Polysacharidy z jujuby zmírnily anémii u potkanů ​​s chronickým onemocněním ledvin

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang a kol

Abstraktní

Polysacharidy z jujuby (JP) jsou jedním z aktivních glykanů pocházejících z potravy v dietním ovoci Ziziphus jujuba, o kterém se uvažuje při léčbě nedostatku krve. V této studii achronickýledvinachoroba(CKD) potkaní model byl použit k hodnocení účinku JP a jeho mechanismu na anémii spojenou s CKD. U CKD potkanů ​​se léčba JP významně zlepšilaledvinafunkce, ledvinapatologickýzraněnía hematologické parametry, včetně zvýšení počtu červených krvinek, hemoglobinu, hematokritu a počtu krevních destiček. Výsledky cílené metabolomiky LC-MS/MS navíc ukázaly, že JP podporoval uvolňování mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA) u CKD potkanů. Kromě toho JP střídal hladinu sérového erytropoetinu (EPO), ledvinovou EPO mRNA aledvinaEPO protein prostřednictvím HIF-signalizace. Souhrnně tyto výsledky poskytují důkaz, že účinek JP na anémii spojenou s CKD může být zapojen do regulace uvolňování SCFA a produkce erytropoetinu, což podporuje další vývoj JP jako potravinových doplňků při léčbě anémie spojené s CKD.

Klíčová slova: Jujube polysacharidyChronickýledvina chorobaAnémie Erytropoetin Faktor indukovaný hypoxií – mastné kyseliny s krátkým řetězcem

Kliknutím sem získáte více informací o Cistanche

1. Úvod

Chronickýledvina choroba(CKD) je definován jako klinický syndrom renálních strukturálních abnormalit nebo funkčních poruch a stává se celosvětově stále více zátěží pro veřejné zdraví (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Renální anémie patří mezi nejčastější komplikace CKD, které přispívají ke zvýšenému riziku úmrtí (Locatelli et al., 2019). Nedostatečná produkce erytropoetinu (EPO) je uznávaným hlavním hnacím faktorem anémie u CKD (Pappa, Dounousi, Duni, & Katopodis, 2015). EPO je produkován v játrech aledvina, který je nezbytný pro produkci erytrocytů (Lappin & Lee, 2019). Za hypoxických podmínek může hypoxií indukovatelný faktor (HIF) aktivovat expresi EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Cílení HIF k indukci produkce EPO bylo tedy považováno za novou terapeutickou strategii pro léčbu anémie spojené s CKD.

Jujube jsou plody Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), také známý jako čínská datle. Jujube má dlouhé tradiční použití trvající tisíce let jako léčivá bylina a doplněk stravy. Jujube se používá jako zdravotní doplněk pro lidi, kteří mají hematogenní nebo trpí chronickou podvýživou. Polysacharidy z jujuby (JP), ve vodě rozpustná složka složená z různých poměrů monosacharidu a kyseliny uronové (Ji, Hou, Yan, Shi a Liu, 2020), je jednou z aktivních složek v jujube (Ji et al., 2017 ), který byl dobře přijímán, že vykazuje hepatoprotektivní účinek a imunomodulační aktivitu a zvyšuje funkci střevní bariéry (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Ve skutečnosti se také běžně předpokládá, že JP má potenciální účinky na anémii. Molekulární mechanismus JP při léčbě anémie je však stále méně známý.

V posledních letech se metabolomika široce používá k pochopení potenciálních faktorů, které přispívají k progresi onemocnění. Cílená metabolomika je široce používána při identifikaci molekulárních markerů komplexních lidských onemocnění, jako je CKD. Indoxylsulfát (IS) a p-kresylsulfát (PCS) byly ověřeny jako biomarkery progrese CKD (Meijers & Evenepoel, 2011) a zvýšený stupeň trimethylamin-N-oxidu (TMAO) by mohl přímo vést k renální tubulointersticiální fibróze a dysfunkci. (Tang et al., 2015). Mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA), střevní mikrobiálně závislé metabolity, jsou energetickými substráty se schopností ovlivňovat různé fyziologické procesy (LeBlanc et al., 2017) a bylo hlášeno, že snížení SCFA přispívá k progresi CKD. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang et al., 2019). Navíc byly SCFA schopny chránit strukturu ledvin před poškozením prostřednictvím inhibice oxidačního stresu (Li, Ma, & Fu, 2017). Současně bylo zjištěno, že SCFA vykazují příznivý účinek na absorpci železa a upregulují genovou expresi embryonálního/fetálního globinu, což indukuje erytropoézu a upravuje anémii (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Mechanismus SCFA u renální anémie je však stále potřeba objasnit.

V této studii předpokládáme, že JP by mohl regulovat uvolňování SCFA a stimulovat produkci EPO zprostředkovanou HIF, jejímž výsledkem je úprava renální anémie. Zde budeme zkoumat účinek JP na zmírnění renální anémie u 5/6 nefrektomizovaných potkanů ​​s CKD, včetně renálních funkcí a hematologických parametrů. Je vyvinut cílený metabolomický přístup pomocí LC-MS/MS pro stanovení osmi SCFA včetně kyseliny octové, kyseliny propanové, kyseliny isomáselné, kyseliny máselné, kyseliny 2-methylmáselné, kyseliny izovalerové, kyseliny valerové a kyseliny hexanové ve stolici a vzorky ledvin a hladiny cílených SCFA se hodnotí u zdravých a CKD potkanů. Kromě toho bylo také odhaleno zapojení HIF signalizace u potkanů ​​ošetřených JP.

Obr. 1. Typická GC–MS chromatografie JP. (A) Strukturní vzorce monosacharidů po derivatizaci aldononitrilacetátu; (B) Reprezentativní profily GC–MS směsné iontové chromatografie (MIC) standardní směsi monosacharidů a JP hydrolyzovaných monosacharidů. Píky v chromatografických profilech odpovídaly chemickému markeru uvedenému v (A): 1. rhamnóza, 2. arabinóza, 3. fukóza, 4. xylóza, 5. manóza, 6. glukóza, 7. galaktóza, 8. inositol (ISTD ).

2. Materiály a metody

2.1. Příprava polysacharidu z jujuby

Plody Z. jujuba byly zakoupeny od Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Materiály byly ověřeny Dr. Jianping Chenem podle lékopisu Čínské lidové republiky z roku 2015. Vzorky poukazů byly uloženy v nemocnici tradiční čínské medicíny Shenzhen s číslem 18100601.

Surový JP byl extrahován z jujuby, jak bylo popsáno dříve, s menšími úpravami (Ji et al., 2020). Stručně, jujuby byly inkubovány s 10 obj. vody (v/w) ve vodní lázni při 80 °C po dobu 3 hodin a extrahovány 3krát. Po filtraci se filtráty spojí a tato směs se kondenzuje na rotační odparce za řízeného vakua. Koncentrátový roztok byl dále vysrážen přidáním čtyřnásobku ethanolu (v/v) při 4 °C po dobu 12 hodin. Sraženina se sebere centrifugací a suší se za sníženého tlaku do sucha, čímž se získá surový JP. Čistota JP byla stanovena na 80 procent pomocí kalorimetrie.

2.2. Charakterizace monosacharidového složení polysacharidu jujuby

Systém Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 propojený se Shimadzu GC 2010 plus) vybavený zdrojem EI, kapilární kolona SH-Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 um tloušťka filmu, Shimadzu) byl použit ke stanovení derivatizačních hydrolyzovaných monosacharidů s dělicím poměrem 10:1. Teplota nástřiku, iontového zdroje a rozhraní byla 250 ◦C, 200 ◦C a 250 ◦C. Počáteční teplota kolony byla udržována na 120 ◦C po dobu 1 minuty, poté byla zvýšena rychlostí 15 ◦C/min na 160 ◦C a udržována po dobu 4 minut, 2 ◦C/min na 165 ◦C a udržována po dobu 2 minut, 20 ◦C /

min na 195 ◦C, 5 ◦C/min na 250 ◦C a udržujte po dobu 3 min. Průtok nosného plynu helia byl udržován na 46 cm/s a do přístroje byly vstříknuty 2 μl každého vzorku. Analyty byly kvantifikovány ve zvoleném režimu monitorování iontů (SIM), cílový iont: rhamnóza (m/z 129.00), arabinóza (m/z 115.00), fukóza (m/ z 103.00), xylóza (m/z 115.00), manóza (m/z 115.00), glukóza (m/z 115.00 ), galaktóza (m/z 115.00), inositol (m/z 126.00). Monosacharidové standardy byly uvedeny následovně: L ( plus )-arabinóza (1506–200202), fukóza (112014–201902), D-xylóza (111508–201605), D-glukóza (110833–201908), 08833–201908 (0883–201908), 211rhamnose ), galaktóza (100226–201807), D-manóza (140651–201805) byly zakoupeny od National Institutes for Food and Drug Control. Inositol byl získán od Sigma (17508-50 g).

Extrahovaný JP (10 mg) byl hydrolyzován na monosacharidy pomocí 10 ml 2 mol/L kyseliny trifluoroctové (TFA) při 105 °C po dobu 3 hodin a hydrolyzované monosacharidy z JP byly zahuštěny a promyty za sníženého tlaku při 60 °C na odstraní TFA a zbytky se rekonstituují 2 ml vody. Přidáno 250 ul roztoku 20 mg/ml hydroxylamin hydrochloridu/pyridinu do 100 ul roztoku hydrolyzovaných monosacharidů a ponecháno ve vodní lázni o teplotě 90 °C po dobu 45 minut. Poté bylo přidáno 250 ul acetanhydridu a ponecháno ve vodní lázni o teplotě 90 ◦C po dobu dalších 45 minut. Na konci reakce se směs 5krát extrahovala 1 ml cyklohexanu a cyklohexanová vrstva se koncentrovala na 1 ml. Injikujte 1 µl supernatantu do GC–MS pro analýzu (Li & Shi, 2013).

2.3. Zvířata

Všechny experimenty byly provedeny s protokoly schválenými Institutional Animal Care Use Committee of Guangzhou University of Chinese Medicine. Potkani Sprague–Dawley, samci a samice, o hmotnosti 180–220 g, byli získáni z Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, Čína, povolení č. SCXK (Yue) 2008–0002) a udržováni v prostředí bez specifických patogenů (SPF ) zařízení pro zvířata v 12hodinovém cyklu světlo-tma, s volně potravou a vodou.

K indukovanému selhání ledvin byla provedena 5/6 nefrektomie podle předchozího popisu (Chen et al., 2019). Všechny chirurgické operace byly provedeny v anestezii 10% chloralhydrátem. Skupina falešných operací (n=6) provedla stejné kroky k otevření břišní dutiny a obnažení ledviny. 5/6 potkanů ​​s nefrektomií bylo náhodně rozděleno do dvou skupin. Krysy bez léčby (CKD skupina, n=6) a potkani dostávající JP (CKD plus JP skupina, n=6) ​​orálně žaludeční sondou v dávce 1,2 g/kg/den. Po 90 dnech provozu začalo 90 dní podávání. 90. den byl konečný čas podání JP krysám a po 24 hodinách byla zvířata usmrcena odebráním krve z abdominální aorty a od každé krysy byly odebrány vzorky moči, stolice, séra a ledvin. Všechny vzorky byly před další analýzou skladovány při -80 ◦C.

2.4. Biochemická analýza

Podle pokynů výrobce byly měřeny dusík močoviny v krvi (BUN) a sérový kreatinin (Scr) pomocí soupravy pro detekci kreatininu v séru a soupravy pro detekci BUN (WAKO, Ginza, Japonsko) a protein v moči pomocí soupravy Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, Čína). Červené krvinky (RBC), hemoglobin (Hb), hematokrit (HCT) a počet krevních destiček (PLT) byly analyzovány Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Německo) podle pokynů výrobce.

2.5. Histologické vyšetření

K hodnocení renálního patologického poškození bylo použito barvení pomocí kyseliny periodické-Schiff (PAS) a Masson, mezi nimi bylo použito barvení PAS k odhalení renální tubulární atrofie a glomerulární oblasti a Massonovo barvení bylo použito pro renální intersticiální fibrózu (Xie et al. , 2020). Metoda kvantitativní analýzy byla provedena podle předchozích studií (Chen et al., 2019). Stručně řečeno, skóre tubulární atrofie při barvení PAS bylo definováno následovně: 1. vzácný jediný atrofický tubulus; 2. několik shluků atrofických tubulů; 3. masivní atrofie. Glomerulární oblast byla měřena softwarem ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Německo). Fibrózní oblast v Massonově barvení byla měřena pomocí softwaru Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Nejméně deset mikroskopických polí (200×) 6 krys na skupinu bylo zachyceno náhodně, aby se změřilo skóre atrofie, glomerulární oblast a fibrotická oblast, s alespoň jedním glomerulem v každém mikroskopickém poli.

2.6. Imunohistochemická analýza

Renální parafínový řez (4 μm) z každého vzorku byl postupně dehydratován dvakrát xylenem a gradientem ethanolu (100–95–90–80–70 procent ), antigen byl získán pufrem s kyselinou citrónovou (pH 6,0 ) po dobu 30 minut, blokována 3% peroxidem vodíku po dobu 10 minut a kozím sérem po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Tkáňové řezy byly inkubovány odděleně primární protilátkou HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1:500, šarže: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs{18}} R, 1: 500, šarže: BJ2044786) při 4 ◦C po dobu 10 hodin a HRP konjugovaná kozí anti-králičí sekundární protilátka (Abcam, ab6712, 1:1000) při pokojové teplotě po dobu 30 minut, DAB (diaminobezid in) byl použit k detekovat aktivitu HRP, jádro bylo kontrastně obarveno hematoxylinem. a Imunohistochemie byla analyzována pod mikroskopickými poli 400× od každé skupiny a fixována stupnice=20 μm pomocí Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Německo. Jádro bylo modře zbarveno hematoxylinem a imunopozitivita DAB byla hnědá, hlubší zbarvení DAB znamená silnější imunohistochemicky pozitivní.

2.7. Detekce EPO

Obsah EPO v séru byl detekován soupravou ELISA (Abcam, ab274398) a experiment odkazoval na protokol soupravy ELISA. Jak bylo shrnuto, do vzorku byl přidán koktejl EPO protilátky a inkubován po dobu 1 hodiny. po inkubaci promyjte každou jamku 3krát promývacím pufrem, do druhé jamky inkubované po dobu 15 minut přidali TMB a zastavili reakci.

Celková mRNA ledvin byla extrahována ze zmrazené ledvinové tkáně pomocí Trizolu a translatována mRNA na cDNA. PCR v reálném čase byla provedena pomocí Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) podle protokolu výrobce. Zelený signál SYBR byl získán a měřen systémem ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primery byly: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ a 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ pro potkaní EPO (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ a 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ pro GAPDH (181 b/s, NM_017008,3), housekeeping gens jako vnitřní kontrola ve všech případech. A relativní kvantifikace genové exprese byla vypočtena metodou normalizované genové exprese (2− ΔΔCT).

Stejné množství proteinu z lyzátů kůry ledvin bylo naneseno a odděleno 10% SDS gelem a poté přeneseno na nitrocelulózové membrány. Po blokování v 5% nemastném mléce po dobu 2 hodin při pokojové teplotě byly membrány inkubovány s primární protilátkou při 4 °C přes noc. Poté byly membrány inkubovány s HRP (křenová peroxidáza)-konjugovaným anti-myším IgG (Life Technologies) při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Aktivita HRP byla vizualizována pomocí substrátu Clarity Western ECL a analyzována zobrazovacím systémem Tanon. V této studii byla použita následující primární protilátka: monoklonální EPO (B- 4) z myší (Santa Cruz Biotechnology, sc{8}}, ředění 1/500), monoklonální -aktin z myší (technologie buněčné signalizace, 8H10D10, ředění 1/1000).

2.8. Analýza mastných kyselin s krátkým řetězcem

Systém Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 propojený s Shimadzu LC-20AD) vybavený zdrojem ESI.

Chromatografické separace byly provedeny na koloně Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) s použitím {{10}},1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě ( rozpouštědlo A) a acetonitril (rozpouštědlo B) při průtoku 0,3 ml/min gradientovou elucí: 0–9 min, 25–30 procent B; 9–11 min, 30–40 procent B; 11–20 min, 40–50 procent B; 20–20,1 min, 50–100 procent B; 20,1–23 min, 100 procent B; 23,1 min–25 procent B pro opětovné vyrovnání. Teplota kolony byla 35 ◦C a autosampler byl během analýzy udržován na 4 ◦C, do přístroje byl vstříknut 1 μl každého vzorku. Detekce analytu byla provedena v režimu monitorování více reakcí (MRM), provozovaném v režimu pozitivních iontů. Parametry MS: Průtok nebulizačního plynu: 3,0 l/min; Sušení Průtok plynu: 10 l/min; Topení Průtok plynu: 10 l/min; teplota DL: 250 ◦C; teplota rozhraní: 300 ◦C; Topný blok: 400 ◦C. MRM přechody a srážková energie (CE) byly vybrány a optimalizovány přímou infuzí každého standardního derivátu. Množství analytů MRM přechody byly shrnuty v tabulce S1.

Fekální SCFA: Přidá se 100 μl 50% acetonitrilu do 3 mg lyofilizované stolice a míchá se 2 minuty na vortexu. Poté byla směs centrifugována při 12 000 ot./min. po dobu 10 minut při 4 °C a napipetován supernatant.

Ledvinové SCFA: Odváženo 100 mg ledvinové tkáně a vortexováno na ledu se čtyřnásobkem normálního fyziologického roztoku (100 mg/400 μl), aby se připravil tkáňový homogenát. Do 300 μl tkáňového homogenátu se přidá 3x studený methanol a 2 minuty se vortexuje, poté se směs 10 minut centrifuguje při 12 000 ot./min. při 4 °C a odpipetuje supernatant. Supernatant byl vysušen N2 a rekonstituován 100 ul 50% acetonitrilu.

Přidán 500 mmol/l hydrochloridu N-(3-dimethylaminopropyl)-Ń-ethylkarbodiimidu (EDC, Aladdin, Shanghai, Čína), 50 mmol/l 3H-[1,2,3]-triazolo[4, 5-b] pyridin-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghai, Čína) a 50 mg/ml 12C-dansylhydrazinu (12C-DnsHz, J&K, Peking, Čína) do 20 μL extrakce vzorku v sekvence se stejným objemem. EDC a HOAT byly připraveny s čerstvou 500 mmol/l 2-(N-morfolino)ethansulfonové kyseliny (MES, Macklin, Shanghai, Čína). Po inkubaci při 20 ◦C po dobu 90 minut bylo ke směsi přidáno 20 μl 50 mmol/l CuCl2 (Macklin, Shanghai, Čína), aby se uhasila derivatizační reakce při 40 ◦C po dobu 30 minut (Zhao & Li, 2018). Na konci derivatizace byla směs 10krát zředěna 25% acetonitrilem. Před analýzou bylo 100 ul supernatantu smícháno se 100 ul roztoku vnitřního standardu. Značka 13C-DnsHz byla použita jako vnitřní standardy (ISTD1-8) v souladu se stejnou derivatizační reakcí. Standard SCFA: kyselina octová (AA, A116173), kyselina propanová (PA, P110446), kyselina isomáselná (IBA, I103524), kyselina máselná (BA, B110438), kyselina 2-methylmáselná (2- BA, M107377), kyselina izovalerová (IVA, 1108280), kyselina valerová (VA, V108271), kyselina hexanová (HA, H103632) byly dodány od společnosti Aladdin (Shanghai, Čína).

2.9. Statistická analýza

Data každé skupiny byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Statistická významnost mezi skupinami byla provedena jednocestnou ANOVA a post hoc analýzou Student-Newman-Keulsovým (SNK) testem nebo Dunnettovým T3 testem. Hodnota P < 0.05="" byla="" považována="" za="" statisticky="" významnou.="" všechna="" data="" byla="" provedena="" pomocí="" statistického="" softwaru="" spss="" (verze="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Výsledky

3.1. JP zlepšil funkci ledvin CKD potkanů

Monosacharid JP byl charakterizován před ošetřením na zvířatech. JP použitý v této studii se skládal ze sedmi monosacharidů, tj. rhamnózy (1,62 procenta), arabinózy (15,79 procenta), fukózy (0,21 procenta), xylózy (4,56 procenta), manózy (3. 00 procent), glukóza (73,44 procent) a galaktóza (4,99 procent) (obr. 1). Naše metoda analýzy byla ověřena linearitou, přesností, opakovatelností, stabilitou a výtěžností (tabulky S2–S3). Bylo potvrzeno, že analyty jsou stabilní při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Výtěžek JP by měl být vyšší než 8,63 procenta a čistota by neměla být nižší než 77,16 procenta. Výše uvedená chemická analýza JP sloužila jako přístup ke kontrole kvality k zajištění reprodukovatelnosti níže uvedených studií na zvířatech.

Scr, BUN a protein v moči byly nejreprezentativnějšími funkcemi ledvin. Hladiny scr, BUN a proteinů v moči u potkanů ​​s CKD byly významně vyšší než u kontrolní skupiny (P < {{0}}="" 0,01).="" po="" 90="" dnech="" léčby="" jp="" byly="" hladiny="" scr,="" bun="" a="" proteinu="" v="" moči="" sníženy="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" s="" ckd="" (p="">< 0,01)="" (obr.="">

3.2. JP zlepšil renální patologické poškození u CKD potkanů

Hmotnost celé pravé ledviny pro falešnou skupinu a zbytková pravá ledvina pro CKD a skupinu CKD plus JP byla použita pro hodnocení morfologie ledvin podle hmotnosti ledvin (KW) a hmotnosti ledvin / tělesné hmotnosti (KW/BW). Na konci experimentů byly KW a KW/BW skupiny s CKD zvýšeny ve srovnání s falešnou skupinou (všechny P < {{0}}.05).="" v="" modelu="" ckd="" vyvolaného="" nefrektomií="" 5/6="" způsobilo="" snížení="" aktivity="" renálních="" proteináz="" kompenzační="" růst="" ledvin,="" společnosti="" s="" renální="" hypertrofií="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" a="" my="" jsme="" toto="" tvrzení="" potvrdili.="" po="" léčbě="" jp="" byla="" kw="" významně="" snížena="" (p="">< 0,05)="" a="" uzavřena="" do="" falešné="" skupiny="" (p="" ˃="" 0,05);="" zatímco="" kw/bw="" byla="" mírně="" snížena="" (p="" ˃="" 0,05).="" (obr.="">

Obr. 2. JP chránil funkci ledvin u CKD potkanů. Hladina Scr (A), BUN (B) a bílkoviny v moči (C) v různých skupinách. (D) hmotnost ledvin, (E) KW/BW. Údaje byly prezentovány jako průměr ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" ve="" srovnání="" s="" falešnou="" skupinou;="" #p="">< 0,05="" ,="" ##p="">< 0,01="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="">

Ve skupině s CKD vykazovala renální tubulární atrofie ve srovnání se simulovanou skupinou masivní atrofii (P < {0}}.01)="" a="" oblast="" glomerulu="" a="" renální="" intersticiální="" fibróza="" byly="" téměř="" dvakrát="" větší="" než="" to="" z="" falešné="" skupiny="" v="" kvantitativní="" analýze="" (p="">< 0.01).="" po="" léčbě="" jp="" se="" skóre="" tubulární="" atrofie="" téměř="" dvakrát="" snížilo="" (p="">< 0,01),="" oblast="" glomerulu="" se="" téměř="" obnovila="" na="" falešnou="" skupinu="" (p="">< 0,01)="" a="" renální="" intersticiální="" fibróza="" se="" snížila="" o="" jednu="" třetinu="" (p="">< 0,01).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" ckd="" (obr.="">

Obr. 3. JP chránil strukturu ledvin u CKD potkanů. (A) Barvení PAS. (B) Massonovo barvení. (C) Skóre tubulární atrofie. (D) Glomerulární oblast (E) Fibrotická oblast. Všechny obrázky jsou zobrazeny ve stejném zvětšení, 200×, měřítko=100 μm. Data byla prezentována jako průměr ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0,01="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" s="" falešnou="" kontrolou;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" ckd="">

3.3. JP moduloval hematologické parametry u CKD potkanů

Pro hematologické parametry byly měřeny biochemické analýzy RBC, Hb, HCT a PLT. U CKD potkanů ​​se hladina červených krvinek snížila z 9.{16}}6 na 7,20 × 1012 /L, Hb z 15,28 na 13,22 g/dl, HCT ze 47,1 na 40,4 procenta a PLT se zvýšil od 1012 do 1526 x 109/l ve srovnání s falešnou skupinou (P < 0,01),="" což="" ukazuje,="" že="" známky="" anémie="" byly="" pozorovány="" u="" ckd="" potkanů.="" snížené="" hladiny="" rbc,="" hb,="" hct="" a="" plt="" u="" potkanů="" ​​s="" ckd="" léčených="" jps="" byly="" obnoveny="" (p="">< 0,01)="" (obr.="">

Obr. 4. JP rehabilitoval hematologické parametry u CKD potkanů. Hladina PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Údaje byly prezentovány jako průměr ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" ve="" srovnání="" s="" falešnou="" skupinou;="" #p="">< 0,05="" ,="" ##p="">< 0,01="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="">

3.4. JP stimuloval expresi EPO

Ve srovnání s kontrolní skupinou byly hladina EPO v séru a množství mRNA EPO v ledvinách významně sníženy u potkanů ​​s CKD anémií (P < 0.01).="" analýza="" western="" blotting="" odhalila,="" že="" hladina="" proteinu="" epo="" vykazovala="" mírný="" pokles="" ve="" skupině="" s="" ckd="" bez="" významného="" rozdílu.="" po="" léčbě="" jp="" se="" hladina="" epo="" v="" séru,="" ledvinová="" epo="" mrna="" a="" protein="" významně="" zvýšily="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" s="" ckd="" (p="">< 0,01="" nebo="" p="">< 0,05)="" (obr.="">

V kůře ledvin byl HIF-1 produkován hlavně renálními tubulárními epiteliálními buňkami, HIF-2 byl exprimován hlavně v endoteliálních buňkách a renálních intersticiálních fibroblastech (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Imunohistochemická analýza ukázala, že stejně jako u HIF-1 u potkanů ​​s CKD byly tubulární buňky obarveny silněji než u falešné skupiny. Po léčbě JP mělo renální tubulární barvení silnější a větší oblast ve srovnání se skupinou s CKD, jak ukazuje červená šipka na Obr. 5E. HIF-2 prokázala relativně slabou imunohistochemickou pozitivitu v renální intersticiální oblasti ve skupině Sham. Ve skupině s CKD HIF-2 vykázala imunohistochemicky pozitivní výsledek. Po léčbě JP vykazoval HIF-2 silnější imunohistochemii ve srovnání se skupinou s CKD (obr. 5F).

Obr. 5. JP stimuloval expresi EPO. (A) Obsah EPO v séru. (B)ledvinyEPO relativní mRNA. GAPDH byl považován za housekeeping gen. (C) Reprezentativní obrazy western blotu exprese proteinu EPO. (D) Denzitometrická analýza EPO. (E) Imunohistochemie HIF{{0}} . (F) Imunohistochemie HIF- 2 normalizovaná na obsah -aktinu. Imunohistochemické snímky jsou prezentovány ve stejném zvětšení, 400×, měřítko=20 μm. Jádro bylo modře zbarveno hematoxylinem a imunopozitivita DAB byla hnědá, hlubší zbarvení DAB znamená silnější imunohistochemicky pozitivní. Červená šipka ukazuje na imunohistochemicky pozitivní. Data byla prezentována jako průměr ± SD, n=6 na skupinu (*P < 0,05="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" s="" falešnou="" léčbou;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" s="">

3.5. JP vyvolal uvolňování SCFA

Ke kvantifikaci uvolňování osmi SCFA ve vzorcích stolice byl vyvinut cílený metabolomický přístup založený na LC-MS. Zavedená metoda byla ověřena hodnocením linearity, citlivosti, přesnosti, matricového efektu, přesnosti a stability. Vzorky kontroly kvality s nízkou, střední a vysokou koncentrací (LQC, QMC, HQC) pro ověření citlivosti, přesnosti, přesnosti a stability byly vybrány podle bodů nejnižší, střední a nejvyšší koncentrace standardní křivky matrice a výsledků byly uvedeny v tabulkách S4–S6. Bylo potvrzeno, že analyty jsou stabilní při 4 ◦C po dobu 48 hodin. LC-MS/MS chromatogram SCFA je ukázán na Obr.

Obr. 6. UHPLC-MS/MS chromatografie SCFA. (A) Horní byla derivatizační chemická rovnice SCFA; níže byl strukturní vzorec SCFA po derivatizaci dansylhydrazinu; (B) Chromatogram UHPLC/MRM-MS směsných standardů a vzorku stolice, chromatografické píky v (B) odpovídaly chemickému markeru uvedenému v (A):1. kyselina 12C-octová; 2. kyselina 13C-octová (ISTD1); 3. kyselina 12C-propanová; 4. kyselina 13C-propanová (ISTD2); 5. kyselina 12C-isomáselná; 6. kyselina 12C-máselná; 7. kyselina 13C-isomáselná (ISTD3); 8. kyselina 13C-máselná (ISTD4); 9. kyselina 12C-2-methylmáselná; 10. kyselina 12C-isovalerová; 11. 12C kyselina valerová; 12. kyselina 13C-2-methylmáselná (ISTD5); 13. kyselina 13C-isovalerová (ISTD6); 14. kyselina 13C-valerová (ISTD7); 15. kyselina 12C-hexanová; 16. Kyselina 13C-hexanová (ISTD8).

Pokud jde o vzorek stolice, ve skupině s CKD byly hladiny AA a PA výrazně sníženy téměř 4krát a 5krát ve srovnání s falešnou skupinou (P < 0.01);="" zatímco="" po="" léčbě="" jp="" bylo="" množství="" aa="" a="" pa="" obnoveno="" zpět="" na="" 4/5="" falešné="" skupiny="" (p="">< {{10}}.01).="" podobně="" byly="" hladiny="" ba="" a="" va="" výrazně="" sníženy="" téměř="" 30krát="" a="" 4krát="" ve="" skupině="" s="" ckd="" ve="" srovnání="" s="" falešnou="" skupinou="" (p="">< 0,01).="" léčba="" jp="" vykazovala="" rostoucí="" trend,="" ale="" ne="" výrazné="" zlepšení.="" obsah="" iba,="" iva="" a="" 2-ba="" nevykazoval="" výraznou="" změnu="" mezi="" ckd="" a="" falešnou="" skupinou.="" po="" léčbě="" jp="" se="" hladina="" iba,="" iva="" a="" 2-ba="" zvýšila="" (p="">< 0,01).="" ha="" však="" nevykázala="" zjevnou="" změnu="" mezi="" třemi="" skupinami="" (obr.="" 7a).="" navíc,="" pokud="" jde="" o="" ledvinovou="" tkáň,="" ve="" skupině="" s="" ckd="" bylo="" množství="" osmi="" scfa="" všech="" významně="" sníženo="" (p="">< 0,01),="" zatímco="" po="" léčbě="" jp="" byly="" hladiny="" scfa="" zvýšeny="" kromě="" ba="" a="" ha="" (p="">< 0,01="" nebo="" p="">< 0,5).="" ba="" byla="" mírně="" zvýšena,="" aniž="" by="" byla="" významně,="" a="" ha="" nevykazovala="" změnu="" po="" léčbě="" jp="" (obr.="">

Obr. 7. Obsah SCFA v jiné skupině. (A) Fekální SCFA. (B) ledvinové SCFA. Data byla prezentována jako průměr ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" ve="" srovnání="" s="" falešnou="" skupinou;="" ##p="">< 0.="" 01,="" #p="">< 0,05="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="">

4. Diskuze

V současném modelu potkana s CKD s 5/6 nefrektomiíledvinafunkceukazatele (Scr, BUN a protein v moči) byly významně zvýšeny, objevila se zbytková renální hypertrofie a renální patologické poškození doprovázené změnami hematologických parametrů. Tyto údaje byly v souladu s předchozími studiemi (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Výše uvedené indikátory ukázaly, že CKD-anémie krys indukovaná 5/6 nefrektomií byla úspěšně prokázána a mohl být ověřen pro příznivý účinek JP při léčbě CKD-anémie krys. sledvinafunkcedále zhoršovala, anémie byla uznána jako známá oportunní komplikace CKD, která negativně ovlivnila kvalitu života pacientů (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Pochopení rizikových faktorů souvisejících s progresí renální anémie pomůže vyvinout terapeutické přístupy. V současné době přitahuje stále větší pozornost souvislost mezi onemocněním a metabolismem střevní mikroflóry, zatímco vztah mezi SCFA a renální anémií je stále méně známý. SCFA, metabolizované hlavně Clostridium, Coprococcus a Bacteroides (Koh et al., 2016), se zaměřují na specifické membránově vázané receptory, které hrají důležitou roli při udržování rovnováhy střevního prostředí a zdraví celého těla. Již bylo prokázáno, že SCFA mají neoddělitelný vztah s CKD a hladiny kyseliny octové, kyseliny propionové a kyseliny máselné byly u CKD sníženy (Wang et al., 2019). U adeninem indukovaných CKD potkanů ​​se hojnost a diverzita střevní mikrobioty významně změnily, společnosti snížily hladinu kyseliny propanové, kyseliny máselné a kyseliny valerové (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Na základě naší předchozí studie sekvenování 16S rDNA ukázalo, že dysbióza střevní mikroflóry se projevila u 5/6 potkanů ​​s CKD indukovaným nefrektomií ve srovnání s falešnou skupinou. Některé SCFA produkující rody, zejména kyselinu máselnou z Clostridium, Coprococcus, vykazovaly rozdíly u CKD potkanů ​​(Zheng et al., 2020). V souladu s tím naše výsledky ukázaly, že množství kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny máselné a kyseliny valerové se u CKD potkanů ​​snížilo o přibližně 60 procent, 80 procent, 85 procent a 60 procent, což ukazuje, že pokles SCFA odpovídal s nerovnováhou střevního prostředí. Za zmínku stojí, že porucha střevního prostředí vyvolaná CKD spustila abnormální metabolismus střevní mikroflóry (Feng et al., 2019). Navíc jsme zjistili, že u potkanů ​​s CKD anémií bylo sníženo osm druhů hladin SCFA. Například abnormalita konečných metabolických produktů, tj. SCFA, může být důsledkem progrese CKD.

Polysacharidy, jedna z účinných látek, byly nalezeny v různých bylinách, jako je Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix a Jujubae Fructus. Polysacharidy mohou být fermentovány a degradovány střevní mikroflórou. V důsledku toho jsou polysacharidy prezentovány jako substrát pro střevní mikroflóru k metabolizaci na SCFA nebo se má za to, že mají prebiotický účinek na zlepšení složení střevní mikroflóry, aby se usnadnila produkce SCFA (Cai et al., 2019). V této studii naše zjištění odhalila, že polysacharidy z jujuby stimulovaly uvolňování SCFA střevní mikroflórou, jako je kyselina octová, kyselina propanová, kyselina izomáselná, kyselina 2-methylmáselná u CKD potkanů. Kromě toho se po léčbě JP zlepšila hladina SCFA v ledvinách potkanů ​​s CKD anémií a tendence ke změně byla konzistentní se vzorkem stolice. Na základě existujícího výzkumu se vztah mezi SCFA a CKD postupně vyjasňoval. Například bylo popsáno, že kyselina octová moduluje imunitní systém a zlepšuje akutní stavledvinazraněníinhibicí signalizace NADPH oxidázy v T buňkách (Al-Harbi et al., 2018). Bylo prokázáno, že kyselina propanová zabraňuje progresi adeninem indukovaného CKD prostřednictvím receptoru pro volné mastné kyseliny 2 (FFA2) a FFA3 (Mikami et al., 2020). Proto jsme usuzovali, že znovunabytá hladina SCFA v ledvinách byla pro nemocné ledviny prospěšná. Bylo hlášeno, že JP zvýšil diverzitu střevní mikroflóry a zvýšil relativní množství aktivní mikrobioty SCFA (Bacteroides) u myší s kolorektálním karcinomem (Ji et al., 2020). Kromě toho JP zvýšil koncentraci celkových SCFA ve vzorcích stolice (Ji et al., 2019). Proto jsme usoudili, že JP by mohl stimulovat produkci SCFA, aby bylo dosaženo účelu zpomalení progrese CKD. JP může být také metabolickým substrátem pro dominantní mikroflóru SCFA pro stimulaci produkce SCFA u CKD nebo prebiotickou složkou pro obnovení střevního prostředí, zejména rozmanitosti dominantní mikroflóry SCFA, a dále podporovat uvolňování SCFA, aby se zabránit progresi CKD.

Obecně je obtížné analyzovat SCFA (bez uhlíku než 6) s malou molekulovou hmotností a vysokou chemickou polaritou přímo chromatografickými přístupy. Izotopově značená chemická derivatizace strategie SCFA by mohla zlepšit citlivost přístroje a snížit chyby analýzy, což poskytlo užitečnou strategii pro stanovení SCFA v analýze LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). V poslední době se při detekci cílových metabolitů lidské plazmy obsahujících karboxylovou kyselinu uspokojivě používají přístupy značené dansylhydrazinem (Chen & Zhang, 2020). Na podporu toho jsme v této studii dále vyvinuli chemickou derivatizaci založenou na přístupu LC-MS/MS pro stanovení 8 SCFA ve výkalech potkana. SCFA jsou produkovány střevní mikroflórou a téměř 10 procent SCFA se vylučuje stolicí (Boets et al., 2015). Analýza vzorků stolice SCFA proto může přímo odrážet změny ve střevním prostředí a má větší referenční hodnotu v multi-omické společné analýze mezi SCFA a střevní mikroflórou. Při validaci nestability jsme zjistili, že dansylhydrazinem značené SCFA byly nestabilní při pokojové teplotě a jejich intenzita na hmotnostním spektru vykazovala s časem klesající tendenci, ale mohla zůstat stabilní po dobu 48 hodin při 4 °C. Po derivatizaci SCFA by se tedy analyty měly před analýzou uchovávat při 4 °C.

V pokročilých stadiích CKD 4–5 omezuje nedostatek produkce EPO erytropoézu, což přispívá k nejkritičtějšímu faktoru rozvoje renální anémie (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Rutinní léčba anémie látkami stimulujícími erytropoézu (ESA) je navržena v pokynech pro klinickou praxi. Je však třeba brát v úvahu bezpečnost ESA, která je spojena se zvýšeným rizikem úmrtí a kardiovaskulárních příhod (Thavarajah & Choi, 2019). U pacientů s renální anémií měla být exprese EPO konzistentní nebo zrakově zvýšená ve srovnání se zdravými těly (Babitt & Lin, 2012). V rané fázi vykazovala úroveň EPO trend upgradu, zatímco v pozdní fázi vykazovala úroveň EPO klesající trend ve srovnání s ranou fází, dokonce nižší než normálně (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's a Derviˇsevi ´c, 2017). V souladu s předchozími experimenty (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020) naše výsledky ukázaly, že hladina EPO v séru byla snížena u CKD-anémie potkanů. V tomto pořadí jsme detekovali ledvinovou EPO mRNA a hladinu proteinu u CKD potkanů ​​a hladina ledvinového EPO proteinu byla mírně snížena ve srovnání se simulovanou skupinou, zatímco množství ledvinové EPO mRNA bylo degradováno a jeho stupeň byl vyšší než hladina EPO v séru. Ledviny jsou primárním zdrojem syntézy EPO u dospělých a pacientů s ERSDledvinystále si zachovává schopnost produkovat erytropoetin (Bernhardt et al., 2010). Pro korekci endogenních hladin EPO v séru a přizpůsobení se renální anémii byla však aktivována produkce EPO v ledvináchledvinazraněnísnížená exprese EPO mRNA (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Po ošetření JP byla zvýšena hladina EPO v séru, stejně jako hladina mRNA EPO v ledvinách a hladiny proteinu byly zvýšeny. V naší předchozí studii mohl JP stimulovat transkripční aktivitu HRE a posílit gen EPO (Chen et al., 2014). Proto jsme spekulovali, že JP by mohl obnovit hladinu EPO v séru potkanů ​​CKD k regulované renální anémii, k níž může přispět stimulovaná exprese genu EPO v ledvinách na úrovni mRNA.

V kortexu byl HIF-1 nalezen hlavně v tubulárním a HIF-2 v renálním intersticiu. Protože EPO je produkován hlavně fibroblasty, ve kterých je HIF-2 společně umístěn, podporuje to, že HIF-2 může být odpovědný za regulaci produkce EPO (Maxwell, 2003). V naší studii jsme zjistili, že HIF-1 a HIF-2 mohou být aktivovány CKD a léčba JP by mohla stimulovat aktivitu HIF-1 a HIF-2 ve srovnání s CKD potkany . Bylo prokázáno, že HIF{10}} hraje hlavní roli v regulaci produkce EPO (Kapitsinou et al., 2010), zatímco upregulace HIF{12}} může mít účinek ochrany ledvin v ledvinách (Jiang et al. al., 2020), což nepřímo zlepšuje produkci EPO. Produkce EPO v ledvinách byla nejprve regulována na úrovni mRNA, při anémii nebo hypoxii mohla být exprese EPO mRNA zvýšena stimulací proteinu HIF. Dříve farmakologický výzkum ukázal, že jujuba stimulovala expresi EPO prostřednictvím regulace hladiny proteinu HIF v buněčném modelu (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Proto jsme usoudili, že JP může upregulovat expresi EPO mRNA prostřednictvím HIF- proteinu, aby bylo dosaženo účelu zmírnění renální anémie.

Dále na základě současných výsledků spekulujeme, že snížení SCFA může mít zásadní roli v expresi EPO zprostředkované HIF, která přispívá k CKD anémii. V rozporu s tím bylo prokázáno, že zvýšená hladina kyseliny octové byla prospěšná pro acetylaci HIF{2}} a tvorbu komplexu CREB-vazebný protein-HIF 2 a dále indukovala expresi EPO (Xu et al., 2014). Kyselina propionová zmírnila narušení mitochondrií, hipokampální apoptózu a neurologické deficity prostřednictvím dráhy HIF-1/ERK (Cheng et al., 2019). Navíc bylo zjištěno, že kyselina máselná stabilizuje HIF-1, aktivní cílové geny HIF na buňkách tlustého střeva a zmírňuje zánětlivou reakci tlustého střeva (Kelly et al., 2015). V naší studii jsme zjistili, že hladiny kyseliny octové, kyseliny propanové a kyseliny máselné byly významně sníženy spolu s abnormální expresí HIF-proteinu u potkanů ​​CKD, což naznačuje, že stabilita HIF- může souviset s poklesem SCFA a SCFA mohou mít účinek stabilizace HIF na regulaci exprese EPO.

5. Závěry

Závěrem jsme dokázali, že JP zlepšil CKD as ním spojenou anémii, jejíž mechanismus se podílel na regulaci uvolňování SCFA a produkci EPO. A JP může být bioaktivní složkou jujuby pro léčbu anémie. Tato zjištění mohou poskytnout důkazy pro další vývoj JP jako potravinových doplňků pro léčbu anémie spojené s CKD.

Etické prohlášení

Všechny experimenty na zvířatech v našem výzkumu byly provedeny podle protokolů schválených Etickou komisí Guangzhou University of Chinese Medicine a v souladu s pokyny National Institutes of Health pro péči a použití laboratorních zvířat (publikace NIH č. 80-23, revidováno v roce 1996). V našem výzkumu nedochází k žádnému porušení výše uvedených pokynů.

Poděkování

Tato práce je podporována Natural Science Foundation of Guangdong Province (2018A030313305), Natural Science Foundation of China (81804052, 81973577 a 82004248), Shenzhen Science and Technology Plan Project (JSGG20191129102vin a Gu21506eau50vinong Z01216eau5666 20201320).

Reference

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ibrahim, KE (2018). Acetát mastných kyselin s krátkým řetězcem zmírňuje akutní sepsíledvinazraněníinhibicí signalizace NADPH oxidázy v T buňkách. International Immunopharmacology, 58, 24–31.
Babitt, JL, & Lin, HY (2012). Mechanismy anémie u CKD. Journal of the American Society of Nephrology, 23(10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., …Eckardt, KU (2010). Inhibice prolylhydroxyláz zvyšuje produkci erytropoetinu u ESRD. Journal of the American Society of Nephrology, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015). Kvantifikace in vivo produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem v tlustém střevě z inulinu. Živiny, 7(11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019). Složené polysacharidy zlepšují experimentální kolitidu modulací složení a funkce střevní mikroflóry. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 34(9),1554–1562.

Chen, G., & Zhang, Q. (2020). Simultánní kvantifikace volných mastných kyselin a acylkarnitinů ve vzorcích plazmy pomocí značení dansylhydrazinem a kapalinové chromatografie – trojité kvadrupólové hmotnostní spektrometrie. Analytické a bioanalytickéChemie, 412(12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014). Extrakt z plodu Ziziphus jujuba (jujuba) indukuje expresi erytropoetinu prostřednictvím hypoxií indukovatelného faktoru-1 v kultivovaných Hep3B buňkách. PlantaMedica, 80(17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019). Odvar z Jian-Pi-Yi-Shen zmírňuje renální anémii u 5/6 nefrektomizovaných potkanů: Produkce erytropoetinu prostřednictvím signalizace faktoru indukovaného hypoxií. Doplňková a alternativní medicína založená na důkazech, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., … Ding, H. (2019). Propionát zmírňuje záchvaty vyvolané pentylentetrazolem, následné narušení mitochondrií, nekrózu neuronů a neurologické deficity u myší. Biochemická farmakologie, 169, článek 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019). Mikrobiome-metabolomika odhaluje střevní mikroflóru spojenou s metabolity konjugovanými s glycinem a metabolismem polyaminů u chronického onemocnění ledvin. Cellular and Molecular Life Sciences, 76(24), 4961–4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015). Dysmetabolismus železa a hepcidinu, anémie a renální hypoxie, zánět a fibróza na modelu potkanů ​​se zbytky ledvin. PLoS ONE, 10(4), článek e124048.
Higashi, T., & Ogawa, S. (2016). Izotopově kódovaná derivatizační činidla zvyšující ESI pro diferenciální analýzu, kvantifikaci a profilování metabolitů v biologických vzorcích pomocí LC/MS: Přehled. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., & Guo, X. (2020). Metagenomická analýza modulačních účinků polysacharidů jujuby (Ziziphus jujuba Mill.) na střevní mikrobiotu na myším modelu kolorektálního karcinomu. Food & Function, 11(1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M., & Liu, Y. (2020). Srovnání strukturní charakterizace a antioxidační aktivity polysacharidů z plodů jujuby (Ziziphus jujuba Mill.). International Journal of Biological Macromolecules, 149, 1008–1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019). Mikrobiometabolomická analýza vlivu Zizyphus jujuba cv. Spotřeba polysacharidů Muzao u myší s kolorektálním karcinomem, fekální mikroflóra a metabolity.International Journal of Biological Macromolecules, 131, 1067–1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., & Wang, M. (2017). Izolace, struktury a bioaktivity polysacharidů z plodů jujuby (Ziziphus jujuba Mill.): Přehled. Chemie potravin, 227, 349–357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020). HIF-1 zlepšuje tubulární poškození u diabetické nefropatie prostřednictvím HO-1-zprostředkované kontroly mitochondriální dynamiky. Buněčná proliferace, 53(11), článek e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010). Hepatální HIF-2 reguluje erytropoetické reakce na hypoxii při renální anémii. Krev, 116(16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015). Přeslechy mezi mastnými kyselinami s krátkým řetězcem získaným z mikrobioty a střevním epiteliálním HIF zvyšuje funkci tkáňové bariéry. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ ackhed, F. (2016). Od vlákniny k fyziologii hostitele: Mastné kyseliny s krátkým řetězcem jako klíčové bakteriální metabolity. Cela, 165(6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH, & Terranegra, A. (2021). Vliv prebiotické akácie na složení střevního mikrobiomu u potkanů ​​s experimentálním chronickým onemocněním ledvin. Biomedicína a farmakoterapie, 133, článek
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016). Chemické a biologické hodnocení bylinných odvarů obsahujících jujubu (Ziziphus jujuba): Indukce exprese erytropoetinu v kulturách. Journal of Chromatography BAnalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR a Lee, FS (2019). Aktualizace o mutacích v HIF: EPO dráze a jejich roli v erytrocytóze. Krevní recenze, 37, článek 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Příznivé účinky na energetický metabolismus hostitele mastných kyselin s krátkým řetězcem a vitamínů produkovaných komenzálními a probiotickými bakteriemi. Microbial Cell Factories, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L., & Fu, P. (2017). Mastné kyseliny s krátkým řetězcem pocházející ze střevní mikrobioty a onemocnění ledvin. Vývoj a terapie lékového designu, 11, 3531–3542.
Li, L. a Shi, JY (2013). Analýza polysacharidových a lipidových složek kůry cinnamomi pomocí GC-MS. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015). Hepatoprotektivní účinky polysacharidů extrahovaných ze Zizyphus jujube cv. Huanghetanzao. International Journal of Biological Macromolecules, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA, & Macdougall, IC (2017). Cílení na hypoxii indukovatelné faktory pro léčbu anémie u pacientů s chronickým onemocněním ledvin. American Journal of Nephrology, 45 (3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). Kardiovaskulární bezpečnost a úmrtnost methoxypolyethylenu ze všech příčin

Glykol-Epoetin beta a další látky stimulující erytropoézu u anémie CKD: Randomizovaná studie noninferiority. Klinický časopis Americké nefrologické společnosti: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: Systém reakce na kyslík se zvláštním významem pro ledviny. Journal of the American Society of Nephrology, 14(11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Osa střevo-ledviny: indoxylsulfát, p-kresylsulfát a progrese CKD. Nefrologická dialyzační transplantace, 26(3), 759–761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020). Mastná kyselina s krátkým řetězcem zmírňuje adeninem indukované chronické onemocnění ledvin prostřednictvím drah FFA2 a FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), článek 158666.
Morton, DB a Griffiths, PH (1985). Pokyny pro rozpoznání bolesti, úzkosti a nepohodlí u pokusných zvířat a hypotéza pro hodnocení. Veterinární záznam, 116(16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori´´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Interpretace hladin erytropoetinu a hemoglobinu u pacientů s různými stádii chronického onemocnění ledvin. Journal of Medical Biochemistry, 36(2), 145–152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A., & Katopodis, K. (2015). Méně známé patofyziologické mechanismy anémie u pacientů s diabetickou nefropatií. Mezinárodní urologie a nefrologie, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2019). Inhibitory hypoxií indukovatelného faktoru-prolylhydroxylázové domény k léčbě anémie u chronického onemocnění ledvin. Příspěvky k nefrologii, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J., & Ratcliffe, PJ (2019). Mechanismy signalizace hypoxie: Nové implikace pro nefrologii. Nature Reviews Nephrology, 15(10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Účinek pšeničných prebiotik na střevní bakteriální populaci a stav železa u brojlerových kuřat s nedostatkem železa. Výživový časopis, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015). Dráha trimethylamin N-oxidu závislá na střevní mikrobiotě (TMAO) přispívá jak k rozvoji renální insuficience, tak k riziku mortality u chronického onemocnění ledvin. Výzkum cirkulace, 116(3), 448–455.
Thavarajah, S., & Choi, MJ (2019). Použití látek stimulujících erytropoézu u pacientů s CKD a rakovinou: klinický přístup. American Journal of Kidney Diseases, 74 (5), 667–674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020). Jian-PiYi-Shen reguluje expresi EPO a proteinu recyklujícího železo u anemických potkanů ​​s chronickým onemocněním ledvin: Akumulace hypoxií indukovatelného faktoru-2 prostřednictvím ERK signalizace. Doplňková a alternativní medicína založená na důkazech, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Kvantitativní snížení mastných kyselin s krátkým řetězcem, zejména butyrátu, přispívá k progresi chronického onemocnění ledvin. Klinická věda, 133(17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL, & Masson, P. (2017). Chronické onemocnění ledvin. Lancet (Londýn, Anglie), 389 (10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020). Trib1 přispívá k zotavení z akutního poškození ledvin vyvolaného ischemií/reperfuzí regulací polarizace renálních makrofágů. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014). Acetátový spínač reguluje stresovou erytropoézu. Nature Medicine, 20(9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015). Polysacharidy divoké jujuby chrání před experimentálním zánětlivým onemocněním střev tím, že umožňují zvýšenou funkci střevní bariéry. Jídlo a funkce, 6(8), 2568–2577.

Zhao, S., & Li, L. (2018). Značení izotopů dansylhydrazinu LC-MS pro komplexní profilování submetabolomu karboxylové kyseliny. Analytická chemie, 90(22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020). Zřetelné reakce střevní mikroflóry na odvar z Jian-Pi-Yi-Shen jsou spojeny se zlepšenými klinickými výsledky u 5/6 nefrektomizovaných potkanů. Frontiers in Pharmacology, 11, 604.