Izolace extraktu z měkkého korálového symbiotického mikroorganismu Salinispora Arenicola s cytoprotektivními a anti-aging účinky, část 1

Abstraktní: Buňky vyvinuly vysoce integrovaný systém zodpovědný za stabilitu proteomu, konkrétně síť proteostázy (PN). Protože ztráta proteostázy je charakteristickým znakem stárnutí a nemocí souvisejících s věkem, aktivace PN modulů může pravděpodobně prodloužit zdravotní stav. Zde uvádíme údaje o biologické aktivitě extraktu (SA223-S2BM) purifikovaného z kmene Salinispora arenicola TM223-S2, který byl izolován z měkkých korálů Scleronephthya lewinsohni; tento korál byl sesbírán v hloubce 65 m z mezofotického ekosystému Rudého moře EAPC (jižní Eilat, Izrael). Ošetření lidských buněk proteostatickými moduly aktivovanými SA223-S2BM snížilo oxidační zátěž a poskytlo ochranu před oxidačním a genotoxickým stresem. Kromě toho SA223-S2BM zvýšil aktivity proteazomu a lysozomálních katepsinů u mušek Drosophila a projevil ochranné účinky na kůži, o čemž svědčí účinná inhibice enzymů souvisejících se stárnutím kůže, elastázy a tyrosinázy. Navrhujeme, aby extrakt SA223-S2BM představoval pravděpodobně slibný zdroj pro upřednostňování molekul s vlastnostmi proti stárnutí.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý reparační účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na cistanches herba

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: stárnutí; antioxidační reakce; mořský mikroorganismus; síť proteostázy; Salinispora arenicola

1. Úvod

Stárnutí je charakterizováno časově závislým poklesem funkční kapacity a odolnosti vůči stresu, jakož i zvýšenou mortalitou a morbiditou [1]. Stárnutí není jen pasivní proces, protože je regulováno evolučně konzervovanými molekulárními a buněčnými signalizačními událostmi [2,3]. Organismy jsou neustále vystaveny jak vnitřním (souvisejícím s metabolismem), tak vnějším (pocházejícím ze stravy nebo životního prostředí) stresorům, které mohou vést k postupné akumulaci poškozených biomolekul a případně ohrozit buněčnou homeostázu [4,5]. Proteiny se podílejí na všech klíčových buněčných funkcích, a proto je homeostáza proteomu (proteostáza) rozhodující pro buněčnou funkčnost a přežití [6].

Integrita proteomu je udržována sítí proteostázy (PN), která se rozšiřuje do všech subcelulárních kompartmentů a je regulována na buněčné, tkáňové a organizmové úrovni, aby bylo zajištěno zdraví a dlouhověkost organismu [7]. Udržení proteostázy vyžaduje, aby buňky koordinovaly a regulovaly funkce syntézy, skládání, třídění, transportu a degradace všech polypeptidů [8,9]. Tyto buněčné funkce jsou většinou prováděny třemi hlavními propojenými větvemi PN, konkrétně sítí molekulárních chaperonů, proteolytickými cestami ubikvitin-proteazom-(UPP) a autofagy-lysozom-(ALP) [10,11].

Molekulární chaperony zajišťují správné skládání proteinů a konformační udržení a také spolupracují s degradačními cestami [12]. UPP je hlavním místem kontroly kvality syntézy proteinů a podílí se na recyklaci normálních proteinů s krátkou životností a neopravitelných špatně složených nebo nesbalených proteinů [6], zatímco ALP je zodpovědná za rozpoznání a odstranění proteinových agregátů a poškozených organel. [13]. Ztráta proteostázy je charakteristickým znakem stárnutí [14] a také hlavním rizikovým faktorem mnoha lidských patologií souvisejících s věkem, včetně rakoviny, cukrovky, kardiovaskulárních poruch a neurodegenerativních onemocnění [15]. Aktivace PN je proto považována za slibný přístup k oddálení nástupu a/nebo progrese stárnutí a nemocí souvisejících s věkem [16–18].

Stárnutí kůže je charakterizováno strukturálními a funkčními změnami (mimo jiné) složek extracelulární matrix, jako je elastin [19]. Elastáza je enzym, který se podílí na degradaci elastinu, což má za následek vznik vrásek a ztrátu elasticity [20]. Tyrosináza je klíčovým enzymem syntézy melaninu, který je zodpovědný za pigmentaci (mimo jiné) lidské kůže [21,22]. Nadměrná aktivace tyrosinázy je však spojena s několika kožními poruchami, jako je hyperpigmentace a melanom [22,23]. Proto inhibice elastázy a tyrosinázy představuje prominentní přístup proti stárnutí kůže.

Přírodní produkty (NP) mají dlouhou historii – dobře zdokumentovanou před zrodem moderní vědy a technologie v různých kulturách – léčby lidských nemocí [24–26]. NP tedy mohou sloužit jako vysoce obohacené výchozí materiály a lešení pro vývoj léčiv; více než polovina všech léků jsou buď NP, odvozené NP nebo inspirované NP [27–29]. Mořský svět, který skrývá největší biologickou rozmanitost, je z velké části neprozkoumaný, a proto může být nejrozsáhlejším zdrojem pro objevování nových NP [30]. Mezi organismy, které žijí v mořském prostředí, jsou měkké korály slibnými poskytovateli bioaktivních NP a je známo, že hostí mnoho různých mikroorganismů [31,32].

Vzhledem k těmto skutečnostem v současné době provádíme rozsáhlý vysoce výkonný screening NP, abychom identifikovali bioaktivní molekuly, které by mohly potenciálně zpomalit stárnutí buněk a/nebo stárnutí in vivo. Ve studii uvedené v tomto dokumentu jsme zkoumali methanolový extrakt, konkrétně SA223-S2BM, kmene Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 pomocí in vitro testů a také na buněčných a biologicky řízené přístupy in vivo. Kmen S. arenicola TM223-S2 byl izolován z měkkých korálů Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (původně pojmenovaný jako Scleronephthya lewinsohni podle Verseveldta a Benayahu, 1978), který byl udržitelným způsobem získáván z mezofotického Rudého moře (ekosystém EAPC jižní Eilat, Izrael) v hloubce 65 m. Metanolový extrakt SA223-S2BM aktivoval cytoprotektivní mechanismy jak v lidských buňkách, tak v mouchách Drosophila melanogaster (D. melanogaster) a projevoval in vitro ochranné vlastnosti pokožky. Proto by extrakt SA223-S2BM mohl být zdrojem pro pravděpodobnou identifikaci molekul s potenciálními cytoprotektivními a anti-aging vlastnostmi.

2. Materiály a metody

2.1. Původ a izolace extraktu SA223-S2BM

2.1.1. Coral Collection

Měkký korál S. Levinson byl shromážděn pomocí ROV H800 (ECA Robotics) provozovaného Samem Rothbergem R/V z Meziuniverzitního institutu pro námořní vědy v Eilatu (IUI). In situ bylo fotografování prováděno nízkosvětelnou černobílou kamerou VS300 (ECA Robotics) a 1CAM Alpha HD kamerou (SubC Imaging). Vzorky byly získány ramenem ROV z mezofotického útesu Eilat, mimo terminál ropného mola (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), ve výšce 65 m, dne 7. března 2017. Místo sběru se vyznačuje mírným svahem se skalnatými místy obklopenými písčitým mořským dnem. Po odběru byl materiál okamžitě zmražen na -80 ◦C. Vzorek poukázky byl uchován v 70% etanolu pro taxonomickou identifikaci a uložen v Steinhardtově přírodovědném muzeu, Tel Aviv University (SMNHTAU_Co{16}}).

2.1.2. Izolace a identifikace kmenů

S. arenicola TM223-S2 byl izolován z 1 ml vzorku S. Levinsona. Odebraný vzorek měkkých korálů byl rozemlet ve sterilní mořské vodě a zahříván na 50 ◦C po dobu 1 hodiny. Výsledná suspenze byla sériově zředěna, nanesena na selektivní izolační agarové médium a inkubována při 28 °C po dobu alespoň 6 týdnů. Kmen Salinispora byl izolován a kolonie byla purifikována na mořském bujónovém agaru (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a konzervována při -20 °C v 10% roztoku glycerolu.

2.1.3. Vyšetřování fylogeneze

Fylogenní analýza byla provedena pomocí fragmentu genu 16S rRNA amplifikovaného z genomové DNA S. arenicola TM223-S2. Genomová DNA kmene TM223-S2 byla izolována pomocí soupravy DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce. Fragment 16S ribozomální RNA byl amplifikován pomocí PCR s použitím primerů 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) a 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Amplikony byly sekvenovány Sangerovým sekvenováním a sekvence byly porovnány s databází 16S ribozomální RNA projektu Targeted Loci NCBI pomocí MUSCLE. Zarovnání bylo ručně zkontrolováno a mezery byly odstraněny. Evoluční historie byla odvozena pomocí metody maximální věrohodnosti a modelu Tamura–Nei [33] s 1000 replikacemi. Počáteční strom pro heuristické vyhledávání byl získán automaticky aplikací algoritmů soused-join a BioNJ na matici párových vzdáleností odhadnutých pomocí přístupu maximální složené pravděpodobnosti (MCL) a poté výběrem topologie s nadřazenou hodnotou logaritmické pravděpodobnosti. Evoluční analýzy byly provedeny v MEGA X verze 10.1.7 [34].

2.1.4. Podmínky kultivace

Spory S. arenicola TM223-S2 byly konzervovány při -20 ◦C v 10 procentech glycerolu. Před kultivací byl kmen oživován po dobu 15 dnů na 15 cm Petriho misce obsahující MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplněný 2 procenty agaru (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , USA). Sterilní mořská voda (4 x 10 ml) byla nalita na povrch destičky a spory a mycelium byly získány z destičky jemným poškrábáním povrchu skalpelem, aby se vytvořilo inokulum. Fermentace v kapalném stavu (LSF) byla prováděna ve 21 Erlenmeyerově baňce po dobu 20 dnů při 28 °C a 130 ot./min. Před sterilizací byla přidána pryskyřice Amberlite XAD16 (30 g/l) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Nizozemsko), aby se umožnilo zachycení mikrobiálních metabolitů in situ. Pět mililitrů inokula bylo použito k naočkování 1 1 na MB obsahující 30 g pryskyřice Amberlite XAD16. Fermentace v agarovém stavu spojená s extrakcí v pevné fázi (SPE) [35] byla provedena na médiu MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplněném 2 procenty agaru (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) po dobu 20 dnů při 28 ◦C. Sterilizovaný Amberlite XAD16 (35 g) smíchaný s 35 ml inokula byl homogenně rozetřen na povrch 1 MB agarové Petriho misky (25 cm x 25 cm).

Pro LSF byla pryskyřice XAD16 oddělena od kultivační půdy filtrací a promyta vodou před elucí ethylacetátem (100 ml) a poté methanolem (100 ml). Eluáty byly zakoncentrovány do sucha ve vakuu a solubilizovány v DMSO na koncentraci 10 mg/ml. Výsledný extrakt, SA223-S2LAE (extrahovaný pomocí ethylacetátu), byl použit pro biologická hodnocení.

Pro SPE byla pryskyřice XAD16 získána opatrným seškrábáním povrchu agarové plotny. Získaná pryskyřice byla promyta vodou, aby se odstranila biomasa, a poté byla eluována ethylacetátem (100 ml) a poté methanolem (100 ml). Eluáty byly zakoncentrovány do sucha ve vakuu a solubilizovány v DMSO na koncentraci 10 mg/ml. Výsledné extrakty, SA223-S2BAE (extrahované pomocí ethylacetátu) a SA223-S2BM (extrahované pomocí methanolu), byly použity pro biologická hodnocení.

2.2. Inhibiční aktivity elastázy a tyrosinázy

Inhibiční aktivita elastázy u prioritního extraktu byla hodnocena pomocí elastázy z prasečí slinivky (PPE) typu IV (Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a substrátu N-sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidu (Merck KGaA, Darmstadt, Německo), jak bylo popsáno dříve [36]. Schopnost extraktu inhibovat katalytický účinek tyrosinázy při oxidaci L-DOPA na dopachrom byla stanovena, jak již bylo dříve publikováno [37].

2.3. Buněčné linie, podmínky buněčné kultury a test buněčné životaschopnosti

Fibroblasty lidské předkožky (BJ buňky) byly zakoupeny od American Tissue Culture Collection (ATCC), zatímco lidské imortalizované keratinocyty (HaCaT buňky) byly získány od Elabscience, Inc. Obě buněčné linie byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) doplněné o 10 procent (v/v) fetálního bovinního séra (FBS) a 1 procento (v/v) neesenciálních aminokyselin a byly udržovány v podmínkách 5 procent CO2, 95 procent vlhkost a 37 ◦C. Ve všech použitých experimentálních postupech byly buňky subkultivovány s použitím roztoku trypsin/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Účinek extraktu SA223-S2BM na životaschopnost buněk byl odhadnut pomocí testu MTT, jak již bylo uvedeno [38]. Ošetření buněk peroxidem vodíku (H202) a doxorubicinem (DXR) bylo provedeno tak, jak je popsáno v legendách obrázků; H202 a DXR byly získány od Merck KGaA (Darmstadt, Německo).

2.4. Drosophila Lines and Longevity Assay

V této studii jsme použili kmen Drosophila w1118 zakoupený od Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Mouchy byly udržovány při 25 °C a 60 procentech vlhkosti v cyklu 12 h světlo: 12 h tma. Ve všech prezentovaných experimentech byly analyzovány pouze somatické tkáně (hlava a hrudník) much, protože reprodukční tkáně vykazují odlišnou regulaci proteostatických mechanismů a rychlosti stárnutí ve srovnání se somatickými tkáněmi [39].

Dlouhá životnost much byla testována, jak je popsáno výše [40] s použitím samic a samců much (stejný počet na pohlaví), které byly kultivovány v lahvičkách obsahujících (nebo ne) studovaný extrakt. Mouchy byly přemístěny do lahviček s čerstvou potravou každé dva dny a úhyny byly hodnoceny denně. Pro křivky přežití a statistickou analýzu byl použit Kaplan-Meierův postup a log-rank (Mantel-Cox) test; významnost byla přijata při p < 0,05.

2.5. Měření druhů reaktivního kyslíku (ROS)

Buňky nebo tkáně much byly inkubovány s barvivem CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) v koncentraci 10 µM v PBS po dobu 30 minut ve tmě (37 ◦C a 25 ◦C). Po odstranění barviva byly buňky nebo tkáně much inkubovány s PBS po dobu 15 minut ve tmě (37 ◦C a 25 ◦C, v daném pořadí), lyžovány v lyzačním pufru [150 mM NaCl, 1 procento (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] a poté centrifugujte při 14,000 g po dobu 15 minut (4 ◦C). Poté byl měřen obsah proteinu Bradfordovým testem (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a vytvořená fluorescence byla měřena v multimódové čtečce mikrodestiček Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Švýcarsko) při excitaci. a emisní vlnové délky 490 a 540 nm, v daném pořadí. Peroxid vodíku (H2O2) byl použit jako pozitivní kontrola, protože je všeobecně známo, že způsobuje oxidační poškození/stres [41].

2.6. Extrakce RNA, syntéza cDNA a kvantitativní analýza PCR v reálném čase (Q-RT-PCR)

Celková RNA byla extrahována z buněk pomocí RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko) a kvantifikována pomocí BioSpec-nano spektrofotometru (Shimadzu Inc., Kyoto, Japonsko). Následně byl 1 ug RNA převeden na cDNA pomocí FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics, Düren, Německo). K provedení kvantitativních real-time PCR analýz byly použity 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonsko) a PikoRealTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Specifické primery pro studované lidské geny byly takové, jaké byly popsány dříve [42]. Jako normalizátor byl použit gen HMBS.

2.7. Imunoblotovací analýza a měření aktivity proteazomu a katepsinů

Imunoblotovací studie byly provedeny, jak bylo popsáno dříve [43]. Primární a sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou byly aplikovány po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a imunobloty byly vyvinuty pomocí vylepšené chemiluminiscenční reagenční soupravy (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Kvantifikace imunoblotů byla provedena skenovací denzitometrií a softwarem ImageJ [44].

Enzymatické aktivity proteazomu a katepsinů v buňkách nebo tkáních much byly měřeny na systému VersaFluor™ Fluorometer System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) pomocí Suc-LLVY-AMC (aktivita podobná chymotrypsinu, CT-L) a Z-FR-AMC fluoropeptidy (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), jak bylo popsáno dříve [42,45,46]. 6-bromoindirubin-30 -oxim (6BIO) byl použit jako pozitivní kontrola, protože je známo, že aktivuje UPP jak v lidských buňkách, tak v mouchách Drosophila [42,47]; lék Rapamycin, byl použit jako pozitivní kontrola pro indukci ALP a katepsinů [48].

2.8. Použité protilátky

Primární protilátky proti proteazomové podjednotce 5 (sc-55009), NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) a GAPDH (sc{12}}), stejně jako sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou, byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Primární protilátky proti 53BP1 (4937), fosfo-histon H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) a fosfor-p53Ser15 (9286) byly získány od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Protilátka proti SQSTM1/p62 (BML-PW9860) byla zakoupena od Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Statistické analýzy

Experimenty byly prováděny alespoň v duplikátech. Pro statistické analýzy byl použit MS Excel. Statistická významnost byla hodnocena pomocí Studentova t-testu (t-test). Datové body odpovídají průměru nezávislých experimentů a chybové úsečky označují standardní odchylku (SD); významnost při p < 0.05 nebo p < 0,01 je v grafech označeno jednou nebo dvěma hvězdičkami.

3. Výsledky

3.1. Identifikace aktinomycetu spojeného s měkkým korálem S. Levinson

Cílený mikrobiální kmen byl izolován z korálu S. Levinson, což je měkký korálový endemit v Rudém moři. Kolonie tohoto korálu se typicky nacházejí v hlubokých lokalitách, a to jak v ekosystémech horních mezofotických korálových útesů (30–60 m), tak v ekosystémech spodních mezofotických korálových útesů (60–105 m) [49]. Navíc se jedná o měkký korál azooxanthelátový, který své energetické nároky získává filtrací, a proto se vyskytuje na stanovištích vystavených silným vodním proudům.

Z fylogenetické analýzy založené na sekvenci 16S rRNA bylo zjištěno, že izolát TM223-S2 patří do rodu Salinispora (obrázek 1).

Protože S. arenicola lze odlišit od S. Pacifica a S. tropica na základě sekvence 16S rRNA [50], pojmenovali jsme tento izolát S. arenicola TM223-S2 s přírůstkovým číslem Genbank MW446171. Kmen byl kultivován, jak je uvedeno v části Materiály a metody, a extrahován ethylacetátem a methanolem. Předběžný biologický průzkum ukázal, že extrakt z kapalné kultury SA223-S2BAE a ethylacetátový extrakt z pevné kultury SA223-S2LAE nevykazovaly žádnou významnou biologickou aktivitu (obrázek S1). Proto byl v této studii použit pouze methanolový extrakt z pevné kultury spojený s extrakcí na pevné fázi, SA223-S2BM.

3.2. Extrakt SA223-S2BM nevykazuje žádnou toxicitu v lidských buňkách a aktivuje klíčové složky PN

Nejprve jsme zkoumali účinek SA223-S2BM na životaschopnost normálních kožních fibroblastů BJ a keratinocytů HaCaT imortalizovaných člověkem pomocí testu toxicity MTT. Za tímto účelem byly buňky inkubovány po dobu 24 hodin se zvyšujícími se koncentracemi extraktu a jak je znázorněno na obrázku 2A1, A2, extrakt nevykazuje cytotoxický účinek na žádnou ze dvou zkoumaných buněčných linií v koncentracích až 10 ug/ml ; při vyšších koncentracích (nad 10 µg/ml) extrakt snižuje životaschopnost buněk převážně v buňkách HaCaT.

Poté jsme studovali vliv extraktu na buněčné dráhy, které zajišťují proteomovou stabilitu buňky. Pozorovali jsme, že krátkodobá (24 h) expozice fibroblastů BJ studovanému extraktu významně indukovala expresi genu proteazomu PSMB7 (v koncentraci 10 µg/ml), zatímco paralelně měla tendenci zvyšovat expresi Gen PSMB6 ve stejné koncentraci (obrázek 2B1). Kromě toho extrakt indukoval expresi genu proteazomu 20S, PSMB6, a genu proteazomu 19S, RPN11 v koncentraci 1 ug/ml v buňkách HaCaT (obrázek 2B2). Kromě toho ošetření fibroblastů BJ extraktem po dobu 24 hodin vedlo k mírné indukci úrovní exprese proteazomové podjednotky 20S 5 v koncentraci 1 ug/ml (obrázek 2C). Na podporu našich zjištění expozice extraktu významně zvýšila aktivitu proteazomu podobného chymotrypsinu jak ve fibroblastech BJ, tak v keratinocytech HaCaT po 24 hodinách inkubace (obrázek 2D1, D2); rozdílné výsledky zkoumaných koncentrací extraktu mezi BJ a HaCaT buňkami lze přičíst na buněčný typ specifických účinků.

Kromě toho analýzy exprese Q-RT-PCR odhalily, že ošetření fibroblastů BJ extraktem po dobu 24 hodin indukovalo hladiny exprese genů souvisejících s ALP, pojmenovaných CTSB, CTSL, CTSD a SQSTM1, v koncentraci 10 µg/ml ( Obrázek 3A1). Dále jsme pozorovali, že expozice HaCaT buněk extraktu po dobu 24 hodin vedla k indukci úrovní exprese genů zapojených do funkčnosti ALP (CTSB, CTSL, CTSD a SQSTM1) (obrázek 3A2).

V souladu s těmito zjištěními jsme zaznamenali upregulaci proteinů souvisejících s autofagií BECN1 a SQSTM1/p62 po expozici fibroblastů BJ extraktu v koncentraci 1 ug/ml (obrázek 3B1); zvýšené hladiny exprese proteinů BECN1 a SQSTM1/p62 byly také pozorovány v keratinocytech HaCaT v obou studovaných koncentracích (obrázek 3B2). V souladu s tím jsme zjistili, že extrakt zvyšuje enzymatickou aktivitu lysozomálních katepsinů v buňkách BJ i HaCaT (obrázek 3C1, C2); opět lze rozdílné výsledky zkoumaných koncentrací extraktu mezi BJ a HaCaT buňkami připsat účinkům specifickým pro buněčný typ.

Dále jsme zkoumali účinek extraktu na hladiny exprese klíčových molekulárních chaperonů. Imunoblotovací analýzy tedy odhalily, že extrakt indukoval hladiny exprese molekulárních chaperonů CLU (v obou studovaných koncentracích) v BJ buňkách (obrázek 3D1), stejně jako HSP27 (1 µg/ml) a HSP70 (v obou studovaných koncentracích). v buňkách HaCaT (obrázek 3D2).

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】