Je asociace vzácného polymorfismu genu IFIH1 Rs35667974 s autoimunitními chorobami případem epigenetiky RNA?

vizualizace – AA, AP a EEE, dohled – EEE a získávání finančních prostředků – EEE. Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ním. Abstraktní

Interferon indukovaný genem pro protein 1 obsahující doménu helikázy C (IFIH1) kóduje cytoplazmatickou helikázu RNA jinak známou jako melanomová diferenciační 5 (MDA5), helikázu RNA podobnou RIG-1-, která rozpoznává virovou RNA a podílí se na vrozené imunitu díky rozpoznání virové RNA. Po navázání na dvouřetězcovou (ds) RNA, MDA5 tvoří vláknitou sestavu podél délky dsRNA a využívá molekulární podpisy k rozlišení sebe sama od sebe na základě délky dsRNA a methylace. Jeho missense varianta rs35667974 chrání proti diabetu 1. typu, psoriáze a psoriatické artritidě, ale bylo také zjištěno, že je spojena se zvýšeným rizikem ankylozující spondylitidy, Crohnovy choroby a ulcerózní kolitidy. Abychom získali vhled do komplexní role této varianty, provedli jsme strukturní analýzu MDA5 v komplexu s dsRNA pomocí simulací molekulární dynamiky.

Naše data naznačují, že zatímco mutace Ile923Val varianty rs35667974 významně neovlivňuje vazbu na nativní dsRNA, vykazuje destabilizační účinek v přítomnosti methylace 2'-O uridinu. Přítomnost 2'-O-methylace na dsRNA tedy zavádí snímací signaturu, která vede k selektivní redukci celkové katalytické aktivity MDA. Tato studie představuje hodnocení úlohy sdílené varianty rs35667974 autoimunitního lokusu IFIH1, o které se uvádí, že vede k selektivně snížené katalytické aktivitě modifikovaného fenotypu MDA5 a v důsledku toho ke snížení negativní zpětné vazby na cytokinovou a chemokinovou signalizaci a selektivní ochraně proti autoimunitě .

Doména helikázy C je důležitý enzymový protein, který dokáže rozvinout strukturu dvoušroubovice DNA. Může pomoci DNA dokončit správnou replikaci, editaci a dodání v procesu replikace, opravy a transkripce buněk a je jedním z klíčů k normální funkci buněk. Imunita je přitom velmi důležitým obranným mechanismem v lidském těle, který nás dokáže účinně chránit před patogeny, jako jsou bakterie a viry.

Studie ukázaly, že doména helikázy C hraje důležitou roli v imunitě. Za prvé, doména helikázy C může zajistit stabilitu a účinnost kódování genů tím, že napomáhá normální replikaci, opravě a transkripci buněčné DNA, čímž zlepšuje imunitu lidského těla. Za druhé, doména helikázy C může podporovat rozpoznávání molekul proteinové heterogenity buňkami a regulovat přenos signálu imunitního systému, čímž podporuje obrannou funkci těla. Obě výše uvedené dvě metody sehrály pozitivní roli v podpoře udržení a posílení imunity.

Kromě toho nám hloubkové studium vztahu mezi doménou helikázy C a imunitou také poskytuje důležitou inspiraci k objevování nových léků pro léčbu rakoviny a onemocnění souvisejících s imunitou. Vývoj léků a genová terapie zaměřená na doménu helikázy C může zlepšit odolnost těla vůči rakovině a dalším onemocněním souvisejícím s imunitou a pomoci pacientům lépe se vyrovnat s léčbou a zotavením souvisejících onemocnění.

Suma sumárum, vztah mezi doménou helikázy C a imunitou je velmi úzký a hraje zásadní roli při zajišťování genové stability, podpoře buněčné imunity a podpoře obranyschopnosti organismu. Doufáme, že pomocí příslušných výzkumných a léčebných metod dokážeme lépe udržet a posílit lidskou imunitu a vytvořit pro nás zdravější a lepší život. Z tohoto pohledu musíme posílit osobní imunitu. Cistanche má významný vliv na zlepšení imunity, protože masová pasta je bohatá na různé antioxidační látky, jako je vitamín C, vitamín C, karotenoidy atd. Tyto složky dokážou vychytávat volné radikály a snižovat oxidační stres. Stimulovat a zlepšovat odolnost imunitního systému.

Click cistanche tubulosa výhody

Klíčová slova

Jednonukleotidový polymorfismus (SNP) · Molekulární model · Interferon indukovaný helikázou C doménou 1 (IFIH1) · S diferenciací melanomu 5 (MDA5) · RNA methylace.

Úvod

Geny a mechanismy podílející se na autoimunitních onemocněních, která postihují přibližně 5 procent populace, zůstávají stále v nedohlednu, ale hromadící se údaje silně naznačují, že různá autoimunitní onemocnění mohou sdílet společné genetické pozadí, což poukazuje na existenci variant, které sdílejí různá autoimunitní onemocnění. (Zhernakova et al. 2009). Pokus o rozluštění této genetické informace do biologicky smysluplných mechanismů vedoucích k nemocem se týká identifikace kauzálních genů. Identifikace variant způsobujících onemocnění je obtížným, ale nezbytným úkolem ve snaze vytvořit účinné metody pro predikci, prevenci a intervenci onemocnění (Biros et al. 2005).

Různé typy molekul RNA se podílejí na regulaci několika biologických procesů, včetně messenger RNA (mRNA), transferové RNA (tRNA), ribozomální RNA (rRNA), mikroRNA (miRNA) a dlouhé nekódující RNA (lncRNA). Molekuly RNA obsahují četné (více než 150) chemických modifikací (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Tyto modifikace jsou funkčně spojeny se všemi fázemi metabolismu RNA, jako je struktura, stabilita a interakce, a hrají kritickou roli v několika biologických procesech, jako je modulace replikace virů a antivirové imunitní odpovědi (Machnicka et al. 2013). Mezi nimi patří methylace ribózy mezi nejvšudypřítomnější modifikace nalezené v RNA. 2'-O-methyluridin se nachází v rRNA, snRNA, snoRNA a tRNA Archaea, Bacteria a Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). Ribóza-2′-Omethylace zvyšuje hydrofobnost nukleotidů a chrání je před působením nukleáz (Yildirim et al. 2014).
Hromadné důkazy naznačují, že 2′-O-methylace virové RNA (2′OMe-RNA) hraje důležitou roli při vyhýbání se buněčným vrozeným imunitním reakcím v hostitelských buňkách (Dimitrova et al. 2019). Züst a kolegové prokázali, že 2′OMe virové RNA přispěla k vyhýbání se antivirové odpovědi zprostředkované interferonem (IFN), čímž podpořila replikaci viru (Züst et al. 2011). Vitali a Scadden také navrhli, že IU-dsDNA potlačuje MDA5 IFN stimulační dráhu (Vitali a Scadden 2010).

Interferon indukovaný genem helikázy C domény 1 (IFIH1) kóduje cytoplazmatickou helikázu RNA také známou jako MDA5 (melanomový diferenciační protein 5) a je to receptor podobný RIG-I (RLR), který plní antivirovou funkci v přirozené imunitě. detekcí virových RNA. MDA5 rozpoznává 0,5–1 kb duplexní kmenovou strukturu RNA, která se obvykle tvoří během replikace pikornaviru, a zprostředkovává imunitní odpověď na virovou infekci (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5 po detekci dlouhých virových dvouřetězcových RNA (dsRNA), generovaných během replikace pikornavirů, aktivuje signální dráhu interferonu typu I. Studie ukázaly, že MDA5 tvoří vlákno podél délky dsRNA a využívá dynamiku vlákna závislou na ATP k rozlišení mezi vlastním a jiným na základě délky dsRNA (Toro et al. 2015). Ukázalo se, že MDA5 se podílí na modulaci přeslechů mezi buňkami a vrozeným/adaptivním imunitním systémem prostřednictvím lokální produkce cytokinů a chemokinů.

Změny v expresi a/nebo aktivitě MDA5 mohou vyvolat reakce buněk na dsRNA, vedlejší produkt replikace viru (Colli et al. 2010). Bylo také ukázáno, že mutace zbytků spojených s tvorbou vlákna má za následek ztrátu tvorby vlákna a MDA5-závislou signalizaci, s výjimkou páru mutací, které mírně zesilují signalizaci. Tyto výsledky naznačují, že mechanismy nezávislé na ATP, tj. těsnější vazba RNA a/nebo stabilnější interakce protein-protein, jsou pravděpodobně zodpovědné za pozorovanou stabilitu tvorby filamentu MDA5 in vitro a za vyšší signalizační aktivitu v buňkách (Sohn a Hur 2016).

Smyth a kol. (2006) a Nejentsev et al. (2009) popsali vzácnou alelu genu IFIH1, která poskytuje ochranu před diabetem 1. typu (T1D). Tento jednonukleotidový polymorfismus rs35667974 IFIH1 (SNP), kde se konzervovaný isoleucin (kodon [ATT]) na pozici #923 mění na valin (kodon [GTT]), je vzácnou variantou, protože frekvence minoritních alel (MAF) je C {{ 9}}.010031 (2655 jedinců v celkovém vzorku 264690) na základě TOPMED (Taliun et al. 2021) a C = 0.016267 (3343 jedinců v celkovém vzorku 205514) na základě ALFA (Phan et al. al. 2020; Sherry et al. 2001). V tabulce 1 je uvedena lidská biogeografie frekvence polymorfismu v různých kontinentálních regionech na základě dat projektu ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Následné studie potvrdily, že tato vzácná alela měla stejný účinek na T1D, psoriázu (PS) (Li et al. 2010) a psoriatickou artritidu (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Tento SNP byl naopak spojován jako rizikový faktor pro náchylnost rozvoje ankylozující spondylitidy (AS) (Ellinghaus et al. 2016), Crohnovy choroby (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 a ulcerózní kolitida (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov a kol. (2010) prokázali, že mutace se ztrátou funkce E627X a I923V MDA5 jsou spojeny s nižší produkcí poly(I:C)-indukovaného interferonu v mononukleárních buňkách periferní krve pacientů s diabetem 1. typu, a proto mají ochranu proti T1D. Rovněž se uvádí, že v molekule MDA5 se substituce aminokyseliny I923V nachází v blízkosti zbytku H927, což přispívá k vazbě dsRNA (Yoneyama a Fujita 2008). Ukázalo se však, že varianta MDA I923V má normální schopnost vázat dsRNA, ale 25-krát sníženou katalytickou aktivitu (Shigemoto et al. 2009). Zdá se tedy, že tento polymorfismus neovlivňuje zásadním způsobem vlastnosti této cytoplazmatické helikázy snímající RNA vázající nukleotidovou kyselinu, ale mění její funkci dosud neznámým mechanismem.

Byl nalezen vztah mezi polymorfizmem IFHI1 a incidencí enterovirové infekce u T1D a souvislostí mezi variantou MDA5 I923V a frekvencí enterovirové RNA u pacientů s T1D (Looney et al. 2015). Nedávné studie na myších MDA5- a MAVSknockout navíc ukázaly kritickou roli těchto proteinů při zprostředkování reakcí interferonu typu 1 proti viru Coxsackie B (Wang et al. 2010). Ukázalo se, že vedoucí protein mengoviru brání expresi IFN- tím, že blokuje dimerizaci IRF3 potřebnou pro aktivaci tohoto faktoru (Hato et al. 2007). Toto pozorování naznačuje, že varianty, které narušují funkci IFIH1 v antivirové odpovědi hostitele, byly vybrány spíše negativně než pozitivně, protože poskytují ochranu před T1D (Crow 2011).

Chow a kol. (2018) rozsáhle analyzovali mimo jiné receptory podobné RIG-I, zatímco Brisse a Ly (2019) rozsáhle zhodnotili evoluci a speciaci MDA5 a související RIG-I. Umístění změněných zbytků v nebo v blízkosti vazebných míst RNA a ATP nebo rozhraní vlákna nás vedlo k hypotéze, že pozorované mutace mohou zvýšit stabilitu vlákna IFIH1 zvýšením vnitřní afinity mezi IFIH1 a dsRNA nebo mezi IFIH1 molekul ve filamentu nebo snížením účinnosti hydrolýzy ATP a tím i rychlosti rozkládání filamentu (Rice et al. 2014).

Tato práce představuje strukturální studii potenciální role sdílené varianty rs35667974 autoimunitního lokusu IFIH1, o které se uvádí, že vede k inhibovanému funkčnímu fenotypu kódujícímu substituci aminokyseliny Ile923Val v proteinovém produktu genu IFIH1 MDA5. Posledně jmenovaný je biologicky pravděpodobný kauzální kandidátní gen sdílený mezi několika chorobami, ovlivňující kontrolu lokální exprese cytokinů a chemokinů, které chrání před autoimunitou (Colli et al. 2010). Tato práce si klade za cíl prozkoumat neznámý nehybný mechanismus, kterým substituce Ile923Val snižuje katalytickou aktivitu lidského MDA5. V této studii jsme zkoumali rozdíly v interakci MDA5 s dsRNA mezi nativní a vzácnou variantou Ile923Val při iniciaci zánětlivého mechanismu. V souladu s tím jsme se zaměřili na zkoumání dynamického chování lidského komplexu MDA5/dsRNA ve vodném prostředí v přítomnosti Ile923 nebo Val923, když je uracil 2'-O methylován nebo ne. Tato strukturální analýza vzácné sdílené genetické náchylnosti nebo ochranných lokusů může poskytnout pohled na naše chápání patofyziologie autoimunitních onemocnění a výsledky výzkumu mohou ovlivnit lepší léčbu studovaných onemocnění.

Materiály a metody

Vyhledávání sekvencí, konstrukce fylogenetického stromu a analýza pozitivního výběru

Proteinová sekvence Homo sapiens (ID sekvence: NP_071451.2) byla získána z databáze UniProt (The UniProt Consortium 2021). K nalezení homologů napříč druhy byly provedeny BLAST vyhledávání pomocí Mega BLAST (Národní centrum pro biotechnologické informace, NCBI, Bethesda, MD, USA) v databázi proteinů RefSeq a NR (a PDB a UniProt) pomocí Blastp (protein–protein BLAST) s výchozí parametry (Altschul et al. 1997). Původně bylo vybráno 1000 homologů k lidským proteinům MDA5 a k identifikaci této variace u jiných druhů byla použita mezidruhová selekce zaměřená na C-terminální doménu obsahující sekvenci kolem lidské substituce I923V. Clustal Omega, program pro vícenásobné zarovnání sekvencí (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) a server pro vícenásobné zarovnání sekvencí T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) byly použity k provedení srovnání proteinových sekvencí. a bioinformatický software platformy Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) pro selektivní vizualizaci více zarovnání.

Evoluční analýza se používá k identifikaci pozic na proteinových sekvencích, které jsou silně konzervované napříč druhy, což ukazuje na strukturální význam (Andreou et al. 2018). Fylogenetický strom byl konstruován pomocí metody Maximum Likelihood (Nei a Kumar 2000) a modelu Tamura–Nei (Tamura a Nei 1993) s 500 bootstrap replikáty (Felsenstein 1985). Počáteční strom(y) pro heuristické vyhledávání byly získány automaticky aplikací algoritmů Neighbor-Join a BioNJ na matici párových vzdáleností odhadnutých pomocí modelu Tamura–Nei a poté výběrem topologie s vyšší log-pravděpodobností. Fylogenetická analýza zahrnovala 52 homologních nukleotidových sekvencí (39 ortologů a 13 paralogů) lidského genu IFIH1. Zahrnuté kodonové pozice byly 1. plus 2. plus 3. plus nekódující. V konečném datovém souboru bylo celkem 3729 pozic. Evoluční analýzy byly provedeny pomocí softwarového balíku MEGA11 (Tamura et al. 2021).

Ke zjištění, zda se gen IFIH1 adaptivně vyvinul, jsme použili program codeml v softwarovém balíku PAML v4.9j (Yang 2007). Nukleotidová sekvence a odpovídající soubor pro zarovnání proteinové sekvence byly předloženy PAL2NAL (Suyama et al. 2006), aby se vytvořily vhodné soubory pro zarovnání vstupních nukleotidů CODEML. Analýzy pozitivní selekce pro ortologické geny MDA5 byly provedeny pomocí modelů místa a místa větvení (Yang et al. 2005; Yang a Bielawski 2000). Poměr rychlosti nesynonymní/synonymní substituce (ω=dN/dS) poskytuje míru selektivního tlaku na úrovni aminokyselin. Velikost hodnoty dN/dS (ω) představuje typy výběru: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 pro pozitivní výběr (Yang et al. 2005). V CODEML byly pro provedení analýzy pozitivního výběru vybrány modely lokality (M0, M1, M2, M3, M7 a M8) a modely pobočky (Clades A a C) (Bielawski a Yang 2004; Yang a Nielsen 2002). V modelech lokality byl test poměru pravděpodobnosti (LRT) použit k testování pozitivního výběru porovnáním tří párů modelů (M0/M3, M2/M1 a M7/M8). Analýza byla provedena jak pro sekvenci plné délky, tak pro sekvenci C-terminální domény (CTD).

Strukturální analýza a molekulární dynamické simulace

Kryoelektronová mikroskopická (kryo-EM) struktura vlákna hMDA5–dsRNA v přítomnosti ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) byla použita jako modelový systém pro molekulární dynamiku ( MD) simulace. Všechny proteinové zbytky byly vyřešeny (307–1020), 14 párů bází dvouvláknové RNA (dsRNA) a koordinovaný zinek byly zachovány, zatímco chybějící zbytky byly modelovány pomocí serveru SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). Parametry silového pole a atomy vodíku byly přidány pomocí modulu XLEaP z AMBER 18 (Case et al. 2005). Pro protein byla použita silová pole AMBER f14SB (Maier et al. 2015) a f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) s parametry modrna08 (Aduri et al. 2007) pro modifikované nukleosidy. Mutace I923V byla zavedena do MDA5 manuálním odstraněním C8 methylové skupiny I923, zatímco modifikovaná ribóza U12 byla methylována na 2'-0 pomocí zbytku MRU knihovny modrna08. Zinkový iont byl navázán se 4 cysteinovými zbytky 907, 910, 962 a 964 za použití vhodných parametrů silového pole k udržení tetraedrické koordinační sféry (délky vazby Zn–S 2,35 Á s 50 kcal·mol–1·Å–2 silové konstanty a úhly S–Zn–S 109,5 stupně s 25 kcal·mol–1·rad–2).

Tímto způsobem jsme pro MD simulace připravili 4 systémy: (i) nativní MDA5–dsRNA, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2′OMe) a (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Všechny systémy byly solvatovány ve zkrácených oktaedrických rozpouštědlových boxech předem ekvilibrovaných molekul vody TIP3P s minimálním pufrem 10 Á kolem komplexu a poté byl přidán požadovaný počet protiiontů, aby se dosáhlo neutralizace náboje systémů. Simulace MD byly provedeny s GPU akcelerovanou verzí modulu PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013) v AMBER 18 a časovým krokem 2 fs. Teplota byla regulována pomocí Langevinova termostatu s frekvencí kolize 1,0 ps–1, tlak byl regulován pomocí barostatu Berendsen s dobou relaxace tlaku 1,0 ps. SHAKE byl použit k omezení vazeb zahrnujících atomy vodíku s tolerancí 10–6 Á, zatímco nevázané interakce byly vypočteny s přímým prostorovým limitem 10 Å.

Minimalizace energie byla zpočátku provedena pro 1{{20}}},000 kroky s polohovým omezením 100 kcal·mol–1·Å–2 silové konstanty na nevodíkových atomech MDA5–dsRNA. Rozpouštědlo bylo poté ekvilibrováno při 300 K a 1 atm prostřednictvím krátkých kol simulací v souborech NVT a NPT, 100 ps a 400 ps, ​​v daném pořadí, při zachování omezení na nevodíkové atomy rozpuštěné látky. Následně byla provedena minimalizace energie po 10,000 kroků, ale s pozičním omezením 10 kcal·mol–1·Å–2 pouze na atomech C MDA5 a fosfátové páteři dsRNA. U 3 sub byly postupně relaxovány (10,0, 1,0, 0,1 kcal·mol–1·Å–2) po dobu 1 ns, následovalo 9 ns neomezené ekvilibrace za konstantního tlaku. Po těchto počátečních 10 ns ekvilibrace (nepoužito v analýze) bylo provedeno 100 ns produkčních simulací v souboru NPT pro každý systém při 300 K a 1 atm, při ukládání snímků systému každých 5,0 ps pro analýzu pomocí CPPTRAJ modul AMBER 18 (Roe a Cheatham 2013). Všechny obrázky zobrazující 3D modely byly vytvořeny pomocí systému molekulární grafiky PyMOL (v.2.3 open-source build).

Výsledek

Fylogenetická analýza Ile923Val substituce MDA5

Evoluci a speciaci MDA5 a související RIG-I rozsáhle přezkoumávají (Brisse a Ly 2019). Zde byla evoluce IFIH1 použita k definování konzervačních prvků v sekvenci MDA5 o konkrétním polymorfismu. Evoluční analýza odhalila konzervaci těžké sekvence mezi MDA5 různých druhů (984 z 1000 zkoumaných sekvencí má isoleucin v ekvivalentní poloze hMDA #923) v doméně RD/CTD, což ukazuje na strukturní/funkční význam. Polymorfismus rs35667974 v exonu 14 lidského genu způsobuje konzervovanou mutaci aminokyseliny na pozici 923 z Ile na Val v hMDA5. Existuje však dalších šestnáct vzdálených druhů, které mají stejnou pozici obsazenou valinem (obr. 1), což ukazuje na životaschopnost této změny napříč druhy v RD/CTD doméně MDA5 a blízce homologní RS/GY doméně izoforem X1, helikázy X3 a DHX58 (obr. 2). Kromě toho sekvenční uspořádání oblasti kolem pozice hMDA #923 (interakční smyčka MDAs CTD) odhaluje střední až vysoce konzervovanou sekvenci mezi vzdálenými druhy, což ukazuje na funkční význam oblasti napříč druhy.

Detekce pozitivního výběru

K detekci, zda se gen IFIH1 vyvinul adaptivně modely místa a modely místa větvení, byly použity k provedení pozitivní selekční analýzy ortologů celého genu a CTD domény. V modelech místa nebyla identifikována žádná pozitivní selekční místa pro doménu CTD (tabulka 2). M0 implikuje konstantní rychlost vývoje (ω=dN/dS=0.2) (tabulka 2). Některá místa, která prošla pozitivní selekcí, byla identifikována pomocí metody modelů M2- a M8-místních modelů pro celý gen (Suppl. Table 1), i když ne v oblastech interagujících s RNA a doméně CTD. V modelech místa je ω (dN/ dS).<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Konkrétně u modelu pobočky C pro doménu CTD (Dodací tabulka 3) se 33 procent webů vyvíjí v kategorii ω0=0. 036. Protože lokality vyvíjející se v této kategorii nerozlišují mezi typy poboček, mají oba typy poboček stejnou hodnotu ω pro lokality spadající do této kategorie. Navíc 55 procent lokalit se vyvíjí v kategorii ω2. Přesto mají hodnoty ω, které jsou podmíněny typem větve (ω20=0.25 a ω21=0). Také pro model C větvení pro 39 ortologických genů MDA5 (Suppl. Tabulka 4) se 33 procent míst vyvíjí v kategorii ω0=0. 027. Na druhou stranu 41 procent lokalit se vyvíjí v kategorii ω2. Přesto mají hodnoty ω, které jsou podmíněny typem větve (ω20=0.25 a ω21=15.32).

Strukturální analýza

Provedená evoluční analýza ukazuje, že substituce Ile923Val není u lidského druhu jedinečnou variantou, protože Val existuje v pozici sekvence MDA5 i u jiných druhů. MDA5 je virový receptor dvouvláknové RNA (dsRNA), který hraje klíčovou roli v antivirové imunitě díky své výrazné specifitě pro virovou RNA (Wu et al. 20}13). Bylo ukázáno, že 2'-O-methylace virové mRNA je důležitá pro vrozené imunitní reakce, a proto bylo navrženo, že 2'-O-methylace je molekulárním podpisem pro rozlišení vlastní mRNA od nevlastní mRNA. (Zust et al. 2011). Abychom prozkoumali potenciální roli substituce Ile923Val ve variantě Missense IFIH1 rs35667974, analyzovali jsme kryoelektronovou mikroskopickou (kryo-EM) strukturu vlákna MDA5–dsRNA v přítomnosti ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Pozice 923 se nachází na smyčce 921–927, která přímo interaguje s dsRNA (obr. 3A). Konkrétně Ile923 se nachází 4,8 Á od 2'-ΟΗ uridinu U12 a jejich interakce je stabilizována prostřednictvím vodíkové vazby mezi sousední His927 a uracilovou bází. Neočekává se, že substituce Ile923 Val ve variantě rs35667974 zavede nějaké sterické střety, spíše než minimalizuje interakce s 2'-ΟΗ uridinu U12 (obr. 3B). V případě, že je RNA methylována na ribóze U12, pak přírodní varianta MDA5 s Ile923 vykazuje příznivý van der Waalsův kontakt s 2'-OMe skupinou U12 při 3,6 Á (obr. 3C), zatímco Val923 varianty rs35667974 je umístěný na 5,0 Á (obr. 3D). Tyto rozdíly nemohou naznačovat hlavní účinek substituce Ile923Val jako takové; jemné strukturální změny však často vedou k významným funkčním změnám prostřednictvím narušení strukturální dynamiky systému.

Výpočty molekulární dynamiky

Ke zkoumání účinku mutace I923V MDA5 na její interakci s dsRNA, nativní i 2'-Ο-methylovanou, jsme použili simulace molekulární dynamiky 4 systémů v časovém měřítku 100-ns. Dynamika systémů byla monitorována pomocí efektivních fluktuací (RMSF) každého proteinového zbytku a vzdálenosti vodíkové vazby H927 s U12 (obr. 4). Naše výpočty naznačují, že mutace I923 na V923 v MDA5 vedla k menším poruchám dynamiky v kontaktní oblasti RNA (zbytky 923-934) a interproteinové interakční smyčce (950-955) komplexu s nativní dsRNA (obr. 4C) . Toto pozorování bylo podobné v případě 2'-O-methylace v U12, i když výraznější účinek byl pozorován v celkové dynamice karboxy-terminální oblasti mutantu MDA5 V923 (obr. 4D).

Nyní s ohledem na klíčovou interakci vodíkových vazeb sousedního zbytku H927 s uracilovou bází naše simulace MD naznačují, že methylace na 2'-0 ji neovlivňuje v nativním MDA5 (obr. 4E). Mutace V923 však neovlivňuje vodíkovou vazbu H927 v nativní dsRNA, ale vykazuje destabilizační účinek v přítomnosti 2'-O-methylace (obr. 4F). Celkově vzato, naše MD simulace naznačují, že ačkoli účinek mutace I923V MDA5 v interakci s nativní dsRNA je marginální, jeho účinek na dynamiku a stabilitu komplexu MDA5/RNA je významnější, když je uracil 2'-O-methylován .

Diskuse

Tato studie představuje evoluční a strukturální zkoumání role sdílené varianty rs35667974 autoimunitního lokusu IFIH1, o které se uvádí, že vede k modifikovanému funkčnímu fenotypu pro MDA5 (Downes et al. 2010). Použití modelů evolučních míst a rozvětvených míst k provedení analýzy pozitivní selekce ukazuje, že v místech interakce RNA, kde sídlí polymorfismus rs35667974, nejsou žádná místa pozitivní selekce. Ani modely větvení nenaznačují, že nějaká konkrétní místa prošla pozitivní selekcí v CTD doméně.

To je v souladu s velmi nízkými frekvencemi výskytu varianty Ile923Val i mezi lidskou populací (tabulka 1). Přesto má evropská populace ve srovnání s ostatními rozdíl ve frekvenci alely C o jeden řád. Aniž bychom přehlíželi malou velikost vzorku, geografické rozložení zkoumaného polymorfismu ukazuje, že jeho výskyt v evropské populaci jako výchozí bod může být způsoben životními podmínkami a výživou, které se v posledních letech změnily. Strukturální zkoumání role zkoumaného SNP bylo provedeno zkoumáním struktury komplexu dsRNA–MDA5 (nativní a mutantní).

Na úrovni tvorby komplexu dsRNA–MDA5 ovlivňuje zavedení mutace Ile923Val interakci proteinové C-terminální domény (CTD) s dsRNA se zavedením hydrofobní dutiny vedle ribózového cukru jednoho vlákna dsRNA. . Ukázali jsme, že v případě methylované RNA na fosforibosylovém řetězci jednoho řetězce mohou další dynamické efekty ovlivnit interakci mutantu, aniž by ovlivnily divoký typ. To je v souladu s experimentálními studiemi (Looney et al. 2015; Brisse a Ly 2019), které ukazují, že účinek polymorfismu Ile923Val identifikovaného v blízkosti bodu interakce MDA5–dsDNA nemusí ovlivnit nativní vazebné vlastnosti dsRNA, ale může být změněn 2.{10}}násobné snížení katalytické aktivity (Shigemoto et al. 2009). Studie molekulární dynamiky také ukázaly kritickou roli methylace v mutantu, pokud jde o mobilitu a stabilitu smyček MDA5 941–959 a 970–977 zapojených do interakce dsRNA a interproteinové interakce při tvorbě MDA filament. Takové účinky mohou bránit sestavení vlákna MDA5, sdružení MDA5–MAVS a sestavení vlákna MAVS, které dále aktivuje expresi genů pro interferon typu I (IFN1: IFN a IFN ). V případě T1D a PsA v důsledku snížené hladiny aktivity proteinu MDA5 a tím nižší produkce IFN chrání před autoimunitou. Tato pozorování naznačují, že několik variant IFIH1, u nichž se předpokládá, že ovlivní interakci MDA5 s MAVS a snížení produkce IFN, sníží riziko onemocnění, zatímco normální funkce MDA5 je s nimi spojena (Shigemoto et al. 2009).

To vede k závěru, že stejně jako v případě virové RNA je methylace self-dsRNA, RNA-identifikovaná mutace, důležitým selekčním/aktivačním faktorem pro zavedení ochranných účinků u některých autoimunitních onemocnění. Výsledky této studie rozšiřují znalosti o biologickém významu rs35667974 SNP lokusu IFIH1 při rozvoji výše uvedených onemocnění a zdůrazňují význam studia sdílených genů u více autoimunitních onemocnění. Avšak v populačních studiích genetické asociace SNP s autoimunitními onemocněními, za použití např. PCR-RFLP, sekvenování nebo genotypizačních čipů, se případ methylace RNA nebere v úvahu. Je proto důležité znát stav methylace interagující dsRNA a její účinek na alelu MDA5. Stejně jako v případě rozpoznání virové dsRNA (Wu et al. 2013) a rozlišení mezi self-a nonself mRNA (Züst et al. 2011), ztráta methylové skupiny z interagující MDA5, jako v případě mutant Ile923Val MDA5, může ovlivnit tvorbu filamentů a indukci interferonu typu I.

Za zmínku stojí Plenge et al. (2013) již dříve diskutovali o potenciálu vzácné varianty v genu kauzálního onemocnění představovat domnělý terapeutický cíl pro farmaceutickou intervenci. Za tímto účelem musí být známa biologická funkce kauzativní varianty při jakémkoli pokusu spojit genetické nálezy s novým terapeutickým cílem. Proto se hledání polohy kauzativní varianty ve 3D struktuře příslušného proteinu a zkoumání její role ze strukturního/funkčního hlediska v patogenetické dráze vedoucí k autoimunitnímu onemocnění jeví jako klíčové pro další management a lepší léčbu. pacientů. Zůstává nejvyšší potřeba posunout se od objevu souvisejících SNP k hlubšímu pochopení příčinných variant, aby se objasnily molekulární mechanismy a cesty onemocnění. Další strukturně-funkční analýza je nutná ke zkoumání vazby ribosa-2′-Ο-methylované self-dsRNA na MDA5 a jak to ovlivňuje sestavení fibril MDA5. Nepolapitelná biologická úloha 2'-Ο-methylované mRNA jako senzoru rozlišení mezi virovou a vlastní mRNA při indukci interferonu typu I mohla být rozšířena na ochranný senzor u určitých autoimunopatií.

Závěr

Vzácný polymorfismus genu rs35667974 IFIH1 chrání před T1D, PS a PsA, zatímco alela IFIH1 nesená většinou populace predisponuje k onemocněním. Financování, že mutant Ile923Val MDA5 funguje odlišně v interakci s vlastní dsRNA a zejména s 2'-O-methylovanou, naznačuje, že v některých případech varianty interagující s methylovanou dsRNA narušují tvorbu vlákna MDA5, interakci MAVS a tvorbu vlákna a Signalizace IFN, stejně jako v antivirové odpovědi hostitele, mohla být vybrána negativně, protože poskytují ochranu před nemocemi.

Autorské příspěvky

Konceptualizace – AA, AP, EEE a GNG, metodologie – AA, AP a EEE, validace – AA, AP, MIZ, GNG a EEE, šetření – GNG, AA, AP a MIZ, zdroje – GNG, AA, AP a MIZ, správa dat – AA a AP, psaní a příprava původního návrhu – EEE, GNG, AA, AP a MZ, psaní, kontrola a editace rukopisu – AA, AP, MZ, GNG a EEE, vizualizace – AA, AP a EEE, dohled – EEE a získávání finančních prostředků – EEE. Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ním.

Financování

Financování s otevřeným přístupem poskytuje HEAL-Link Greece. Tato práce byla podpořena projektem „INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization“ (Grant MIS 5002550), který je realizován v rámci akce „Posílení výzkumné a inovační infrastruktury“, financované z Operačního programu „Konkurenceschopnost, podnikání a inovace“ (NSRR 2014–2020) a spolufinancované Řeckem a Evropskou unií (Evropský fond pro regionální rozvoj).

Dostupnost dat

Soubory dat použité a/nebo analyzované během aktuální studie jsou na vyžádání k dispozici od odpovídajícího autora.

Prohlášení

Konflikt zájmů

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů. Investoři nehráli při návrhu studie žádnou roli; při shromažďování, analýzách nebo interpretaci dat; v psaní rukopisu, nebo v rozhodnutí o zveřejnění výsledků.

Etické schválení

Nelze použít.

Souhlas s účastí

Nelze použít.

Souhlas se zveřejněním

Nelze použít.

Otevřený přístup

Tento článek je licencován podle Creative Commons Attribution 4.{1}} Mezinárodní licence, která umožňuje použití, sdílení, adaptaci, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu nebo formátu, pokud uvedete příslušné jméno původního autora (autorů) ) a zdroj, uveďte odkaz na licenci Creative Commons a uveďte, zda byly provedeny změny. Obrázky nebo jiný materiál třetích stran v tomto článku jsou zahrnuty v licenci Creative Commons k článku, pokud není uvedeno jinak v kreditní hranici k materiálu. Předpokládejme, že materiál není zahrnut v licenci Creative Commons článku a vaše zamýšlené použití není povoleno zákonnými předpisy nebo překračuje povolené použití. V takovém případě musíte získat povolení přímo od držitele autorských práv.

Reference

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) Parametry silového pole AMBER pro přirozeně se vyskytující modifikované nukleosidy v RNA. J Chem Theory Compput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA a kol. (1997) Gapped BLAST a PSI-BLAST: nová generace programů pro vyhledávání proteinových databází. Nucleic Acids Res 25:3389-3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Strukturální a evoluční poznatky v rámci genové rodiny polysacharid deacetylázy bacillus anthracis a bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Identifikace 2′-O-methyluridin nukleosidové hydrolázy pomocí metagenomických knihoven. Molekuly.

5. Berman HM, Westbrook J, Feng Z a kol. (2000) The protein databank. Nucleic Acids Res 28:235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Metoda maximální věrohodnosti pro detekci funkční divergence na jednotlivých kodonových místech s aplikací na evoluci genové rodiny.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Geny zprostředkující interakce prostředí u diabetu 1. typu.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: databáze RNA modifikačních drah. aktualizace 2017. Nucleic Acids Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Srovnávací struktura a funkční analýza RIG-I-like receptorů: RIG-I a MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Vzácná kódující alela v IFIH1 chrání před psoriatickou artritidou. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com