Střevní ochrana pomocí proanthokyanidinů zahrnuje antioxidační a protizánětlivé účinky ve spojení se zlepšením citlivosti na inzulín, homeostázy lipidů a glukózy, část 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Exprese teinu pomocí Western blotu. Obrázek 6 ukazuje, že přidání Fe/Asc k buňkám Caco-2/15 zvýšilo hladinu těchto dvou důležitých enzymů, ale PAC vyrovnaly jejich zvýšenou regulaci vyvolanou Fe/Asc.

Protože inzulínová signalizace moduluje procesy lipogeneze, oxidace FA a glukoneogeneze, bylo důležité prozkoumat vliv Fe/Asc a PAC na MAPK a PI3K/Akt, dvě hlavní inzulínové signální dráhy. Za tímto účelem byly buňky Caco-2/15 preinkubovány s inzulínem před další buňkou Caco{5}}/15

Obrázek 6. Účinky PAC na glukogenezi v buňkách Caco{1}/15. Proanthokyanidiny (PAC, 250 ug/ml) byly přidány do apikálního buněčného kompartmentu na 24 hodin před ošetřením Fe/Asc （200 μM/2 mM） po dobu 6 h při 37 stupních. Proteinová exprese (A) G6Pázy a (B)PEPCK byla hodnocena pomocí Western blotu.cistanche prášekVýsledky představují průměr ± SEM ze 3 nezávislých experimentů, každý v triplikátech. Je ukázán reprezentativní Western blot ilustrující experiment v triplikátech na stejném gelu a při stejné expozici.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">kořen cistancheG6Pase glukózo-6-fosfatáza, PEPCK fosfoenolpyruvátkarboxykináza.

Kliknutím sem se dozvíte více

ošetření za účelem aktivace signální dráhy. Zatímco Fe/Asc zvýšily expresi proteinu p38-MAPK a poměr fosfop38-MAPK/p38-MAPK, PAC těmto akcím zabránily (obr. 7A-C). Na druhou stranu zatímco Fe/Asc snižovalo proteinovou hmotnost fosfo Akt (pAkt) a poměr Akt/Akt, PAC vykazovaly schopnost udržovat svou normální hladinu. Podobný trend byl zaznamenán u PI3K (obr. 7D-I. Tato pozorování tedy podporují příznivou roli PAC v inzulínové signalizaci.

Diskuse

Polyfenoly jsou dobře známé pro své pleiotropní biologické a léčivé účinky, což vysvětluje přitažlivost mnoha vědců a potravinářského průmyslu k těmto fascinujícím přírodním produktům rostlinného původu. PAC vynikají rozmanitostí a vysokým počtem polyfenolů díky svým farmakologickým a terapeutickým dopadům na chronické poruchy2021. Navzdory jejich chvályhodným vlastnostem je stále mnoho neznámého o jejich vlivu na GI trakt, který využívá rozšířené trávicí, imunologické, neuronální a metagenomické sítě2.cistanche spánekZ tohoto důvodu bylo v tomto výzkumu věnováno úsilí objasnit roli PAC ve střevním OxS, antioxidační obraně, zánětu, oxidaci FA, lipogenezi a glukoneogenezi a zároveň se pokoušet objasnit základní mechanismy, jako je signalizace inzulínu. a stav transkripčních faktorů.

Ke zkoumání účinků PAC jsme použili buněčnou linii Caco{0}}/15, oblíbený střevní model, který oceňuje především vědecká komunita2 a který je uznáván Úřadem pro potraviny a léčiva pro procesy příjmu a transportu4. Buňky Caco{4}}/15 se nejen spontánně diferencují na funkčně a morfologicky podobné lidské enterocyty3,25, ale také slouží k efektivnímu zkoumání střevní absorpce a interakcí, výživy, toxikologie, mikrobiologie potravin, testů biologické dostupnosti a screeningu propustnost léčiva v programu objevování2²627. Stejně jako v našich předchozích zprávách týkajících se různých témat28-3】 byla buněčná linie Caco{11}}/15 v současné studii nápomocna při odhalení potenciálu PAC regulovat různé metabolické dráhy. Důležité je, že v této studii byly buňky vysety na porézní filtry, které umožňovaly přístup na obě strany bipolárního střevního epitelu: apikální a bazolaterální kompartmenty odpovídající střevnímu lumenu nebo seróznímu oběhu. Navíc jsme předem inkubovali Caco-2 /15 buněk s Fe/Asc, protože tento systém byl v naší laboratoři vysoce relevantní pro vyvolání silného OxS a zánětu, které byly naopak vystaveny velkému spektru efektorů17,1932-3 Pozoruhodné, Fe/Asc jako silný kyslík -systém generující radikály způsobuje oxidační poškození biologických makromolekul, mění intracelulární redoxní prostředí a podílí se na řadě patologických stavů2.35,56.Naše zjištění ukazují významné zvýšení peroxidace lipidů (vysoké hladiny MDA) spolu se zranitelnou antioxidační obranou (nízké GPx a exprese proteinu SOD2).výhody cistanche tubulosaKromě toho, díky své schopnosti generovat peroxidy lipidů, komplex Fe/Asc podporuje zánět, jak dokazuje zvýšená exprese TNFa, COX2 a NF-is. Souhrnně současné výsledky potvrzují vznik radikálů a zánětů v reakci na Fe/Asc

Přítomnost PAC působila proti peroxidaci lipidů zprostředkované Fe/Asc. Protože selhání antioxidační obrany by mohlo vysvětlit indukci OCS, zkoumali jsme její působení na endogenní antioxidační enzymy. Ve skutečnosti byly PAC schopny obnovit pokles SOD2 a GPx zprostředkovaný Fe/Asc. Abychom popsali mechanismus exacerbace OxS pomocí Fe/Asc a zmírnění pomocí PAC, hodnotili jsme signální dráhu Keap1-NRF2-antioxidant response element (ARE), která je považována za nejsilnější endogenní antioxidant. regulátor 37.cistanche čajNRF2 je buněčný OCS senzor, jehož funkcí je udržovat redoxní homeostázu. V normálních podmínkách. NRF2 je kontinuálně ubikvitinován a zacílen na proteasomální degradaci svým negativně vázaným regulátorem Keap18. V přítomnosti endogenních a exogenních efektorů je Keapl inaktivován a downregulován, čímž se narušuje interakce Keapl-NRF2 a uvolňuje se NRF2, který se translokuje do buněčného jádra, váže se na promotory obsahující

Obrázek 7. Účinky PAC na citlivost na inzulín v buněčné linii Caco{1}}/15. Proanthokyanidiny (PAC, 250 ug/ml) byly přidány do apikálního buněčného kompartmentu po dobu 24 hodin před ošetřením Fe/Asc (200 uM/2 mM) po dobu 6 hodin při 37 stupních. Dvě hodiny před koncem 6h inkubace se směsí Fe/Asc byl přidán inzulín (100 nM), aby se vyhodnotila citlivost na inzulín. Proteinová exprese (A) p38-MAPK, (B) fosforu p38-MAPK, (D)Akt, (E)fosfo Akt, (G) PI3k a (H) fosfo PI3k byla hodnoceno Western blotem. Poté byly vypočteny poměry (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, (F)fosfo Akt/Akt a (Dfosfo PI3k/PI3k. Výsledky představují průměr ± SEM ze 3 nezávislých experimentů každý v duplikátech. Je ukázán reprezentativní Western blot ilustrující experiment v triplikátech na stejném gelu a se stejnou expozicí.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE a urychluje transkripci antioxidačních enzymů39. Podle našich údajů ošetření buněk Caco-2/15 pomocí PAC potlačilo Keapl a pravděpodobně umožnilo NRF2 translokovat se do jádra umožňující vazbu na ARE (core sekvence: 5'TGACnnnGC3') v promotorové oblasti antioxidačních genů (SOD2 a GPx), což vede ke stimulaci jejich transkripce a koordinované up-regulaci. V souladu s těmito údaji sloučenina fenolického resveratrolu zabránila OxS v H,O,-léčených synoviocytech revmatoidní artritidy fibroblastům podobným tím, že podporovala expresi NRF2 a snižovala expresi Keap12. Navíc podle Kanzakiho et al může být aktivace antioxidačních a cytoprotektivních enzymů spojena s poměrem NRF2/Keapl1.

Jak se očekávalo od zlepšení OCS, PAC významně snížily zánět, jak dokazuje downregulace TNFa a COX2. Protože NF-KB je klíčovým regulátorem prozánětlivých cytokinů, zkoumali jsme jeho odpověď na PAC. V souladu s trendem zánětlivých látek PAC zrušily indukci NF-KB zprostředkovanou Fe/Asc a snížily poměr NF-KB/IikB. Můžeme tedy rozumně předpokládat, že PAC pomáhají chránit před zánětem, který ohrožuje funkce střevních buněk, prostřednictvím kontroly NF-kB, hlavního regulátoru zánětlivé reakce. Stojí za zmínku, že PAC mohou chránit před zánětem stimulací buněčných antioxidačních obranných mechanismů, protože existuje úzký vztah mezi biomarkery redoxní nerovnováhy a zánětu2.

Cílem této studie bylo prozkoumat účinky Pac na homeostázu střevních lipidů. Naše zajímavá zjištění ukázala, že PAC upregulovaly CPTla na jedné straně a downregulovaly FAS, které představují biomarkery oxidace FA a lipogeneze, v daném pořadí. Proto jsou tyto enzymy potenciálními cíli PAC, což ukazuje na polyfenolický potenciál bránit akumulaci lipidů, což je považováno za patologický projev zánětu OxSand v mnoha tkáních*3. Molekulární mechanismy pravděpodobně souvisí s upregulací PPARa a downregulací SREBPlc, dvou transkripčních faktorů, které regulují metabolismus lipidů. FAS je centrální enzym v lipogenezi, zodpovědný za katalýzu přeměny malonyl-CoA na FAs45. Na své straně ACC katalyzuje tvorbu malonyl-CoA, základního substrátu pro FAS. V souladu s našimi zjištěními bylo také zjištěno, že polyfenoly Solanum nigrum snižují FAS a SREBP, zatímco zvyšují CPTla a PPARa v hepatocytech ošetřených kyselinou olejovou“6.

Mechanismy působení polyfenolů jsou obecně spojeny s aktivací fosforylace AMPKa7. Důležité je, že fosforylovaná AMPKa v naší studii byla snížena Fe/Asc, ale stimulována PAC, což vysvětluje downregulaci fosfo ACC, což vede k inhibované lipogenezi a zvýšenému energetickému metabolismu. Proteinová exprese AMPKa však byla zvýšena Fe/Asc-indukovaným OxS v buňkách Caco2/15. V souladu s tím mohou ROS a OxS indukovat AMPKa prostřednictvím různých upstream kináz8.

OCS a zánět silně indukují inzulínovou rezistenci a další metabolické poruchy9,50, což nás přimělo posoudit Pacovu schopnost regulovat některé klíčové proteiny ve vztahu k signální dráze inzulínu. Nejprve jsme se zaměřili na p38-MAPK, u kterého bylo zjištěno, že jeho exprese je regulována směrem nahoru pomocí OxS, zatímco interferuje se signální kaskádou inzulínového receptoru. Obě analýzy fosforylace p38-MAPK a výpočet poměru fosfop38-MAPK/p38-MAPK odhalily významný nárůst v reakci na Fe/Asc, což je kompatibilní s narušeným IS v Caco{ {6}}/15 buněk. Validace byla získána poklesem pAkt a PI3K. Naproti tomu PAC zvrátily trend, protože vykazovaly schopnost snížit fosforylaci p38-MAPK a poměr fosfop38-MAPK/p38-MAPK a zároveň zlepšit signální dráhu PI3K/Akt, o kterém je známo, že zprostředkovává hlavní biologické účinky inzulínu regulací transportu glukózy, syntézy proteinů, buněčné proliferace, přežití buněk a glukoneogeneze. Poškození IS v důsledku OxS a chronického zánětu může také ovlivnit proces glukoneogeneze3,54. Analýza dvou hlavních enzymů zapojených do de novo syntézy glukózy (PEPCK, G6Pase) odhalila významné zvýšení odpovědi na Fe/Asc, zatímco podávání PAC je vrátilo zpět na normální hladiny v buňkách Caco2/15.

Závěrem lze konstatovat, že četné studie ve vědecké literatuře nepřímým důkazem prokazují významné zdravotní účinky fenolických sloučenin buď jako specifické fenolické molekuly nebo směsi několika polyfenolů. Tato práce poukazuje na zásadní účinek PAC (komplexních flavanolů) na střevní homeostázu tím, že brání OxS, zánětům a souvisejícím metabolickým poruchám. Vzhledem k tomu, že PAC nemusí být úplně absorbovány tenkým střevem, jsou zapotřebí další studie, aby se prozkoumaly mechanismy podílející se na jejich příznivých zdravotních účincích v tenkém střevě.

materiály a metody

Kultivace a léčba buněk střevního Caco{0}}/15. Pro všechny experimenty jsme použili buněčnou linii lidského epiteliálního kolorektálního adenokarcinomu Caco-2/15, stabilní klon rodičovských buněk Caco{4}} (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), který byl získán od Dr. JF Beaulieu (Katedra buněčné biologie, Lékařská fakulta, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Kanada). Buněčná linie Caco{5}}/15 má jedinečnou vlastnost diferencovat se in vitro na polarizované zralé enterocyty a vytvořit nepropustný mono-over. Buňky Caco-2/15 byly kultivovány, jak je popsáno dříve323455, a použity pro studium buněčné integrity, OCS a zánětu17,19 a IS56.

Analýza exprese proteinů imunoblotováním. Po inkubaci s různými úpravami byly buňky Caco{0}/15 lyžovány v ledově chladném pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1 procento NP -40, 1 procento deoxycholátu, 2,5 mM pyrofosfátu sodného, ​​1 mM Na2VO4, 1 ug/ml leupeptinu a 1 mM PMSF. Koncentrace proteinu každého vzorku byla stanovena pomocí Bradfordovy metody (Bio-Rad). Proteiny byly poté denaturovány po dobu 5 minut ve vzorkovém pufru obsahujícím SDS a ß-merkaptoethanol. Homogenáty obsahující 15 ug celkových proteinů byly separovány na 10% SDS-polyakrylamidovém gelu podle molekulových hmotností proteinu a byly elektroblotovány na nitrocelulózové membrány. Mléko bez tuku bylo použito k blokování nespecifických míst membrán před přidáním primárních protilátek přes noc při 4 stupních. Ředění protilátek je uvedeno v doplňkových informacích a v naší nedávné publikaci. Reaktivní pásy byly zachyceny pomocí ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Všechna data jsou vyjádřena jako poměr cílového proteinu k -aktinu ve stejném vzorku.

Statistická analýza. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM z alespoň tří různých experimentů provedených trojmo. Data byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA a následně Tukeyho několika srovnávacími testy pomocí PRISM 7.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Rozdíly byly považovány za významné u P<>

Tento článek je převzat z Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5