

Pro imunohistochemickou analýzu byly myši perfundovány transkardiálně 4% paraformaldehydem (PFA). Mozky byly extrahovány, dodatečně fixovány, dehydratovány, vloženy do OCT (Tissue-Tek) a sériové řezy mozků byly kryosekcí (30 μm na řez) přes každou celou vrstvu a střední mozek pomocí mrazícího mikrotomu (Leica CM1950, Nussloch, Německo ). Všechny řezy byly shromážděny v šesti samostatných sériích a mozkové řezy byly uloženy v 50% glycerinu a zmraženy na -20 stupeň až do analýzy.

Pro TEM byly myši perfundovány 2,5 procenty glutaraldehydu a 2 procenty paraformaldehydu, jak je popsáno 【12】. Malá porce (<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistochemická analýza

Mozkové řezy byly opláchnuty v PBS a následně 3% H2O po dobu 10 min a poté inkubovány s 0,3% Tritonem X-100 v PBS doplněném 5% BSA po dobu 1 hodiny. Poté byla sklíčka inkubována s primárními protilátkami při 4 stupních přes noc v PBS obsahujícím 5 procent BSA při 4 stupních přes noc, poté promyta a inkubována v sekundárních protilátkách po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, následovala inkubace s diaminobenzidinem (DAB) nebo montáž do DAPI (Life Technologies, Cat P36931) jako imunofluorescenční barvení po dobu 5 minut. Pro barvení Nissl byla sklíčka smíchána v roztoku kresylové violeti (CV) (0,1 g kresylové violeti, 99 ml H,O a 1 % kyseliny octové 1 ml) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a poté dehydratována alkoholem a xylenem. Snímky byly pozorovány a fotografie byly zachyceny pod mikroskopem Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Spojené státy americké). Celkový počet TH-pozitivních a Nissl's-pozitivních neuronů v SNpc byl získán sérologicky pomocí metody optického frakcionátoru se softwarem MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Vzorky striatálních myší byly homogenizovány {{0}},1 M kyselinou chloristou （1 mg tkání v 100 μL kyseliny chloristé） a 0,1 mM EDTA, ošetřeny ultrazvukem a odstředěny při 20,000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut, jak bylo uvedeno [27]. Poté byly supernatanty shromážděny pro měření. Mobilní fáze je směsný roztok sestávající z 90 mM dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​1,7 mM kyseliny 1-oktansulfonové, 50 mM citrátu, 50 uM EDTA, 10 procent acetonitrilu s průtokem 0,2 ml/min. Paralelně se pro výpočet kvantitativní standardní křivky připravil zásobní standardní roztok pro dopamin a kyselinu dihydroxyfenyloctovou (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA）) v 0,1 M HC104. Bylo injikováno množství 10 ul připraveného supernatantu nebo standardního roztoku. do mobilní fáze a testovány elektrochemickým detektorem ESA Coulochem ⅢI (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Vzorky byly měřeny a kvantifikovány píky. Koncentrace monoaminů byly kvantifikovány porovnáním se standardem pomocí softwaru ClarityChrom (Knauer, Německo) a poté obsah ve vrstvě byl převeden podle poměru ředění Standardní křivka DA a DOPAC byla znázorněna na doplňkovém obrázku 1a a b.

2.8. Buněčné kultury a ošetření

Kultury mezencefalických primárních neuronů byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve [12]. Stručně řečeno, mezencefalické tkáně myší C57BL/6 v embryonální den 14/15 (E14/15) byly opatrně odstraněny, mechanicky disociovány, aby se odstranily membrány a velké krevní cévy, a pak pitvány. Poté byly štěpeny trypsinem-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA）a poté filtrovány přes 100-μm filtr, aby se získala jednobuněčná suspenze. Následně byly buňky naneseny na poly-L-lysin -předem potažené 12-/24-jamkové destičky při 2,5×10 stupních buněk/ml obsahující Neurobasal medium (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) doplněné B27 (2 procenta v:v, Cat 17504044,GibcoTM) a penicilin/streptomycin (0,5 procenta v:v). Kultury byly udržovány ve zvlhčené komoře (37 stupňů, 5% CO2 inkubátor). Kultivační médium bylo měněno každé 3 dny a buňky lze používat po 7-10 dnech.

Buněčné linie: Buněčné linie SH-SY5Y byly kultivovány v 10 procentech FBS a 1 procentech penicilin/streptomycin ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních a 5 procentech CO2. V experimentech byly buňky SH-SY5Y ošetřeny MPP (200 μM) nebo různými dávkami Ka (0, 3, 30, 60, 100, 300, 600 μM) po dobu 24 hodin. Buňky Ka (3,10,30,60 μM, 3 h) aktivované SH-SY5Y byly stimulovány pomocí MPp plus (400 μM) po dobu 24 hodin. Ka （30 μM, 3 h） s （nebo bez） 3-MA （3 mM, 1 h） nebo -tokoferol） (50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783）primované buňky SH-SH5Y byly stimulovány pomocí MPP plus （200 μM） po dobu 24 hodin.

2.9. Test životaschopnosti buněk CCK8

Změněná životaschopnost buněk při léčbě Ka byla detekována soupravou Cell Counting Kit-8(CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Stručně řečeno, buňky SHSY5Y byly nasazeny do 96- a poté ošetřeny různými koncentracemi Ka（3,30,60,100,300,600 μM）po dobu 24 hodin. Poté bylo do každé jamky na 4 hodiny přidáno 10 ul CCK{12}} činidla. Nakonec byla absorbance detekována pomocí Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) při 450 nm.

2.10. Stanovení ATP

Hladiny ATP v buňkách byly detekovány pomocí ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Čína〕podle pokynů výrobce. Po ošetření byly buňky lyžovány a centrifugovány při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při 4 stupních a supernatanty byly odebrány. Pracovní roztok （100 μL） byl přidán k 20 μL vzorku v 96-jamkové destičce a luminiscence byla okamžitě měřena na automatické čtečce mikrotitračních destiček.Měření ze všech vzorků byla normalizována na koncentraci proteinu.

2.11. Na plus -K-ATPázový test

Pro měření Na plus -K plus -ATPáza (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Čína) byly buňky sonikovány a centrifugovány při 6000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, aby se získal supernatant. Byly přidány reakční roztoky detekce Na plus -K plus -ATPáza a inkubovány podle pokynů výrobce. Poté byla detekována absorbance při 660 nm. Měření všech vzorků byla normalizována na koncentraci proteinu.

2.12. Western blotting analýza

Buňky nebo mozkové tkáně byly lyžovány v pufru RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 procento NP-40 (FNNO021, Thermo), 0,5 procenta sodíku deoxycholát (D6750, Sigma), 0,1 procenta SDS (74255, Sigma) doplněný inhibitory proteázy a fosfatázy (Roche, Shanghai, Čína). Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí sady Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghai, Čína). A {{13 }}ug proteinu každého vzorku bylo separováno pomocí SDS-PAGE pomocí polyakrylamidových TGX gelů (Bio-Rad, Hercules, Kalifornie, USA) a poté přeneseno na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Bedford, MA). Po blokování PVDF membrány byly inkubovány s různými specifickými primárními protilátkami v TBST při 4 stupních přes noc, poté promyty a inkubovány v odpovídajících sekundárních protilátkách konjugovaných s křenovou peroxidázou (HRP) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány a detekovány zesílenou chemiluminiscencí (ECL) plus detekčním činidlem (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) a analyzovány pomocí zobrazovacího systému ImageQuantM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Kvantitativní (Q) a reverzní transkripce (RT)-PCR v reálném čase

Celková RNA byla extrahována z mozkových tkání a kultivovaných buněk pomocí činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverzní transkripce byla provedena pomocí reagenční soupravy TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japonsko). qPCR v reálném čase byla provedena pomocí SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) v přístroji StepOnePlus (Applied Bio-systems). Roznětky byly zakoupeny a ověřeny General (Shanghai, Čína). Primery použité pro qPCR byly uvedeny v doplňkové tabulce 2.

2.14. Test laktátdehydrogenázy (LDH).

Podle instrukcí výrobce byly buňky naneseny na 96-jamkovou destičku v množství 5000 buněk/jamku a bylo odebráno kultivační médium pro měření hladin LDH pomocí testovací soupravy (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Poté byla detekována absorbance vzorků pomocí Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) při 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 a MitoTracker tmavě červené barvení

Živé buňky byly promyty PBS a inkubovány s 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) nebo BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）（2.0 μM , InvitrogenTM, Cat D3861）v PBS po dobu 15 minut při 37 stupních Pro barvení MitoTracker Deep Red byly živé buňky inkubovány s 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) v PBS po dobu 30 minut při 37 stupních. byly dvakrát promyty v PBS a fixovány v 3,5% PFA po dobu 10 minut s následným promytím a kontrastním barvením Hoechst 33342 (Sigma, Cat B2261) po dobu 10 minut, než byly pokryty skleněnými podložními sklíčky pro zobrazování. Snímky byly pozorovány a fotografie byly zachyceny fluorescenční mikroskopií (Olympus, Tokio, Japonsko).

2.16. Barvení Hoechst a PI

Buňky byly obarveny Hoechst 33,342 (1 ul zředěný v 5 0 0 ul PBS, Sigma, Cat B2261) a (nebo) PI ） (0,1 ul zředěný v 500 ul PBS, Solarbio, CA1020) po dobu 10 minut a poté fixovány a pozorováno fluorescenční mikroskopií (Olympus, Tokio, Japonsko).

2.17. Průtoková cytometrie

Buňky byly štěpeny a promyty D-hank's a poté obarveny Annexinem V-FITC（5 ul zředěným v 500 ul PBS）/PI（0,1 ul zředěným v 500 ul PBS) apoptózní souprava (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian) podle protokolu výrobce. Poté byly apoptotické buňky analyzovány pomocí průtokové cytometrie (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA). Měření mitochondriálního ROS a mitochondriálního membránového potenciálu byla provedena podle publikace 【12】. Buňky SH-SY5Y byly obarveny MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, USA) nebo Jul (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) při 37 stupních po dobu 30 minut. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky resuspendovány ve studeném PBS obsahujícím 1 procento FBS pro analýzy průtokovou cytometrií. Data byla analyzována pomocí softwaru FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Respirační testy mořského koníka

Mitochondriální respirační funkce v živých buňkách SH-SY5Y byla měřena pomocí analyzátoru extracelulárního toku (XFe96) Seahorse (Agi-lent, Santa Clara, USA) prostřednictvím změn v rychlosti spotřeby kyslíku (OCR). buňky/jamka byly ponechány přilnout k destičkám pro buněčné kultury Seahorse a dosáhnout přibližně 80 procent konfluence v době experimentu. Následující den byly buňky předem ošetřeny Ka a poté vystaveny MPp plus po dobu dalších 24 hodin. OCR byla detekována za bazálních podmínek následovaných postupným přidáním 1 μM oligomycinu, 1 μM FCCP a také 1 μM rotenonu a antimycinu A.

2.19. Statistická analýza

Data byla prezentována jako průměr ± SEM. Významnost rozdílu byla stanovena Studentovým t-testem, dvoucestnou analýzou rozptylu nebo jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA), po které následoval Tukeyho post hoc test. Rozdíl byl považován za významný u P<>

3. Výsledky

Výsledek 1. Ka obnovuje motorickou dysfunkci a zvyšuje hladiny dopaminu ve striatu u myší s modelem MPTP/p PD

Ke zkoumání neuroprotektivního účinku patogeneze Kaon PD byl 4-měsíčním samcům myší C57BL/6 injikován neurotoxin MPTP k vytvoření modelu MPTP/p PD a byli léčeni Ka (obr. la). Po modelové indukci byly testy na rotarodu a pólový test použity k vyhodnocení motorického a behaviorálního výkonu myší v různých skupinách. Jak je ukázáno, doba výkonu rotarodu byla výrazně snížena u myší ošetřených MPTP a tomuto efektu zabránil Ka (obr. 1b). Ka také obnovila behaviorální deficity vyvolané MPTP, jak je indikováno zkrácením doby otáčení a celkového času v testu tyčí (obr. lc ad), aniž by to ovlivnilo tělesnou hmotnost myší (obr. le). Kromě toho analýza HPLC ukázala, že hladina dopaminu ve striatu byla významně snížena u myší infikovaných MPTP/p a tato hladina byla obnovena ošetřením Ka (obr. 1f. Ošetření Ka také zmírnilo MPTP/p-indukované snížení dihydroxy Hladiny kyseliny fenyloctové (DOPAC, metabolit dopaminu) ve striatu (obr. 1g) Tyto výsledky naznačují, že Ka obnovuje motorickou dysfunkci a zvyšuje hladiny dopaminu ve striatu u myší s PD indukovanou MPTP.

Výsledek 2. Ka zmírňuje ztrátu DA neuronů u SNpc myší s modelem MPTP/p PD

Dále, abychom dále vyhodnotili neuroprotektivní účinek Kaon MPTP/p-indukovaného poškození neuronů DA, zkoumali jsme tyrosinhydroxylázu (THD plus neurony v myším SNpc imunobarvením. Jak je ukázáno na obr. 2a a b, MPTP/p indukoval významné snížení v počtu TH plus neuronů, který byl zmírněn léčbou Ka. Dále stereologické počty celkových neuronů v SNpc, jak je definováno Nisslem

Obr. 1. Léčba Ka zmírňuje motorickou dysfunkci a zvyšuje hladiny dopaminu ve striatu u myší s modelem MPTP/p PD.

(a) Schematický diagram experimentálního designu. (b) Čas na tyči byl měřen pro test na rotarodu ve třech po sobě jdoucích dnech. (cd) Pro test na tyči byl zaznamenán čas otočení (čas otočení) a sestup tyče (doba lezení). (e) Tělesná hmotnost myší byla změřena na konci studie. (fg) Dopamin (DA) a kyselina dihydroxyfenyloctová (DOPAC) ve striatu byly analyzovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM.n =9-10 pro každou skupinu v (b,c,d); n =6-8 pro každou skupinu v (f, g).ns, nevýznamné, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

barvení, ověřilo, že ztráta TH buněk odráží buněčnou smrt, ale ne downregulaci exprese TH, a ukázalo, že léčba Ka obnovila pokles počtu Nissl-pozitivních neuronů v SNpc myší léčených MPTP ze 43,3 procenta na 25,4 procent ( Obr. 2c a d). Kromě toho Ka významně zlepšil MPTP-indukované snížení exprese proteinů TH a DAT, jak bylo měřeno Western blotováním (obr. 2e-g). Tento důkaz potvrzuje neuroprotektivní účinek Ka na myším modelu PD.

Výsledek 3. Ka snižuje akumulaci LD vakuol a oxidativní stres u SNpc myší léčených MPTP/p

Stále více důkazů prokázalo zapojení LD do NDD[10], naše předchozí práce konzistentně identifikovala zvýšené LD v SNpc myší s PD indukovanou MPTP[12]. LD lze snadno identifikovat a vykazují kulaté struktury s nízkou hustotou s homogenním amorfním obsahem [28]. Normálně mohou být LD degradovány autofagií, aby se zabránilo akumulaci [29]. Aby se zjistilo, zda Ka může regulovat LD u PD, akumulace LD byla analyzována transmisní elektronovou mikroskopií (TEM) v SNpc kontrolních myší, MPTP/p a MPTP/p plus Ka. Jak bylo ukázáno v naší předchozí práci [12], počet a velikost LD byly zvýšeny u myší MPTP/p ve srovnání s kontrolami léčenými fyziologickým roztokem (obr. 3a a b) a byly významně sníženy u myší léčených Ka (obr. 3c- E). Navíc u myší léčených Ka byly LD častěji pozorovány v blízkosti, uzavřeny nebo degradovány autolysozomy, které byly definovány jako elektron-denzní granule lipofuscinu. Další histologické barvení TH* neuronů pomocí BODIPY, barviva, které specificky označuje neutrální lipidy a běžně se používá k detekci LD [30], ukázalo, že jak počet, tak velikost BODIPY LD v SNpc byly vyšší u PD myší než u kontrol, a byly významně sníženy působením Ka (obr. 3f-h).

Pokud nemohou být LD degradovány včas, nahromaděné LD mohou podléhat peroxidaci a přispívat k mitochondriálnímu stresu zprostředkovanému ROS [4], který zesiluje neurotoxicitu a progresi onemocnění. Proto jsme dále zkoumali expresní profily genů spojených s ochranou proti toxicitě volných FA (Gpx8), neutralizujícími oxidačními druhy, superoxidovými radikály (Sod3) a peroxidem vodíku (Cat) a metabolismem FA (Acsbg1 a Dbi), jak bylo uvedeno [31]. , z nichž všechny byly nápadně sníženy u SNpc myší léčených MPTP ve srovnání s kontrolami a tyto účinky byly zlepšeny u myší s PD léčenými Ka (obr. 3i). Podobně MPTP/p také zvýšil hladiny exprese mRNA

Obr.2. Ka zlepšuje ztrátu DA neuronů u SNpc myší s modelem MPTP/p PD.

(ab) Mikrofotografie tyrosinhydroxylázy (TH)-pozitivních neuronů (a) a stereologické počty TH-pozitivních neuronů v substantia nigra pars compacta (SNpc)(b). Stupnice jsou, jak je uvedeno. -pozitivní buňky(c) a stereologické počty buněk pozitivních na kresylovou violeť v SNpc(d). Měřítko, 120μm.（např.） Western blot analýza exprese TH a DAT proteinu v SNpc（e） a kvantitativní analýza（f,g）. Kvantifikovaná data jsou normalizována na kontrolní skupinu s fyziologickým roztokem. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Výsledek 4. Ka chrání buňky SH-SY5Y proti apoptóze indukované MPP plus

MPP plus, aktivní metabolit MPTP, inhibuje enzymy mitochondriálního komplexu a způsobuje buněčnou smrt, která je přímo spojena s PD[32]. Dále jsme zkoumali, zda Ka může zabránit MPP plus-indukované neuronální apoptóze in vitro. Jak je znázorněno na obr. 4a a b, MPPt (400 μM, 24 h) indukoval uvolňování LDH z buněk SH-SY5Y a Ka(30 a 60 μM） významně zeslaboval uvolňování LDH bez ovlivnění přežití buněk (obr. 4a). Protože Ka indukoval podstatný ochranný účinek při koncentraci 30 μM（Obr.4b）, použili jsme tuto koncentraci v následujících experimentech.Výsledky barvení Hoechst/PI také ukázaly, že Ka významně snížilo procento buněk s MPP plus-indukovanou kondenzací chromatinu (Obr. 4c a d) a buněčnou apoptózou, o čemž svědčí zvýšená intenzita fluorescence Hoechst (Obr. 4c) a procento buněk obarvených Hoechst/PI (Hoechst plus /PI plus) (Obr. 4e). detekovaná průtokovou cytometrií, MPPt indukovaná buněčná apoptóza, o čemž svědčí zvýšené procento buněk obarvených annexinem V (AV plus /PI- a AV plus /Prt) byly chráněny Ka (obr. 4f a g). MPP plus-indukované změny v expresi proteinu související s apoptózou, o čemž svědčí upregulace B cl-2, downregulace Bax (obr.4hi-j) a snížené štěpení kaspázy-3(obr.4h,k). Tyto údaje naznačují, že Ka může zrušit škodlivé účinky MPp plus na přežití buněk.

Výsledek 5. Ka potlačuje akumulaci LD indukovanou MPp plus a peroxidaci lipidů, které zprostředkovávají mitochondriální poškození v buňkách SH-SY5Y

Nedávné studie ukázaly, že neočekávaná akumulace LD může vést ke zvýšenému stresu zprostředkovanému peroxidací lipidů a urychlit mitochondriální dysfunkci, která podporuje neurodegeneraci [10]. Naše předchozí práce také ukázala, že zvýšené LD v SNpc byly spojeny s patologií PD u myší [12]. Abychom prozkoumali, zda ochranný účinek Ka souvisel s akumulací LD in vitro, provedli jsme nejprve LD-specifické barvení v buňkách SH-SY5Y pomocí BODIPY 493/503 a pozorovali jsme zvýšenou depozici LD (zvýšené hladiny neutrálních lipidů)

Obr. 3. Ka snižovala akumulaci elektron-denzních LD vakuol a oxidaci lipidů v SNpc myší ošetřených MPTP/p.

(ac) Reprezentativní EM snímky ukazující elektronově jasné vakuoly (lipidové kapičky), elektronově husté autofagické vakuoly obsahující autolysozomy (ALS) nebo lysozomy obsahující lipofuscin (Lys) v SNpc myší léčených fyziologickým roztokem (a), MPTP/p (b) a MPTP/p plus Ka (c). Měřítko, 500 nm. S(a,b), jak je uvedeno v naší předchozí práci (PMID:29967574). (de) Kvantifikace elektronově jasných LD vakuol na neuron v SNpc u uvedených myší. n =3 myší, 10-12 neuronů na skupinu. (fh) Řezy středního mozku z myší ošetřených fyziologickým roztokem, MPTP/p a MPTP/p plus Ka byly obarveny na BODIPY (LDs) a TH (DA neurony). Panely zcela vpravo ukazují zvětšení BODIPY plus TH plus neuronů. Šipky označují LD.(gh), kvantifikace TĚLA plus číslo LD a velikost. (ii) Byla analyzována mRNA exprese genů souvisejících s toxicitou FFA (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 a Dbi) (i) a genů oxidačního stresu (Nox1, Nox2 a Nox4) (j) v SNpc uvedených myší pomocí qPCR v reálném čase.n=4-5 na skupinu, tři nezávislé experimenty. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM; ns, nevýznamné, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Tento článek je převzat zhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101911Přijato 23. listopadu 2020