Zkoumání toxicity ifosfamidu indukuje společný upstream regulátor v játrech a ledvinách

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han a kol

Abstraktní:

Ifosfamid je alkylační činidlo, syntetický analog cyklofosfamidu, používaný k léčbě různých pevných rakovin. V této studii byla toxicita ifosfamidu hodnocena pomocí intraperitoneálního podání jedné a více dávek u potkanů ​​podle pokynů správné laboratorní praxe a následoval další mikročipový experiment na podporu toxikologických zjištění. Jednorázová dávka ifosfamidu (50 mg/kg) nevyvolala žádné patologické změny. Mezitím byla pozorována závažná renální toxicita ve skupinách, kterým byl podáván 7 a 28 dní po sobě, s významným zvýšením hladiny dusíku močoviny a kreatininu v krvi. V analýze seznamu toxinů byly geny související se syntézou cholesterolu většinou ovlivněny v játrech a geny související se selháním ledvin byly ovlivněny vledvinapo podání ifosfamidu. Kromě toho byl interferonový regulační faktor 7 vybrán jako hlavní upstream regulátor, který se změnil v oboujátraaledvinaa bylo zjištěno, že interaguje s jinými cílovými geny, jako je ubikvitin specifická peptidáza 18, radikální S-adenosyl methioninová doména obsahující 2 a interferonem stimulovaný gen 15, což bylo dále potvrzeno analýzou RT-PCR v reálném čase. Na závěr znovu potvrdili toxicitu ifosfamidu na ledviny a identifikovali identicky změněné geny v oboujátraaledvina. K odhalení přesného vztahu mezi geny indukovanými ifosfamidem a orgánovou toxicitou jsou zapotřebí další komplexní toxikogenomické studie.

klíčová slova:ifosfamid; hepatotoxicita; nefrotoxicita; intraperitoneální toxicita

Cistanche je dobrá na játra a ledviny

1. Úvod

Ifosfamid je alkylační činidlo, syntetický analog cyklofosfamidu, používaný k léčbě různých solidních rakovin, včetně sarkomů a lymfomů. Ifosfamid je nespecifické protinádorové léčivo buněčného cyklu, které interferuje s replikací DNA a tvorbou RNA [1]. I když je ifosfamid relativně dobře tolerován ve srovnání s jinými toxickými alkylačními činidly, je známo, že je spojen s řadou život ohrožujících nežádoucích účinků, které omezují jeho klinické použití [2]. Mezi hlavní vedlejší účinky ifosfamidu patří těžké poškození ledvin v důsledku reaktivních toxických látek z ifosfamidu, včetně akutníchledvina zraněníintersticiální nefritida, hemoragická cystitida a Fanconiho syndrom [3]. Na klinikách byla hlášena závažná víceorgánová toxicita u pacientů, u kterých se objevila časná renální toxicita a opakované selhání jednoho orgánu vyvolané vysokými dávkami ifosfamidu, které vedlo k následnému orgánovému selhání [4,5].

Toxický metabolit ifosfamidu, akrolein a chloracetaldehyd jsou hlavním faktorem odpovědným za orgánovou toxicitu ifosfamidu. Předchozí studie se zaměřovaly především na faktory ovlivňující přeměnu ifosfamidu na toxické metabolity, zejména cytochrom P450 (CYP) [6]. Relativně hojné CYP3A4 a CYP3A5 v ledvinách vedou k toxickým změnám ifosfamidu a indukují nefrotoxicitu [7]. Akrolein je vysoce reaktivní aldehyd, který může aktivovat intracelulární reaktivní oxidační genovou dráhu a poškodit buněčnou organelu. Chloracetaldehyd uvádí supresi aktivace komplexu I v mitochondriálním respiračním řetězci, což může vést k depleci intracelulárního glutathionu (GSH) a buněčné smrti [8].

Toxikologická studie s více orgány je užitečnější pro pochopení systémových účinků léků než cílení na specifické orgány pro studie toxicity. Játra a ledviny jsou hlavními orgány, které se účastní metabolismu a vylučování léků, a tyto hlavní orgány jsou náchylné k nežádoucím reakcím na léky; často následuje orgánová toxicita. Integrativní toxikologické hodnocení může navíc představovat různá patologická zjištění, která mohou pomoci porozumět a předvídat toxicitu vyvolanou léčivy v systému.

Mnoho studií používá profily genové exprese k předpovědi potenciálních negativních účinků chemikálií. Většina dřívějších studií se však zaměřovala na hodnocení toxicity pro jeden cílový orgán s pouze omezenými patologickými příznaky [9]. Navíc v kombinaci s profilováním genů na bázi microarray vytvoří komplexní pochopení toxicity na úrovni systému, které může zabránit potenciální toxicitě související s léky [10]. V tomto ohledu byly ve studiích modelu predikce toxicity použity integrativní multiorgánové toxikologické přístupy s profilováním genové exprese, aby se překonaly údaje o toxicitě odvozené z hodnocení toxicity pro jeden orgán, což je nedostatečné pro pochopení toxických mechanismů léčiv v systému [11].

V této studii popisujeme toxicitu ifosfamidu vledvinaajátrapo akutní a opakované expozici u potkanů ​​Sprague–Dawley (SD). Byly provedeny podpůrné testy profilování genové exprese, aby se odhalil společný cílový gen, který byl ifosfamidem změněn jak v játrech, tak vledvina, což naznačuje pohled na integrativní toxicitu ifosfamidu.

2. Výsledky

2.1. Studie toxicity po jedné dávce

Ve skupinách s 12,5, 25 a 50 mg/kg ifosfamidu nebyla pozorována žádná toxicita – nikoli smrt, toxické příznaky, změny tělesné hmotnosti nebo histopatologické nálezy.

Mezitím se v hematologické studii relativní počty retikulocytů (RET) a absolutní počty neutrofilů (NEUA) a lymfocytů (LYMA) snížily v závislosti na dávce.

2.2. Jednotýdenní studie toxicity opakovaných dávek

Celková tělesná hmotnost poklesla po 1 týdnu podávání ifosfamidu a průměrné hodnoty úbytku tělesné hmotnosti ve skupině 100 mg/kg byly vyšší než ve skupině 75 mg/kg (tabulka 1). Mezitím se relativní hmotnost orgánů postupně zvyšovala ve skupinách léčených ifosfamidem (tabulka 2).

Jeden týden po sobě jdoucího IP podávání ifosfamidu potlačilo hematologický index, včetně RBC, HGB, HCT, MCV a PLT, způsobem závislým na dávce (tabulka 3). Navíc BUN a CREA vzrostly 1,2krát v kontrolní skupině ve srovnání se skupinou s ifosfamidem (tabulka 4).ledvinyzraněníbyla dále podpořena histopatologickou studií.

Žádné histopatologické známky nebyly pozorovány v játrech myší ve skupinách 75 a 100 mg/kg ifosfamidu (obr. 1A). Mezitím,ledvinyu skupin 75 a 100 mg/kg ifosfamidu bylo zjištěno, že mají minimální až mírný stupeň patologických změn, včetně tubulární degenerace/dilatace (1 střední ve skupině 100 mg/kg), jednobuněčné nekrózy, hyperplazie urotelu a fokálního krvácení /přetížení (tabulka 5). Kromě toho bylo pozorováno evidentní zvýšení exprese KIM-1 v oblasti renálních tubulůledvinaskupiny 100 mg/kg (obrázek 1B).

2.3. Čtyřtýdenní studie toxicity po opakovaných dávkách

Mortalita byla pozorována ve skupinách léčených 50 (5/10) a 70 (10/10) mg/kg po 21 a 10 dnech po sobě jdoucího podávání. Navíc snížená tělesná hmotnost se zvýšenou relativní hmotností orgánů,játra, aledvinave všech skupinách léčených ifosfamidem podporuje 4-týdenní toxicitu opakovaných dávek.

U přeživších subjektů byly provedeny hematologické a biochemické analýzy séra. Několik krevních parametrů, včetně RET, RBC, MONA, EOSA a LUCA, bylo po 4 týdnech podávání ifosfamidu významně sníženo.

Ve srovnání s kontrolní skupinou biochemické analýzy prokázaly statistické rozdíly po 4 týdnech podávání ifosfamidu. Například hladiny AST a CK byly významně zvýšeny a poměr A/G, GLU a GGT byly sníženy (p < 0,01)="" ve="" skupině="" léčené="" 50="" mg/kg="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou.="">

2.4. Analýza genové exprese indukované ifosfamidem

DEG indukované ifosfamidem byly identifikovány v játrech aledvinatkání (tabulka 6). Pro játra zahrnovaly odlišně exprimované geny 2672 genů při 100 mg/kg tělesné hmotnosti/den, 1283 genů bylo upregulováno a 1389 genů bylo regulováno směrem dolů. V ledvinách bylo 401 genů odlišně exprimováno při 100 mg/kg BW/den – 149 genů bylo upregulováno a 252 genů bylo downregulováno. Jak v játrech, tak v ledvinách byl počet down-regulovaných genů větší než počet up-regulovaných genů. To by mohlo naznačovat, že léčba ifosfamidem zřejmě inhibuje genovou expresi.

Výsledky analýzy biologických funkcí jsou uvedeny v tabulce 7. Bylo zjištěno, že 1-týdenní podávání ifosfamidu mění geny související s vývojem orgánů, většinou v játrech. Vledvinabylo potvrzeno, že nejvíce byly ovlivněny geny související s lokalizací imunitních buněk.

Při analýze kanonické dráhy DEGs byly změny v syntéze cholesterolu a geny související s dráhou prezentace antigenu evidentní vjátraaledvinatkání (obrázek 2). Navíc LXE/RXR a signalizace odezvy akutní fáze byly běžnou top-regulovanou kanonickou cestou vjátraaledvina, které se podílely na lipidové homeostáze a signalizaci zánětlivých cytokinů.

V analýze seznamu jaterních toxinů byly většinou ovlivněny geny související se syntézou cholesterolu, následované pozitivními proteiny akutní fáze odezvy a panelem akutního selhání ledvin (tabulka 8). Kromě toho výsledky seznamu ledvin ukázaly, že geny související se selháním ledvin byly obecně ovlivněny ifosfamidem, včetně biomarkerů reverzibilní glomerulonefritidy a panelu akutního selhání ledvin.

Na základě znalostní báze IPA reguluje genovou expresi v játrech a ledvinách po léčbě ifosfamidem společný upstream regulátor (obrázek 3). IRF7 byl hlavním regulátorem, který se změnil v játrech i ledvinách a bylo zjištěno, že interaguje s jinými cílovými geny, jako jsou USP18, RSAD2 a ISG15. Kromě toho analýza RT-PCR v reálném čase potvrdila expresi IRF7, USP18, RSAD2 a ISG15. Přestože rozsah změn v každém genu byl mezi játry a ledvinami odlišný, exprese byla po 1 týdnu podávání ifosfamidu potlačena jak v jaterní, tak v ledvinové tkáni. RSAD2 a USP18 většinou změnily geny léčbou ifosfamidem v játrech a ledvinách.

3. Diskuse

V této studii byla zkoumána komplexní toxicita ifosfamidu ve více orgánech s různými dávkami a expozičními podmínkami prostřednictvím IP cesty u potkanů ​​podle standardu GLP. Na klinikách může ifosfamid vykazovat bimodální protinádorový účinek s cytotoxickým a imunomodulačním účinkem v kombinaci s adoptivní imunoterapií [12]. Je známo, že ifosfamid je eliminován hlavně ledvinami a asi 80 procent dávky je v nezměněné formě, nefrotoxicita je běžně známým vedlejším účinkem ifosfamidu a za jeho klinické použití jsou zodpovědné metabolity jako chloracetaldehyd a akrolein [13, 14].

V této studii byla 1-týdenní opakovaná studie toxicity vhodná pro zkoumání orgánové toxicity odvozené od ifosfamidu. Týdenní podávání ifosfamidu potlačilo krevní index v závislosti na dávce, což by mohlo odrážet typickou myelosupresi způsobenou ifosfamidem. Spolu s nefrotoxicitou několik zpráv naznačilo, že myelosuprese je jednou z hlavních toxicit ifosfamidu omezujících dávku a leukopenie je obecně závažnější než trombocytopenie [15,16]. Nefrotoxicita ifosfamidu může vést k Fanconiho syndromu, při kterém dochází k narušení funkce proximálních tubulů vedoucí k nevratnému poškození a toxický metabolit akrolein vyvolává urotoxicitu s hemoragickou cystitidou [17]. To je v souladu s výsledky této studie. V histopatologické studii byly vyšetřeny ledviny a játra, aby se prozkoumaly patologické změny odvozené od ifosfamidu. U obou skupin, kterým byl podáván ifosfamid v dávce 75 a 100 mg/kg, byly detekovány velké oblasti tubulární degenerace a dilatace s hyperplazií urotelu v oblasti ledvinové pánvičky. Kromě toho exprese KIM-1, molekuly poškození renálního proximálního tubulu, podpořila přítomnost nefrotoxicity související s ifosfamidem. Mezitím byla v játrech pozorována pouze minimální periportální vakuolizace. Navíc, ačkoli hodnoty AST a ALT klesaly v závislosti na dávce, byly změny v referenčním rozmezí [18]. Hlubší důvody pro snížení hladin jaterních enzymů bude třeba dále studovat. Všeobecně se uznává, že ifosfamid je alkylační činidlo, které je zřídka spojeno s hepatotoxicitou, a pouze v několika případech bylo hlášeno, že indukuje poškození jater, zvláště v kombinaci s jinými chemoterapeutiky, jako je doxorubicin [19].

V poslední době vedl pozoruhodný pokrok v datech genové exprese v toxikologii pomocí vysoce výkonných technologií k vytvoření dostatečně velkých souborů dat ve studiích toxicity a bylo učiněno mnoho pokusů aplikovat genový profil na predikci chemické toxicity [10,20]. V této studii byla provedena mikročipová analýza k analýze transkriptomové odpovědi vyvolané podáním ifosfamidu a jako cílový gen byly vybrány stupně s násobnou změnou větší nebo rovnou 1,5 a byly použity biologická funkce, kanonická dráha a analýza seznamu Tox. pochopit funkci genů indukovaných ifosfamidem. Byla provedena další analýza upstream regulátoru pro vyhodnocení možnosti multiorgánové toxicity v játrech a ledvinách.

V této studii byly DEG změněny 1.5-krát byly vybrány a downregulované geny byly o něco dominantnější než upregulované geny jak v játrech (52 procent), tak v ledvinách (62 procent). Výsledky analýzy biologických funkcí ukázaly, že ifosfamid mění geny, přičemž biologické funkce související s vývojem tkáně jsou běžně pozorovány jak v játrech, tak v ledvinách.

Předchozí studie Snouber et al. [21] uvádějí, že léčba ifosfamidem snižuje v mikrofluidní kultuře down-regulaci stresových oxidačních reakcí zprostředkovaných Nrf{2}} [21]. V souladu s předchozími studiemi byla dráha reakce na oxidační stres zprostředkovaná NRF{4}} významně modulována špičkovými sítěmi, což potvrdila jak současná kanonická dráha, tak analýza seznamu toxínů. Současné změněné Nrf-2 zprostředkované dráhy oxidační reakce na stres mohou úzce souviset s toxickým metabolitem ifosfamidu. Mnohočetné toxické metabolity ifosfamidu mohou reagovat s GSH, silným antioxidantem, za vzniku konjugátů na různých místech podél dráhy a snížení hladiny GSH má za následek zvýšenou toxicitu, což naznačuje implikaci oxidačního stresu v toxicitě ifosfamidu pro orgány [8,22 ]. V tomto ohledu byly mesna a N-acetylcystein použity ke zmírnění orgánové toxicity ifosfamidu. Mesna slouží jako regionální detoxifikant tím, že se váže na toxický metabolit ifosfamidu, hlavně proti akroleinu, prostřednictvím Michaelovy adice za vzniku méně škodlivé látky [23]. Navíc se uvádí, že N-acetylcystein má antioxidační aktivitu a zlepšuje depleci GSH za podmínek oxidačního stresu [24]. K objasnění přesného vztahu mezi antidotem ifosfamidu a cestou regulovanou za nefrotoxických podmínek jsou zapotřebí další studie. Můžeme spekulovat, že po zmírnění toxicity ifosfamidu mesnou nebo N-acetylcysteinem by mohly následovat zlepšené dráhy oxidační reakce na stres zprostředkované Nrf{14}}.

V této studii byly signály související se zánětem běžně upregulovány jak v játrech, tak v ledvinách, což lze rozpoznat signalizací akutní fáze v analýze kanonických drah. Tento výsledek ukázal implikaci zánětlivé reakce v patofyziologii orgánové toxicity ifosfamidu v obou tkáních, což bylo dále podpořeno analýzou upstream regulátoru. V analýze upstream regulátoru byly jako běžné upstream regulátory v játrech a ledvinách vybrány geny související se signálem IRF7 a interferon (IFN), včetně USP18, RSAD2 a ISG15. IRF7 je lymfoidně specifický faktor, který je konstitutivně exprimován v cytoplazmě imunitních buněk a může být také indukován interferonem typu I, virovou infekcí a vnějšími stimuly v různých buňkách [25]. Předchozí studie uváděla kontroverzní pro- nebo antionkogenní vlastnosti IRF7 v různých nádorových buňkách a změny v expresi IRF7 byly spojeny s poškozením DNA [26–28].

Kromě své důležité regulační úlohy v IFN typu I pro antivirové funkce bylo hlášeno, že IRF7 potlačuje zánětlivé reakce prostřednictvím signální dráhy TLR4 [29]. Navíc Stout-Delgado a kol. [30] uvedli, že stárnutím indukovaný oxidační přírůstek zhoršuje aktivitu IRF7, zatímco snížení stresu antioxidačními činidly aktivitu IRF7 zlepšilo. V této studii podávání ifosfamidu potlačilo expresi upstream regulátorů a expresní vzorce byly identické jak v játrech, tak v ledvinách. Současné změny v expresi IRF7 by mohly souviset se zánětlivou reakcí a vlastnostmi ifosfamidu jako cytotoxického alkylačního činidla, což by mohlo naznačovat, že IRF7 je slibným cílem orgánové toxicity ifosfamidu.

V této studii jsme našli gen, který byl po podání ifosfamidu identicky inhibován jak v játrech, tak v ledvinách, ale interpretace jeho toxikologického významu byla zaměřena pouze na ledviny, což limituje současný objev. Kromě toho by tato zjištění mohla podpořit další potvrzující studie týkající se účinku komerčně dostupného antidota ifosfamidu na aktuálně pozměněný gen.

Závěrem bylo zjištěno, že opakovaná studie toxicity (1 týden) podávání ifosfamidu vykazovala spíše zkreslenou nefrotoxicitu než hepatotoxicitu. Kromě toho současné výsledky poskytují důkaz pro ifosfamidem indukovanou hepatotoxicitu a mechanismus nefrotoxicity, který zahrnuje inhibici IRF-7. Pro objasnění systémového toxikologického mechanismu ifosfamidu a pro podporu vztahu mezi genovou a orgánovou toxicitou jsou zapotřebí další toxikogenomické studie imunitních orgánů.

4. Materiály a metody

4.1. Studie na zvířatech

Osmitýdenní samci krys Sprague–Dawley (SD) bez specifických patogenů (n=140) byli získáni od Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). Zvířata byla vyšetřována a aklimatizována na laboratorní podmínky prostředí týden před experimentem. Všechna zvířata byla umístěna v plastových klecích za kontrolovaných laboratorních podmínek (teplota 23 ± 3 ◦C; vlhkost, 55 ± 10 procent; a cyklus světlo/tma 12/12-h) s laboratorní potravou a vodou ad libitum. Studie na zvířatech byla schválena Institutional Animal Care and Use Committee of the Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Korea) a všechny postupy byly provedeny v souladu s testovacími směrnicemi pro hodnocení bezpečnosti léčiv od Korejského úřadu pro potraviny a léčiva. Studie na zvířatech byla rozdělena do tří částí: studie toxicity s jednorázovou dávkou (akutní) a opakovanou dávkou (1 týden a 4 týdny) po sobě jdoucí podávání. V každé studii toxicity bylo pomocí systému Path/Tox (verze 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) náhodně rozděleno čtyřicet krys do čtyř skupin (kontrola, tl, t2 a t3).

4.2. Experiment s toxicitou

Studie toxicity byla rozdělena do tří částí: studie toxicity s jednou dávkou (akutní) a dvě studie toxicity s opakovanými dávkami (následná dávka po dobu 1 týdne nebo 4 týdnů). Pro každou studii toxicity byli potkani náhodně rozděleni do odpovídajících skupin (kontrola, dávka 1, dávka 2 a dávka 3 pro jedno a 4-týdenní studie toxicity; kontrola, dávka 1 a dávka 2 pro 1- týdenní studie toxicity) pomocí systému Path/Tox (verze 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). Ve studii toxicity byl ifosfamid podáván intraperitoneální (IP) cestou a kontrolní skupina dostávala destilovanou vodu (DW). Dávka ifosfamidu použitá ve studii toxicity byla následující: studie akutní toxicity (12,5, 25 a 50 mg/kg), 1-týdenní studie toxicity (75 a 100 mg/kg tělesné hmotnosti/den) a {{19 }}týdenní studie toxicity (25, 50 a 70 mg/kg tělesné hmotnosti/den). Celkové klinické příznaky, tělesná hmotnost a mortalita zvířat byly zaznamenávány denně během podávání a všechna zvířata byla usmrcena 24 hodin po posledním podání ifosfamidu. Vzorky krve byly odebrány a umístěny do mikrocentrifugačních zkumavek a EDTA-K2 zkumavek pro biochemii séra a hematologickou analýzu, v daném pořadí. Tkáně jater a ledvin byly fixovány ve formaldehydu a podrobeny histopatologické analýze. Další imunohistochemie, mikročipová analýza a RT-PCR v reálném čase byly provedeny na tkáních jater a ledvin ze studie subakutní toxicity (100 mg/kg tělesné hmotnosti/den).

4.3. Hematologická a biochemická analýza séra

Standardní hematologické testy byly provedeny pomocí hematologického systému ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Německo). Byly použity následující indikátory: počet bílých krvinek (WBC), počet červených krvinek (RBC), hematokrit (HCT), koncentrace hemoglobinu, střední korpuskulární objem (MCV), průměrný korpuskulární hemoglobin (MCH), počet krevních destiček (PLT), počet lymfocytů (LYM), monocytů (MON), neutrofilů (NEU), bazofilů (BAS), eozinofilů (EOS) a velkých nezabarvených buněk (LUC) a retikulocytů (RET).

Biochemický test byl proveden za použití automatického analyzátoru (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokio, Japonsko) s odstředěným sérem. Hlavními biochemickými ukazateli byly alaninaminotransferáza (ALT), aspartátaminotransferáza (AST), alkalická fosfatáza (ALP), dusík v krvi (BUN), kreatinin (CREA), glukóza (GLU), celkový cholesterol (TCHO), poměr albumin/globulin (A/G), triglyceridy (TG), celkový bilirubin (TB), gama-glutamyltransferáza (GGT), fosfolipidy (PL), vápník, chlorid, anorganický sodík, fosfor a draslík.

4.4. Histopatologické a imunohistochemické vyšetření

Tkáně zalité v parafínu byly nařezány na tloušťku 5- um, obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) a mikroskopicky zkoumány.

Tkáň ledvin byla podrobena imunohistochemii. Deparafinizované a promyté řezy byly preinkubovány s 10% kozím sérem, aby se zablokovalo nespecifické barvení. Sklíčka pak byla přes noc inkubována s primární anti-KIM1 protilátkou (1:750; Santa Cruz, CA, USA). Po odstranění primárních protilátek byly řezy zpracovány soupravou VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK) a exprese KIM1 byla zkoumána pod světelným mikroskopem.

4.5. Mikročipová analýza a analýza interakce protein-protein (PPI).

Játra a ledviny ze skupiny 1-týden (100 mg/kg) byly homogenizovány a celková RNA byla extrahována pomocí RNase mini kit (Qiagen). Syntéza cDNA byla dosažena pomocí cDNA Synthesis Kit (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) a podrobena analýze microarray a PPI.

Analýza Microarray byla provedena pomocí Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 s GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) a výsledky byly zpracovány pomocí analytického softwaru GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Diferenciálně exprimované geny (DEG), které se po podání ifosfamidu změnily více než 1,{6}}krát, byly vybrány pomocí jednosměrné analýzy variance (ANOVA) s Tukeyho post hoc testem. Biologické funkce a kanonické dráhy vybraných DEG byly analyzovány pomocí softwaru Ingenuity Pathway Analysis (IPA, verze 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) a byla provedena analýza upstream regulátoru k identifikaci upstream regulátorů, které by mohly být odpovědný za stupně odvozené z toxicity ifosfamidu. Další síťová analýza DEGs interakcí protein-protein (PPI) byla provedena pomocí softwaru STRING (verze 10) a interakce byla potvrzena, když skóre střední spolehlivosti bylo vyšší než 0,4. Proteinová interakce je přibližná pravděpodobnost, že existuje předpovězená vazba mezi dvěma proteiny v cestě Kjótské encyklopedie genů a genomů.

4.6. Kvantitativní studie RT-PCR v reálném čase

Exprese běžných regulačních genů ve studii microarray byla potvrzena pomocí kvantitativní RT-PCR v reálném čase. Genově specifické primery byly získány od Bioneer (Daejeon, Korea). Sekvence primerů byly následující: interferonový regulační faktor 7 (IRF7): dopředný, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 a reverzní, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubikvitin specifická peptidáza 18 (USP18): dopředná, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 a zpětná 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; radikální S-adenosyl methioninová doména obsahující 2(RSAD2): dopředná, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 a zpětná, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferonem stimulovaný gen 15 (ISG15): vpřed, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3a zpětně, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Celková RNA byla reverzně transkribována na cDNA za použití SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) a oligo-dT primerů podle pokynů výrobce. Hladiny exprese mRNA upstream regulačních genů byly analyzovány pomocí systému StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) s anSYBR Green master mix (Applied Biosystems), podle protokolu výrobce. 18S ribozomální RNA primer byl použit jako vnitřní kontrola a výsledky byly vyjádřeny jako násobek změny vzhledem k normální kontrolní skupině.

4.7. Statistická analýza

Data byla statisticky analyzována za použití několika srovnávacích metod. Když Bartlettův test neukázal žádné významné odchylky od homogenity rozptylu, byla použita analýza rozptylu (ANOVA) ke stanovení, zda se některý ze skupinových průměrů lišil na hladině významnosti p < {{0}},05.="" kromě="" toho="" byl="" dunnettův="" test="" použit="" ke="" stanovení="" rozdílů="" v="" datech="" mezi="" kontrolní="" a="" léčebnou="" skupinou,="" když="" bylo="" zjištěno,="" že="" data="" jsou="" významná="" z="" testu="" anova.="" kromě="" toho,="" když="" byly="" z="" bartlettova="" testu="" pozorovány="" významné="" odchylky="" od="" homogenity="" rozptylu,="" byl="" proveden="" neparametrický="" srovnávací="" test,="" kruskal-wallisův="" (h)="" test,="" aby="" se="" zjistilo,="" zda="" se="" některý="" ze="" skupinových="" průměrů="" lišil="" při="" p="">< 0,05.="" když="" byl="" pozorován="" významný="" rozdíl="" v="" kruskal-wallisově="" (h)="" testu,="" byl="" proveden="" dunnův="" rank="" subtest="" ke="" kvantifikaci="" specifických="" párů="" skupinových="" dat,="" které="" se="" významně="" lišily="" od="" průměru.="" fisherův="" exaktní="" test="" byl="" proveden="" pro="" porovnání="" párů="" dat="" (včetně="" prevalence="" a="" procenta).="" úroveň="" pravděpodobnosti="" byla="" nastavena="" na="" 1="" nebo="" 5="" procent.="" statistické="" analýzy="" byly="" provedeny="" porovnáním="" dat="" z="" různých="" léčebných="" skupin="" s="" daty="" z="" kontrolní="" skupiny="" pomocí="" path/tox="" (verze.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Prohlášení o dostupnosti dat:

Údaje jsou obsaženy v článku nebo v doplňkových materiálech.

Střet zájmů:

Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Reference

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; a kol. Vysoká dávka ifosfamidu u pacientů s relabujícím a neresekovatelným osteosarkomem vysokého stupně: retrospektivní série. Buňky 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Vedlejší účinky ifosfamidu. Onkologie 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Růstové bolesti ifosfamidu. Clin. Ledviny J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Eliáš, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Vysokodávkovaný ifosfamid/karboplatina/etoposid s autologní podporou hematopoetických kmenových buněk: Bezpečnost a budoucí směry. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sekvenční průběh a prospektivní léčba multiorgánové toxicity vyvolané ifosfamidem. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrom P450 3A a 2B6 ve vyvíjející se ledvině: Důsledky pro nefrotoxicitu ifosfamidu. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB shrnutí: Ifosfamidové dráhy, farmakokinetika a farmakodynamika. Farmakogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Akrolein a chloracetaldehyd: Vyšetření buněčných a bezbuněčných biomarkerů toxicity. Chem. Biol. Komunikujte. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Integrativní model multiorgánové predikce toxicity vyvolané léky pomocí dat genové exprese. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Vývoj v toxikogenomice: Pochopení a predikce toxicity vyvolané sloučeninou z dat genové exprese. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Konstrukce prediktivního modelu pro hodnocení toxicity více orgánů. Mol. Cell Toxicol. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamid a cyklofosfamid: Účinky na imunosurveillance. Onkologie 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benešic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloracetaldehydem a akroleinem indukovaná smrt buněk lidského proximálního tubulu. Pediatr. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Paleta, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; a kol. Nefrotoxicita ifosfamidu u dospělých pacientů. Clin. Ledviny J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamid/mesna. Přehled jeho antineoplastické aktivity, farmakokinetických vlastností a terapeutické účinnosti u rakoviny. Drogy 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Výsadba, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT studie fáze I o docetaxelu a ifosfamidu u pacientů s pokročilými solidními nádory. Br. J. Cancer. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Chronická nefrotoxicita ifosfamidu u dětí. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Laboratorní krysa; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Akutní jaterní toxicita ifosfamidem v léčbě sarkomu: Kazuistika. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Využití transkriptomiky k pochopení mechanismů toxicity vyvolané léky. Farmakogenomika 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transkriptomická analýza účinku ifosfamidu na buňky MDCK kultivované v mikrofluidních biočipech. Genomika 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathionová konjugace cytostatika ifosfamidu a úloha lidských glutathion S-transferáz. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 979-986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-merkaptoethansulfonát sodný) funguje jako regulátor myeloperoxidázy. Volný Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetylcystein zmírňuje oxidační stres a glutathion-dependentní redoxní nerovnováhu způsobenou vysokým obsahem glukózy/vysokým obsahem kyseliny palmitové v pankreatických Rin-5F buňkách. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, nový regulační faktor interferonu spojený s latencí viru Epstein-Barrové. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Viry a lymfomy. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Rozdílné role regulačního faktoru IFN (IRF)-3 a IRF-7 při aktivaci protinádorových vlastností lidských makrofágů. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Aktivace, regulace, modifikace a funkce. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 zeslabuje zánětlivé reakce prostřednictvím signální dráhy TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, MY; Tesař, BM; Goldstein, DR Stárnutí narušuje up-regulaci regulačního faktoru 7 IFN v plazmocytoidních dendritických buňkách během aktivace TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]