Iridoidní a acyklické monoterpenové glykosidy, kankanosidy L, M, N, O a P z Cistanche Tubulosa
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je vytrvalá parazitická rostlina rostoucí na kořenech druhů Salvadora nebo Calotropis, rozšířená v severní Africe, Arábii a asijských zemích.1) Stonky této rostliny (japonsky Kanka-nikujuyou) byly tradičně používá se k léčbě impotence, sterility, lumbaga a tělesné slabosti a také jako prostředek podporující krevní oběh.1,2) V průběhu našich studií o bioaktivních složkách ze stonků Cistanche tubulosa3–6) jsme již dříve informovali dvacet čtyři fenylethanoidových aminoglykosidů včetně kankanosidů H1, H2, I, J1, J2, K1 a K2 a dva acylované oligocukry z čerstvých stonků Cistanchetubulosa.5,6) Dále hlavnífenylethanoidové glykosidy,echinakosid, akteosid,a isoakteosidbylo zjištěno, že inhibují zvýšení hladin sérové aspartátaminotransferázy (sAST) a alaninaminotransferázy (sALT) v poraněných játrech myší vyvolané D-galaktosaminem (D-GalN)/lipopolysacharidem v dávkách 25–100 mg/kg per os ( po).Byly také objasněny strukturální požadavky fenylethanoidových glykosidů na hepatoprotektivní aktivitu.5) V této pokračující studii o složkách v čerstvých stoncích Cistanchetubulosa jsme dále izolovali jedenáct iridoidních glykosidů včetně kankanosidů L (1), M (2), a N (3), sedm acyklických monoterpenových glykosidů včetně kankanosidů O (4) a P(5), tři fenylpropanoidy a čtyři lignany. Tento článek se zabývá izolací a objasněním struktury pěti nových sloučenin (1–5).
Čerstvé stonky C. tubulosa (kultivované v Urumuqi, provincie Xin jiang, Čína) byly extrahovány methanolem za zpětného toku, aby se získal methanolický extrakt (8,36 procent z čerstvých stonků). Z methanolického extraktu byly frakce eluované H2O a MeOH (5,63 procenta a 2,73 procenta, v daném pořadí) získány sloupcovou chromatografií Diaion HP-20 (H2O→MeOH), jak bylo popsáno dříve.5) Frakce eluovaná MeOH byla podrobeny SiO2 a ODS kolonové chromatografii a nakonec HPLC, aby byly získány kankanosidy L (1, 0.0026 procent), M (2, 0). 27}}001 procento ), N (3, 0.00{{60}}7 procent ) , O (4, 0.0{{90}}2{{105}} procent) a P (5, {{118} }.{122}}002 procenta), 6-deoxycatalpol3,7) (6, 0,197 procent), bartsioside3,7) (7, 0.0583 procent ), glurosid3,7) (8, 0,0443 procent ), kankanoiside A3) (9, 22,3 mg, 0,0010 procent), kyselina mussaenosidová3,7) (10, 0,0056 procenta), 8- kyselina epiloganová3,8) (11, 0,0023 procenta), 8-kyselina epideoxyloganová3,7) (12, 0,0004 procenta), kyselina geniposidová3,7) (13, 0,0040 procenta), kankanosid E3) (14, 0,0026 procenta), (2E,6Z)-8-b D-glukopyranosyloxy-2,6-dimethyl-2,6-oktadienová kyselina3,9) (15, 31,0 mg, 0,0014 procenta), (2E,6E){{95 }},7-dimethyl-8-hydroxyoktadién-1-yl-ObD-glu copyranosid10) (16, 0,0082 procenta), 8-hydroxygeraniol 8-Ob-D-glukopyranoside11 ) (17, 0,0044 procenta), betulalbusid A12) (18, 0,0004 procenta), koniferin13) (19, 0,0002 procenta), syringin13) (20, 0,0015 procenta), sinapový (0,0015 procenta) aldehyd 4-2pyranopyranoside,1-glukoside 0,0001 procenta), ( )-pinoresinol ObD-glukopyranosid4,8,15) (22, 0,0010 procenta), eucommin A16) (23, 0,0002 procenta), isoeucommin A17) (24, 0,0010 procent)-resolsyD) a (ObringsyD) glukopyra noside4,8,18) (25, 0,0044 procent).
Cistanche tubulosazlepšit sexuální funkce
Struktury kankanosidů L (1), M (2) a N (3)
Kankanosid L (1) byl získán jako bílý prášek s negativní optickou rotací ([a]D26 45,7 v MeOH). Jeho IR spektrum ukázalo silný absorpční pás při 3433 a 1{{20}}}80 cm1, což naznačuje glykosidovou skupinu. Bombardování rychlými atomy (FAB)-MS 1 běhu v pozitivním a negativním iontovém módu ukázalo kvazimolekulární iontové píky při m/z 371 [M Na] a 347 [MH], v daném pořadí, a molekulární vzorec byl stanoven jako C15H24O9 měřením FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 1 s 1,0 M kyselinou chlorovodíkovou (HCl) uvolnila D-glukózu, která byla identifikována HPLC analýzou za použití optického rotačního detektoru.3—6) 'H- a 13C-NMR spektra 1 (CD3OD, tabulky 1, 2), které byly přiřazeny různými NMR experimenty,19) vykazovaly signály jako signovatelné čtyř methylenů [d 1,43 (1H, br dd, J cca. 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 (1H, br dd, J cca 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= cca 8,14 Hz, 6b-H), 3,50 ( 1H, ddd, J 2,4, 12,5, 13,0 Hz, 3a-H), 3,83 (1H, br dd, J=} cca 5,13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H každý, oba d, J 13,1 Hz, 10-H2)], dva methiny [d 2,15 (1H, dd, J 7,2, 8,9 Hz, 9-H) a 2,23 (1H, m, 5- H)] a acetalová skupina [d 4,81 (1H, d, J 8,9 Hz, 1-H)] společně s b-glukopyranosylovou skupinou [d 4,70 (d, J 7,9 Hz, 1 -} H)]. Jak je znázorněno na obr. 1, experiment 1H–1H korelační spektroskopie (1H–1H COSY) na obr. 1 ukázal přítomnost dílčích struktur napsaných tučně. V experimentu s korelací heteronukleárních vícenásobných vazeb (HMBC) na 1 byly pozorovány korelace na dlouhé vzdálenosti mezi následujícími protony a uhlíky (1-H a 3-C, 8-C; {{ 124}}H a 1-C; 7-H a 8-C, 10-C; 9-H a 8-C; {{131 }}H2 a 7-C, 8-C; 1-H a 1-C), jak je znázorněno na obr. 1. Dále byla relativní stereostruktura 1 charakterizována fázově citlivým jaderným Experiment Overhauserova zesílení spektroskopie (fázově senzitivní NOESY), který ukázal korelace NOE mezi následujícími protonovými páry (1-H a 3aH; 3a-H a 4a-H; 3b-H a 4b-H; 4b-H a 5-H, 9-H; 5- H a 6b-H, 9-H; 6a-H a 7-H; 7-H a 10-H2), jak je znázorněno na obr. 1. 1H- a 13C-NMR spektra 1 byla superponovatelná se spektry hlavní iridoidní složky 6-deoxykatalpolu (6), s výjimkou signálů způsobených na nasycenou d-laktolovou skupinu. Nakonec hydrogenace 6 poskytla 1, takže stereostruktura kankanosidu L byla objasněna jako 3,4- dihydro-6-deoxykatalpol (1).
Kankanosid M (2) byl získán jako bílý prášek s negativní optickou rotací ([a]D26 18,7 v MeOH). IR spektrum 2 ukázalo absorpční pásy při 3433, 1736, 1655 a 10}76 cm1, které lze připsat hydroxylovým, d-laktonovým, olefinovým a etherovým skupinám. FAB-MS spektrum kladných iontů 2 ukázalo kvazimolekulární iontový pík při m/z 353 [M Na] a molekulární vzorec byl stanoven jako C15H22O8 měřením kladných iontů FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 2 s 1,0 M HCl uvolnila D-glukózu. 'H- a 13C NMR spektra 2 (CD3OD, tabulky 1, 2) ukázala signály přiřaditelné čtyřem methylenům [d 1,66, 2,11 (1H každý, oba m, 4-H2), 2,15, 2,75 (1H každý m, oba m, 6-H2), 4,29 (1H, ddd, J 2,8, 8,4, 14,3 Hz, 3b-H), 4,32, 4,51 (po 1H, oba d, J 13,1 Hz, 10- H2), 4,35 (1H, ddd, J 3,1, 6,7, 14,3 Hz, 3a-H)], dva methiny [d 2,97 (1H, m, 5-H), 3,82 (1H, br s, {{ 84}}H)], olefin [d 5,94 (1H, m, 7-H)] a nasycená laktonová skupina (d C 174,9) společně s bD-glukopyranosylovou skupinou [d 4,32 (1H, d J 7,9 Hz, 1-H)]. Jak je znázorněno na obr. 1, experiment 1H–1H COZY na obrázku 2 ukázal přítomnost dílčích struktur napsaných tučně a v experimentu HMBC byly pozorovány korelace na dlouhé vzdálenosti mezi následujícími protonovými a uhlíkovými páry ({{105 }}H a 1-C; 7-H a 9-C; 9-H a 1-C, 8-C; {{112} }H2 a 7-C, 8-C, 9-C; 1-H a 10-C). Relativní stereostruktura 2 byla charakterizována fázově citlivým NOESY experimentem, který ukázal NOE korelace mezi následujícími protonovými páry (3a-H a 4a-H; 3b-H a 4b-H; 4b-H a 5- H; 5-H a 6b-H, 9-H), jak je znázorněno na obr. 1. Stereostruktura 2 byla tedy objasněna, jak je znázorněno.
Kankanosid N (3) byl izolován jako bílý prášek s negativní optickou rotací ([a]D25 24,6 v MeOH). V FAB-MS s kladným iontem 3 byl pozorován kvazimolekulární iontový pík při m/z 371 [M Na]. Molekulární vzorec C16H28O8 byl stanoven měřením FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 3 s 1,{15}} M HCl uvolňující D-glukózu. 'H- a 13C-NMR data (CD3OD, tabulky 1, 2) ukázala signály, které lze přiřadit methylu [d 1.07 (3H, d, J 7,2 Hz, 10-H3)] 4 methyleny {d 1,37, 1,87 (1H každý, oba m, 7-H2), 1,65, 1,81 (každý 1H, oba m, 6-H2), [3,65 (1H, dd, J 9,1 , 9,8 Hz), 3,90 (1H, dd, J 5,9, 9,8 Hz), 11-H2] a [3,70 (1H, dd, J 3,3, 12,0 Hz), 3,88 (1H, m), {{ 71}}H2]}, čtyři methiny [d 1,69 (1H, m, 4-H), 1,75 (1H, m, 9-H), 2,06 (1H, m, 8-) H), 2,16 (1H, m, 5-H)] a hemiacetalová skupina [d 4,67 (1H, d, J 7,4 Hz, 1-H)] společně s bD-glukopyranosylovou skupinou [ d 4,26 (1H, d, J 7,9 Hz, 1-H)]. Iridoidní struktura 3 byla objasněna experimenty 1 H–1 H COSY a HMBC a relativní stereostruktura byla charakterizována fázově citlivým NOESY experimentem, jak je znázorněno na obr. 1. Následně byla objasněna sterostruktura 3, jak je znázorněno.
Struktury kankanosidů O (4) a P (5)
Kankanosidy O (4) a P (5), C16H26O8, byly také získány jako bílé prášky s negativní optickou rotací (4: [a] D 23 26,1; 5: [a] D 21 32,7 oba v MeOH). IR spektra 4 a 5 ukázala absorpční pásy při 3433, 1696, 1647 a 1076 cm1 pro 4 a při 3434, 1701, 1647 a 1{{96} }76 cm 1 pro 5, lze připsat glykosidickým, karboxylovým a olefinovým funkcím. Jejich UV spektra vykazovala společné absorpční maximum při 217 nm, což ukazuje na přítomnost skupiny b-nenasycené karboxylové kyseliny v obou z nich. Kyselá hydrolýza 4 a 5 uvolnila D-glukózu, zatímco enzymatickou hydrolýzou s b-glukosidázou poskytly 4 a 5 (2E,6E)-8-hydroxy-2,6-dimethyl{{39 }},{{40}}oktadecenová kyselina20) (4a) a (2E,6E)-8-hydroxy-3,7- dimethyl{{ 48}}, 6-oktadecenová kyselina21) (5a), v tomto pořadí. 1H- a 13C-NMR data 4 (CD3OD, tabulky 2, 3) ukázala signály přiřaditelné dvěma methylům [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J 1,0 Hz [ 4,24 (1H, dd, J 7,6, 12,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J 6,2, 12,0 Hz), 8-H2]} a dva trisubstituované olefiny [d 5,41 (1H, ddd, J 1,2, 6,2, 7,6 Hz, 7-H), 6,75 (1H, tq, J 7,2, 1,0 Hz, 3-H)] spolu s bD glukopyranosylovou částí [d 4,34 (d, J 7,8 Hz, 1 -H)]. Porovnáním signálů uhlíku v 13C-NMR spektru 4 se signály 4a byl pozorován glykosylační posun v poloze 8- (d C 4: 65,5; 4a: 59,4). Poloha glukosidové vazby byla také potvrzena experimenty HMBC, jak je znázorněno na obr. 2. Následně byla stereostruktura 4 objasněna na (2E,6E)-8-bD-glukopyranosyloxy-2,{{ 143}}dimethyl-2,6-oktadecenová kyselina. Na druhé straně 1H- a 13C-NMR data 5 (CD3OD, tabulky 2, 3) indikovala přítomnost (2E,6E)-8-hydroxy-3,{{158} }dimethyl-2,6-skupina kyseliny oktadecenové [d 1,70 (3H, br s, 10-H3), 2,14 (3H, br s, 9-H3), 2,24 ( 2H, m, 4-H2), 2,27 (2H, m, 5-H2), 4,05, 4,20 (každý 1H, oba br d, J asi 12 Hz, 8-H2) , 5,47 (1H, tq, J 7,1, 0,9 Hz, 6-H), 5,67 (1H, br s, 1-H)] spolu s bD-glukopyranosylovou částí [d 4,23 (d, J 7,7 Hz, 1-H)]. Konektivita bD-glukopyranosylové skupiny v 5 byla objasněna na základě experimentů HMBC, jak je ukázáno na obr. 2. Dále byl pozorován typický glykosylační posun pro signály v poloze 8- (d C 5: 75,6; 5a: 68,8). Na základě výše uvedených důkazů byla stereostruktura 5 stanovena jako (2E,6E)-8-bD-glukopyranosyloxy-3,7-dimethyl-2,{ {230}}kyselina oktadienová.
Účinky složek na cytotoxicitu indukovanou faktorem nekrózy nádorů-a (TNF-a) v buňkách L929
Je známo, že TNF-a zprostředkovává řadu poranění orgánů prostřednictvím indukce buněčné apoptózy. V případě jater se biologické účinky TNF-a podílejí na poškození jater vyvolaném jaterními toxiny, ischemií/reperfuzí, virovou hepatitidou a alkoholem.22–24) Proto je TNF-a považován za důležitý cílem objevit protizánětlivé a hepatoprotektivní látky. Na základě výše uvedeného konceptu jsme zkoumali ochranné složky z přirozeně se vyskytujících produktů na TNF-a-indukovanou buněčnou smrt v buňkách L929, TNF-a-senzitivní buněčné linii.25) Dříve jsme uvedli, že několik složek z Piper Chaba, 26-29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33-35) a Sapindus rarak, 36-38) vykazovaly inhibiční účinky TNF-a -indukovaná cytotoxicita v buňkách L929. Protože fenylethanoidové složky C. tubulosa (např. echinakosid, akteosid a isoakteosid atd.) 5) také inhibovaly tuto cytotoxicitu, dále jsme zkoumali složky iridoidu, fenylpropanoidu a lignanu, jak je uvedeno v tabulce 4. Výsledkem bylo, že kankanosid A (9, inhibice: 16,3 2.0 procent při 100 mM), kyselina mussaenosidová (10, 44,7 8,7 procenta), 8-kyselina epiloganová (11, 10,7 0,4 procenta), 8-hydroxygeraniol Bylo zjištěno, že 8-ObD-glukopyranosid (17, 21,3 2,4 procenta) a ( )-pinoresinol ObD-glukopyranosid (22, 22,3 1,6 procenta) vykazují významnou aktivitu. Ačkoli jejich aktivity byly slabší než u echinakosidu (IC50 31,1 mM), akteosidu (17,8 mM) a isoaceteosidu (22,7 mM), hlavních fenylethanoidních složek.5)
Experimentální
K získání spektrálních a fyzikálních dat byly použity následující přístroje: specifické rotace, digitální polarimetr Horiba SEPA-300 (l 5 cm); UV spektra, Shimadzu UV-1600 spektrometr; IR spektra, spektrometr Shimadzu FTIR-8100; 'H- a 13C-NMR spektra, JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) a JEOL JNM-ECS400 (400, 100 HMz) spektrometry s tetramethylsilanem jako vnitřním standardem; FAB-MS a FAB-MS s vysokým rozlišením, hmotnostní spektrometr JEOL JMS-SX 102A; HPLC detektor, Shimadzu RID-10A index lomu, Shimadzu SPD-10A UV–VIS a Shodex OR-2 optické rotační detektory. Pro analytické a preparativní účely byly použity HPLC kolona, Cosmosil 5C18-MS-II a kolony pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm vnitřní průměr) a (250 20 mm vnitřní průměr).
Pro chromatografii byly použity následující experimentální podmínky: silikagelová kolonová chromatografie na normální fázi (CC), silikagel 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63—210 mesh, sférický, neutrální); silikagel CC s reverzní fází, Diaion HP-20 (Nippon Rensui) a Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 100–200 mesh); TLC s normální fází, předem potažené TLC desky silikagelem 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC s reverzní fází, předem potažené TLC desky silikagelem RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC s reverzní fází, předem potažené TLC desky se silikagelem RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekce byla dosažena postřikem 1% Ce(SO4)2–10% vodnou H2SO4, následovaným zahřátím .
Přírodní materiál
Tato položka byla popsána v předchozí zprávě.
Extrakce a izolace
Čerstvé stonky C. tubulosa (2,98 kg) byly jemně nakrájeny a extrahovány třikrát methanolem pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku se získá methanolický extrakt (249,1 g, 8,36 procent). Methanolový extrakt byl podroben Diaion HP-20 CC (5,{9}} kg, H20—MeOH), čímž byly získány frakce eluované H2O a MeOH (167,84 g, 5,63 procent a 81,21 g, 2,73 procent, respektive). Frakce eluovaná MeOH (61,{24}} g) byla podrobena normální fázi silikagelu CC [1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15 : 3 : 0,4→1{{ 36}} : 3 : 0,5->6 : 4 : 1, obj./obj./obj.)-MeOH], čímž se získá sedm frakcí [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) a 7 (4,6{{104}} g)], jak bylo popsáno dříve.5) Frakce 1 (1,12 g) byla oddělena reverzní fází silikagelu CC [55 g, MeOH–H2O (4 0 : 60, obj./obj.)→MeOH] za vzniku pěti frakcí [Fr. 1-1 (132,8 mg), 1-2 (267.0 mg), 1-3 (182,8 mg), {{80}} (31{{ 156}},9 mg) a 1-5 (91,4 mg)]. Frakce 1-1 (132,8 mg) byla dále purifikována pomocí HPLC [Cosmosil 5C{{9{{160}}}}MS-II, CH3CN – 1% vodný AcOH (1{166} } : 90, obj./obj.], aby se získal kankanosid M (2, 2,8 mg, 0.{{203}}{{22{{24{{248 }}}}}}01 procento), bartsiosid (7, 5,2 mg, 0.0002 procenta), sinapový aldehyd {{1{{295 }}6}}O-bD-glukopyranosid (21, 1,4 mg, {{3{{3{{3{{310}}9}}5}}{{320} }}}.0001 procento). Frakce 1-2 (267.{{350}} mg) byla dále purifikována pomocí HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1% vodný AcOH (7 : 93, v/v)] za vzniku (2E,6E)-3,7-dimethyl-8-hydroxyoktadienu{{13{{360}}}}yl-O-bD -glukopyranosid (16, 15,8 mg, {{370}}.{{406}}007 procent), 8-hydroxygeraniol 8-ObD glukopyranosid (17, 5,2 mg, 0,0002 procenta), ( )-pinoresinol ObD-glukopyra noside (22, 22,0 mg, 0,0010 procenta), eucommin A (23, 5,0 mg, 0,0002 procenta), commin isoeu2 procenta (24, 21,3 mg, 0,0010 procent) a ( )-syringaresinol ObD-glukopy ranosid (25, 98,0 mg, 0,0044 procent). Frakce 2 (9,56 g) se oddělila na silikagelu CC s reverzní fází [400 g, MeOH-H20 (10 : 90, obj./obj.) —MeOH —> aceton] za vzniku pěti frakcí [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) a 2-5 (31,9 mg) ], jak bylo popsáno dříve.5) Frakce 2-2 (500,0 mg) byla podrobena HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1% vodný AcOH (5 : 95, obj./obj. )] za vzniku kankanosidu L (1, 6,6 mg, 0,0026 procenta) a 6-deoxykatalpolu (6, 455,5 mg, 0,182 procenta). Frakce 2-3 (1,00 g) byla podrobena HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1% vodný AcOH (7 : 93, obj./obj.)] za vzniku sedmi frakcí [Fr . 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6 mg), 2-3-5 [ 7 (380,6 mg) , 0,0581 procenta)], 2-3-6 [ glurosid (8, 285,1 mg, 0,0435 procenta)] a 2-3-7 (84,9 mg)]. Frakce 2-3-4 (106,6 mg) byla dále purifikována pomocí HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN – 1% vodný AcOH (5:95, obj./obj.)] za vzniku 6 (68,4 mg, 0,0134 procenta) spolu se salidrosidem5) (13,7 mg, 0,0027 procenta). Frakce 2-4 (1,16 g) byla podrobena HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% vodný AcOH (15 : 85, obj./obj.) a Cosmosil pNAP, CH3CN–1% vodný AcOH (10 : 90 nebo 15 : 85, obj./obj.)] za vzniku kankanosidů N (3, 15,6 mg, 0,0007 procenta), O (4, 44,1 mg, 0,0020 procenta) a P (5, 4,2 mg, 0,0002 procenta procenta), 6 (24,0 mg, 0,0011 procenta), 8 (17,7 mg, 0,0008 procenta), kankanoiside A (9, 22,3 mg, 0,0010 procent), 8-epideoxyloganovou kyselinu (12, 8,1 mg, 0,0004 procenta), kankanosid E (14, 58,1 mg, 0,0026 procenta), (2E,6Z)-8-bD-glukopy ranosyloxy-2,6-dimethyl-2,6-oktadienová kyselina (15, 31,0 mg, 0,0014 procenta), 16 (168,6 mg, 0,0075 procenta), 17 (94,3 mg, 0,0042 procenta), betulalbusid A (18, 8,1 mg, 0,0004 procenta), koniferin (3,819 mg, 0,004 procenta) a syringin (20, 33,9 mg, 0,0015 procent). Frakce 4 (10,69 g) se oddělila na silikagelu CC s reverzní fází [500 g, MeOH-H20 (30 : 70, obj./obj.) —MeOH —— aceton] za vzniku čtyř frakcí [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7,06 g), 4-3 (1,57 g) a 4-4 (792,8 mg)], jak bylo popsáno dříve.5) frakce 4-1 (500,0 mg) byla purifikována pomocí HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1% vodný AcOH (10 : 90, obj./obj.)] za vzniku kyseliny mussaenosidové (10, 39,1 mg, 0,0031 procenta) a kyselinu geniposidovou (13, 51,2 mg, 0,0040 procenta). Frakce 5 (8,84 g) se oddělila na silikagelu CC s reverzní fází [400 g, MeOH-H20 (20 : 80 —> 30 : 70, obj./obj.) —MeOH —— aceton] za vzniku sedmi frakcí [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) a 5-7 (130,1 mg)], jak bylo popsáno dříve.5) Frakce 5-1 (870,2 mg) byla dále purifikována pomocí HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN –1% vodný AcOH (5:95, obj./obj.)], čímž se získá 10 (55,3 mg, 0,0025 procenta) a 8-epiloganová kyselina (11, 51,5 mg, 0,0023 procenta).
Kankanosid L (1): bílý prášek, [a]D26 45,7 (c 0,48, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C15H24O9Na [M Na] 371,1318; Nalezeno 371,1309. IR (KBr, cm1): 3433, 2928, 1080. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Pozitivní- iont FAB-MS m/z: 371 [M Na]. Negativní ion FAB-MS m/z: 347 [MH] .
Kankanosid M (2): bílý prášek, [a]D26 18,7 (c 0,11, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C15H22O8Na [M Na] 353,1212; Nalezeno 353,1208. IR (KBr, cm 1): 3433, 2924, 1736, 1655, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Pozitivní iontová FAB-MS m/z: 353 [M Na].
Kankanosid N (3): bílý prášek, [a]D25 24,6 (c 1.00, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C16H28O8Na [M Na] 371,1682; Nalezeno 371,1686. IR (KBr, cm1): 3415, 2874, 1076, 1028. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Pozitivní iont FAB-MS m/z: 371 [M Na].
Kankanosid O (4): bílý prášek, [a]D23 26,1 (c 2,30, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Nalezeno 369,1528. UV [lmax (loge), MeOH, nm]: 217 (4,04). IR (KBr, cm 1): 3433, 2926, 1696, 1647, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Pozitivní iontové FAB-MS m/z: 369 [M Na].
Kankanosid P (5): bílý prášek, [a]D21 32,7 (c 0,18, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Nalezeno 369,1520. UV [lmax (loge), MeOH, nm]: 217 (4,08). IR (KBr, cm1): 3434, 2926, 1701, 1647, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Pozitivní iontové FAB-MS m/z: 369 [M Na].
Kyselá hydrolýza kankanosidů L—P (1—5): Byly použity roztoky 1—5 (každý 1,{5}} mg) v 1,0 M HCl (1.0 ml) zahřívá na 80 stupňů po dobu 3 hodin. Po ochlazení byla reakční směs neutralizována Amberlitem IRA-400 (OH forma) a pryskyřice byly odstraněny filtrací. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku byl zbytek oddělen kolonou Sep-Pak C18 (H20—MeOH). Frakce eluovaná H20 byla podrobena HPLC analýze za následujících podmínek: HPLC kolona, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokio, Japonsko); detekce, optická rotace [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokio, Japonsko); mobilní fáze, CH3CN-H20 (85:15, obj./obj.); druhá rychlost 0,8 ml/min]. Identifikace D-glukózy přítomné ve frakcích 1-5 eluovaných H2O byla provedena srovnáním jejich retenčních časů a optické rotace s autentickým vzorkem [tR 17,9 min (pozitivní)].
Hydrogenace {{0}}deoxykatalpolu (6) Suspenze 6 (12.0 mg) a 10 procent palladia na uhlíku (50 mg) v MeOH (2,0 ml) byl míchán při teplotě místnosti v atmosféře H2 po dobu 2 hodin. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát byl zahuštěn za sníženého tlaku, čímž byla získána sloučenina 1 (12,0 mg, kvant.).
Enzymatická hydrolýza kankanosidů O (4) a P (5) s b-glukosidázou K roztoku 4 (8,{5}} mg) v H2O (1,5 ml) byla přidána b-glukosidáza (4,7 mg, z mandlového, Oriental Yeast Co., Tokyo, Japonsko) a roztok byl míchán při 37 stupních po dobu 24 hodin. Reakce byla ukončena přidáním EtOH (5,{15}} ml), směs byla zahuštěna za sníženého tlaku. Zbytek byl extrahován EtOAc a odpařením rozpouštědla byl získán (2E,6E)-8-hydroxy-2,{{20}}dimethyl-2,{{22} kyselina oktadecenová20) (4a, 3,9 mg, 92 procent). Podobným postupem (2E,6E)-8-hydroxy-3,7-dimethyl-2,6-oktadecenová kyselina21) (5a, 0,9 mg, 94 procent ) byl získán z kankanosidu P (5, 1,8 mg).
Metoda biologického testu Inhibiční účinek na cytotoxicitu indukovanou TNF-a v buňkách L929 byl testován metodou popsanou v předchozím článku.5)
Statistika Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry SEM Pro statistickou analýzu byla použita jednocestná analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Dunnettovým testem. Hodnoty pravděpodobnosti (p) menší než 0,05 byly považovány za významné.
bylina cistanche
