Imunostimulační protilátkové konjugáty vyvolávají silnou myeloidní aktivaci a trvanlivou protinádorovou imunitu（část 1）

Pro více informací prosím kontaktujtedavid.wan@wecistanche.com

Abstraktní

Receptory přirozeného rozpoznávání vzorů, včetně receptorů podobných toll (TLR), mohou změnit mikroprostředí nádoru a připravit adaptivní protinádorovou imunitu.Agonisté TLR však nebyli dobře tolerováni kvůli toxicitám spojeným s rozšířenou imunitní aktivací po systémovém podání.Navrhnout terapeutikum, které je vhodné pro systémové podávání aschopné vyvolat reakci cílenou na nádor, vyvinuli jsme novou třídu konjugátů protilátek stimulujících imunitu (ISAC) obsahujících agonistu TLR7/8 konjugovaného s protilátkami cílenými na nádor.Systémově podávané anti-HER2 ISAC byly dobře snášeny in vivo a vyvolaly silnou aktivaci intratumorálních myeloidních buněk, což vedlo k odstranění nádoru a následné imunologické paměti.Účinnost in vitro a účinnost in vivo vyžadovala tandemovou aktivitu řízenou neporušenou funkčností Fc a agonismem TLR, aby se umožnila fagocytóza a protinádorová imunita zprostředkovaná T buňkami.Imunologická paměť zprostředkovaná ISAC nebyla omezena na HER2, protože myši léčené ISAC byly chráněny před opětovným napadením HER2-negativním nádorem.Tyto výsledky poskytují silné odůvodnění pro klinický vývoj ISAC a ukazují, že synergie mezi signalizací FcR a TLR7/8 přispívá k mechanismu protinádorové imunity zprostředkované ISAC.

Kliknutím sem se dozvíte více o Cistanche

Úvod

Před koncem 20. století měli pacienti s rakovinou obecně k dispozici tři léčebné modality: chirurgickou resekci, ozařování a chemoterapii. Vznik imunoterapie rakoviny přidal silnou čtvrtou modalitu, která značně rozšířila onkologický repertoár počínaje schválením rituximabu pro non-Hodgkinův lymfom a sahající až k širokému přijetí inhibitorů kontrolních bodů 1,2. Jakákoli terapie, včetně imunoterapie, je však dočasně omezena, pokud nevyvolává trvalé biologické a imunologické odpovědi, které překonávají heterogenitu nádoru a mutační zátěž 3–5. Inhibitory kontrolních bodů, jako jsou protilátky anti-PD{7}} a PD-L1, dramaticky zlepšují výsledky v několika indikacích, včetně pacientů s vysokou mutační zátěží nádoru nebo mikrosatelitní nestabilitou, a jedním z určujících faktorů citlivosti nádoru na imunoterapii kontrolního bodu je rozsah pre -existující infiltrace T lymfocytů. Pacienti s „studenými“ nádory, které mají řídký infiltrát T buněk, hůře reagují na blokádu kontrolních bodů a mají horší prognózu ve srovnání s pacienty s „horkými“ nádory, kde jsou v nádorovém mikroprostředí (TME) přítomny imunosuprimované nádorově reaktivní T buňky 6,7 . Biopsie nádoru a imunohistochemie ukazují, že profesionální buňky prezentující antigen (APC), jako jsou dendritické buňky (DC), jsou v TME často častější než T buňky, i když jsou stále citlivé na imunosupresivní mechanismy 8,9. Vzhledem k přítomnosti myeloidních buněk v TME a jejich úloze při podpoře aktivace T lymfocytů se zvyšuje úsilí vyvinout terapie, které aktivují APC asociované s nádorem, aby vyvolaly rozšířenou imunitu T lymfocytů a účinnou protinádorovou imunitní odpověď.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 dárců. (d) Rituximab reagoval se SATA prostřednictvím lysinových zbytků, aby se volné aminy přeměnily na chráněné sulfhydrylové skupiny před deacetylací hydroxylaminem a následnou reakcí s T785-MCC za získání rituximab-ISAC. (e) LC-MS analýza rituximab-ISAC po ošetření PNGázou F. DAR byla vypočtena na základě hmotnostního přídavku linker-agonista 606 g/mol. (f) Fluorescenčně značený rituximab nebo rituximab-ISAC byl inkubován s nádorovými buňkami CD20 plus Toledo při 4 stupních po dobu 2 hodin před analýzou pomocí průtokové cytometrie. Data jsou z 1 experimentu s trojitými vzorky a jsou reprezentativní pro 2 experimenty.(gh) Čerstvě izolované lidské myeloidní APC byly kultivovány s rituximabem, T785, rituximabem a T785 nebo rituximab-ISAC v přítomnosti nádorových buněk CD20 plus Toledo značených CFSE v poměru efektoru k cíli 3:1. Koncentrace rituximabu je znázorněna na ose X, přičemž koncentrace T785 v těchto testech je konzistentní s množstvím T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 dárců (průměr a SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Nyní je dobře zdokumentováno, že lokální podávání imunostimulačních činidel v preklinických modelech může přeprogramovat suprimované nádorové rezidentní APC na aktivované buňky schopné zpracovat a prezentovat nádorově asociované antigeny, včetně neoantigenů, T buňkám, které následně zprostředkovávají protinádorovou imunitu 10–13 . Jedna taková strategie propagovaná Carmi et al prokázala, že intratumorální podávání alogenních protilátek cílených na nádor s agonistou Toll-like receptoru (TLR)-3 nebo s TNF a CD40L funkčně zachráněnými APC asociovanými s nádorem, což vede ke zvýšenému vychytávání antigenu a následné navození protinádorové T buněčné imunity. Tato kombinační strategie, která využívala efektorovou funkci protilátky s agonistou TLR, vedla k eradikaci primárních nádorů a metastatických lézí a chránila hostitele před recidivou nádoru 11,14. Podobně agonistická anti-OX40 protilátka v kombinaci s agonistou TLR9, CpG, aktivovala APC a T buňky v nádoru, což má za následek působivou účinnost proti více typům nádorů u myší 13. Účinná translace strategií aktivace APC do klinické praxe zkoumáno v mnoha indikacích s klinickými údaji u pacientů s melanomem, které naznačují, že intranádorové podávání agonistů TLR9 v kombinaci s anti-PD-1 protilátkou může vést ke zmenšení nádoru a abskopálním odpovědím u lézí bez injekcí 15. Podobně skupiny sledují agonisty TLR7/8 pro nádorovou imunoterapii, protože expresní vzorec TLR7/8 v lidských APC více zrcadlí expresní vzorec TLR7 a TLR9 v myších APC16–18. V konečném důsledku bude přijetí strategií intratumorálního podávání, pokud jsou účinné, omezeno dostupností nádoru, protože systémové podávání imunitních agonistů cílených na APC bylo omezeno toxicitou, krátkými poločasy a suboptimálním podáváním do cílových míst.Naším cílem bylo navrhnout imunostimulační protilátkový konjugát (ISAC) obsahující nádorově zacílenou monoklonální protilátku konjugovanou s imunitním agonistou jako nový terapeutický přístup k vyvolání trvalé protinádorové imunity. Systémové podávání ISAC vyvolalo lokalizovanou aktivaci APC v TME, která byla závislá na Fcefektorové funkce a aktivace TLR při obcházení typických toxicit spojených se systémovým dodáváním agonistů TLR. Kromě toho systémové podávání těchto konjugátů myším nesoucím nádor umožnilo zpracování antigenu a prezentaci T buňkám, což vedlo k trvalé protinádorové imunitě v mnoha modelech, které jsou odolné vůči nekonjugované protilátce zacílené na nádor.

Výsledek

Návrh a charakterizace ISAC Pro umožnění konjugace agonisty TLR s protilátkou byly použity nástroje pro molekulární dokování k navržení nového agonisty TLR7/8 (T785) s butylaminem, který sloužil jako bod připojení k protilátce přístupný rozpouštědlu ( Obrázek 1A, Doplňkový obrázek 1A–C). T785 zapojil lidský TLR7 s EC50 0,643 μM a lidský TLR8 s EC50 1,60 μM v buněčných liniích HEK293, které koexprimují reportér sekretované alkalické fosfatázy indukovatelný NF-KB a buď TLR7 nebo TLR8 (obrázek 1B ). Specifičnost T785 pro TLR7/8 byla potvrzena neschopností T785 indukovat aktivitu NF-KB v reportérových buňkách HEK293, které postrádají expresi TLR7/8 (doplňkový obrázek 2A). Pro potvrzení agonistické aktivity v primárních buňkách byly čerstvě izolované monocyty a DC, nazývané myeloidní APC (~96 procent monocytů, 4 procenta DC; doplňkový obrázek 3A), které exprimují TLR7 i TLR8, přes noc stimulovány pomocí 1 μM T785 nebo R848, a dobře zavedený a charakterizovaný agonista TLR7/8 19. T785 a R848 stimulovaly myeloidní APC v podobném rozsahu (obrázek 1C) 20,21. Aktivita T785 byla také potvrzena v čerstvě izolovaných lidských plazmacytoidních DC (pDC), které exprimují TLR7, ale ne TLR8 (doplňkový obrázek 2B). Aby se prozkoumaly účinky ISAC v lidských kulturách in vitro, byl vytvořen ISAC s rituximabem (obrázek 1D), klinicky ověřenou anti-CD20 monoklonální protilátkou používanou k léčbě malignit B buněk, konjugací s T785 ve vícestupňové reakci. s kompatibilními heterobifunkčními zesíťovacími činidly 22. Účinnost konjugace T785-ISAC byla měřena pomocí LC-MS po deglykosylaci PNGázou F, což vedlo k průměrnému poměru léčivo-protilátka (DAR) 1,71 (obrázek 1E). Potvrdili jsme, že ISAC si zachoval srovnatelnou vazbu k CD20 po experimentech průtokové cytometrie s toledskou nádorovou buněčnou linií exprimující CD20-, dobře charakterizovanou buněčnou linií odvozenou od pacienta s difuzním velkobuněčným lymfomem (obrázek 1F) 23. T 785-Vazba ISAC na lidské receptory Fc (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) byla hodnocena pomocí Biacore a byla srovnatelná s rituximabem (doplňková tabulka 1). ISAC aktivují lidské myeloidní APC Imunostimulační potenciál rituximabu T{{77 }} ISAC byl hodnocen po společné kultivaci čerstvě izolovaných lidských myeloidních APC s CFSE-značenými CD20 plus Toledo nádorovými buňkami po dobu 18 hodin. Myeloidní APC kultivované s rituximabem T785-ISAC prodělaly rychlé morfologické změny v souladu s morfologií DC, zatímco morfologie DC nebyla pozorováno v kokulturách inkubovaných s rituximabem, T785 nebo ekvimolární směsí rituximabu a T785 (obrázek 1G). APC stimulované rituximabem T785-ISAC zůstaly životaschopné a dendritické v morfologii po dobu až osmi dnů, zatímco APC stimulované směsí byly většinou neživotaschopné do osmého dne (obrázek 1H). Vícebarevná průtoková cytometrická analýzapo 18 hodinách ukázalo, že APC stimulované rituximabem T785-ISAC downregulovaly CD14 a CD16 a současně upregulovaly CD123, což je buněčný povrchový markerbýt up-regulovány na aktivovaných myeloidních DC 24. Naopak APC stimulované rituximabem,T785 nebo směs nemodulovaly expresi těchto markerů (obrázek 11, doplňkový obrázek 4A, strategie hradlování popsaná na doplňkových obrázcích 3BC).

Lidské APC stimulované rituximabem T785-ISAC také upregulovaly kostimulační molekulu CD86 způsobem závislým na dávce, přičemž podobné trendy byly pozorovány u upregulace CD40 a HLA-DR v souladu s fenotypem aktivovaných APC (obrázek 1I & Doplňkový obrázek 4B). Změny v expresi povrchového markeru závislé na dávce byly konzistentní, ať už byly hodnoceny jako střední intenzita fluorescence (MFI, obrázek 1) nebo jako procento celkové populace buněk, které je pozitivní pro příslušný marker (doplňkový obrázek 5). Následná analýza bezbuněčných supernatantů ukázala, že APC stimulované rituximabem T785-ISAC vylučovaly vyšší množství TNF a IL-1 (obrázek 2J a doplňkový obrázek 4C). Imunostimulační potenciál T785-ISAC nebyl omezen na rituximab, protože T785-ISAC generovaný s trastuzumabem také vyvolal zvýšenou myeloidní aktivaci (doplňkový obrázek 4D). Schopnost ISAC stimulovaných APC vyvolat prezentaci antigenu a zkřížené aktivace CD8 plus T buněk byla hodnocena pomocí antigenního systému modelu ovalbuminu (OVA) 25,26. Slezinné CD11c plus DC izolované z myší divokého typu byly kultivovány přes noc s imunitními komplexy vytvořenými s OVA a buď anti-OVA protilátkou nebo ISAC. DC nabité OVA byly kvantifikovány a inkubovány s OT-I CD8 plus T buňkami nesoucími TCR specificitu pro OVA peptid, SIINFEKL, v komplexu s MHC-I. Anti-OVA ISAC zprostředkovaná zvýšená zkřížená prezentace, měřená množstvím MHC-I, navázaného peptidu SIINFEKL, a zvýšená zkřížená aktivace měřená proliferací CD8 plus T buněk (doplňkové obrázky 6A a 6B). ISAC vyvolávají amplifikovanou TLR a Fc R-asociovaná intracelulární signalizace v lidských myeloidních APC Aktivace Fc R a TLR indukuje komplexní fosfo-signalizační kaskádu a velikost a charakteristiky těchto reakcí se liší mezi různými podskupinami imunitních buněk 27. Zkoumali jsme downstream intracelulární signální dráhy zapojené do různých buněčné typy v PBMC-nádorových kokulturách stimulovaných rituximabem T785-ISAC ve srovnání s kontrolami ekvimolární směsi pomocí hmotnostní cytometrie (CyTOF) 28. Podskupiny leukocytů (tj. monocyty, CD4 plus T buňky) byly identifikovány pomocí shlukování SPADE pomocí markerů linie s cílovými buňkami zahrnujícími jak nádorové buňky CD20 plus Toledo, tak zdravé B buňky 29. Fosforylační děje spojené se signalizací TLR (pIRF7) a FcR (pERK1/2) byly zvýšeny 15 minut po stimulaci T785-ISAC v monocytech a cDC ve srovnání se směsí jednotlivých složek 30,31. Intracelulární signalizace byla z velké části omezena na buňky myeloidního původu (monocyty a cDC) a také na pDC, kterévšechny exprimují požadované FcRs a TLR7 a/nebo TLR8. V monocytech a cDC vedla stimulace indukovaná ISAC také k významně vyšší fosforylaci MAPKAPK2, p38, CREB a ribozomálního proteinu S6 (RPS6), což je požadavek pro zahájení následné syntézy proteinů (obrázek 2A–C a doplňkový obrázek 7A). CD141 plus cDC a CD1c plus cDC vykazovaly srovnatelné hladiny pIRF7 v obou podskupinách CDC, zatímco hladiny RPS6 a pERK1/2 měly vyšší tendenci v CD141 plus cDC, které vynikají v primingu CD8 plus T buněk a křížové prezentaci antigenu, ve srovnání s CD1c plus cDC (doplňkový obrázek 7B).

Kinetika stimulace T785-ISAC byla v souladu s očekávanou dynamikou signalizace: fosforylace ERK1/2 dosáhla vrcholu po 5 minutách, zatímco její následný partner RPS6 nedosáhl vrcholu fosforylace až do 15-minutového časového bodu (doplňkové Obrázek 7C). Tato kinetika podporuje očekávanou dynamiku, jak se signalizace šíří v průběhu času, a naznačuje, že existuje trvalá a zesílená signalizační odpověď na stimulaci APC ISAC. Vzhledem k zesílené reakci pozorované po stimulaci ISAC spojené se signálními cestami Fc R a TLR jsme dále použili algoritmy podmíněného odhadu vzájemných informací s převzorkovanou hustotou (DREMI) a podmíněné vizualizace s přepočtenou hustotou (DREVI) ke kvantifikaci síly párových vztahů v rámci signální dráhy FcR a TLR 32. Tyto algoritmy generují grafy DREVI pro vizualizaci, kde plocha pod křivkou (AUC) je indikátorem celkové intenzity signálu, inflexní bod (IP) je mírou aktivačního prahu a DREMI skóre kvantifikuje párovou závislost dvou dotyčných fosfoproteinů. Tato analýza identifikovala zvýšené skóre DREMI svědčící o zvýšené párové závislosti mezi proteiny spojenými se signálními dráhami FcR a TLR po stimulaci T785-ISAC ve srovnání s kontrolami ekvimolární směsi (obrázek 2D). Silná vzájemná závislost mezi pERK1/2 a pIRF7 byla jednoznačně pozorována po stimulaci T785-ISAC, ale ne směsí, jak naznačuje zvýšené skóre DREMI, zesílená intenzita signálu a snížený aktivační práh potřebný pro fosforylaci IRF7 (obrázek 2D ). Tato analýza také ukázala snížený aktivační práh potřebný k zahájení translace proteinu (fosforylace RPS6) po stimulaci ISAC, jak bylo kvantifikováno zvýšeným skóre DREMI a sníženými IP pro párové kombinace pERK1/2-pRPS6 a pIRF7-pRPS6 . Kromě toho byla hladina fosforylace RPS6 zesílena jako výsledek fosforylace ERK1/2 nebo IRF7, jak bylo určeno zvýšenými párovými AUC (obrázek 2D). Tyto kombinované výsledky nejen potvrzují signalizaci ISAC prostřednictvím očekávaných drah FcR a TLR, ale navíc podporují synergii mezi těmito dvěma cestami, což vede ke snížení prahů aktivace a zesílení intenzity signálu.

Obrázek 3: ISAC vyžadují funkci Fc efektoru a agonistu TLR ke zprostředkování myeloidní aktivace. Čerstvě izolované lidské myeloidní APC byly kultivovány po dobu 18 hodin v přítomnosti nádorových buněk CD20 plus Toledo v poměru efektoru k cíli 3:1 a (a) 80 nM rituximab-ISAC s nebo bez 1 μM R406, (b) rituximab-ISAC na uvedeném izotypu protilátky, (c) rituximab-ISAC nebo deglykosylovaný rituximab-ISAC (ISAC-deglykosylovaný). (ac) Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií a data jsou uváděna jako střední intenzita fluorescence. (d) Reportérové ​​buňky HEK-Blue-TLR7 nebo TLR8 byly kultivovány po dobu 18 hodin v přítomnosti T785 nebo TLRnull před hodnocením aktivity SEAP indukované NF-KB. Zobrazené údaje jsouz 1 experimentu a reprezentativní z alespoň 3 experimentů. (e) Čerstvě izolované lidské myeloidní APC byly kultivovány po dobu 18 hodin v přítomnosti nádorových buněk CD20 plus Toledo a uvedených rituximab-ISAC a analyzovány průtokovou cytometrií (data uvedena jako mediánintenzita fluorescence). (ae) Uvedená data jsou reprezentativní pro 1-4 další experimenty a větší nebo rovné 3 dárcům pro každý experiment (průměr a SEM). Statistická významnost je definována jako *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC vyžadují funkci Fc efektoru ke zprostředkování aktivace myeloidních APC Příspěvek aktivity Fc k funkci ISAC byl zkoumán po ablaci downstream signalizace FcR pomocí R406, malomolekulárního inhibitoru kinázy Syk, který zabraňuje přenosu signálu downstream od aktivačního Fc Rs 33,34 . Přidání R406 zrušilo aktivaci myeloidů zprostředkovanou T785-ISAC, jak dokazuje nepřítomnost upregulace kostimulační molekuly CD86, ale nezměnilo buněčnou odpověď na aktivaci TLR7/8 pomocí T785 (obrázek 3A & Doplňkový obrázek 8). Inhibice Syk pomocí R406, která také zrušila signalizaci, byla pozorována u monocytů po stimulaci T785-ISAC, svýznamně snížily naměřené hladiny fosforylovaných MAPKAPK-2, ERK1/2 a IRF7 (doplňkový obrázek 7D).Vzhledem k těmto údajům byly rituximab T785-ISAC formulovány se srovnatelnými DAR na každém ze čtyř přirozeně se vyskytujících izotypů, aby se definoval rozsah, v jakém se aktivita T785-ISAC liší se známými vazebnými afinitami FcR 35,36. Byly také zkoumány aglykosylované a fukosylované ISAC rituximabu, protože glykosylace odstraňuje vazbu FcR, zatímco fukosylace zvyšuje vazebnou afinitu pro FCGR3A 37. Imunostimulační kapacita rituximabu T785-ISAC korelovala s afinitou izotypu FcR protilátky 3B). Naopak fukosylované IgG1 (IgG1-AF), divokého typu IgG1 a IgG3 T785-ISAC vyvolaly myeloidní aktivaci, přičemž IgG1-AF T785-ISAC indukovaly nejvyšší úrovně upregulace CD86 (obrázek 3B). Deglykosylace rituximabu T785-ISAC divokého typu pomocí PNGázy F, která snižuje vazebnou afinitu Fc-FcR, vedla ke snížení imunitní stimulační aktivity ISAC in vitro, což podporuje důležitost funkčně aktivní oblasti Fc (obrázek 3C).

ISAC vyžadují agonismus TLR ke zprostředkování myeloidní aktivace Příspěvek aktivity TLR k funkci ISAC byl zkoumán po ablaci agonismu TLR odstraněním 2-aminopyridinu z T785, o kterém se předpokládá, že tvoří solný můstek s kritickými zbytky aspartátu ve vazbě kapsy TLR7 a TLR8 38 (TLRnull, obrázek 3D). Sloučenina TLRnull byla konjugována s rituximabem (TLRnull ISAC) a testován na myeloidní aktivační potenciál v přítomnosti CD20 plus nádorových buněk in vitro. TLRnull ISAC neindukoval upregulaci kostimulační molekuly CD86 ani nemoduloval expresi CD14 nebo CD123, což naznačuje, že agonismus TLR je potřebný pro aktivační fenotyp pozorovaný u T785-ISAC (obrázek 3E). Kromě toho TLRnull ISAC neindukoval fosforylaci IRF-7 v monocytech, což je v souladu s jeho neschopností zapojit TLR7/8 (doplňkový obrázek 7E). Systémově podávaný trastuzumab T785-ISAC eliminuje nádory v nepřítomnosti Aktivita B, T nebo NK buněk v modelech lidských xenograftových nádorů Schopnost ISAC indukovat myeloidně a neutrofily zprostředkovanou destrukci pevných nádorů v nepřítomnosti B, T a NK buněčné aktivity byla hodnocena za použití lidských xenograftových modelů 39,40. Trastuzumab, klinicky ověřená HER{20}}cílová protilátka, byla vybrána pro zkoumání, aby se zjistilo, zda trastuzumab T785-ISAC může překonat nádorovou rezistenci vůči trastuzumabu v modelech HER2 plus solidní nádory (obrázek 4 a doplňkový obrázek 9 ) 41,42. Nejprve bylo porovnáno systémové podávání trastuzumabu T785-ISAC s intratumorální aplikací směsi trastuzumabu a T785. Trastuzumab T785-ISAC vyvolal regresi a clearance nádoru, zatímco podávání ekvimolární směsi složek poskytlo minimální terapeutický přínos ve srovnání se samotným trastuzumabem (obrázek 4A). Následné studie porovnávající nádorově zacílené ISAC s jejich vhodnými izotypovými kontrolami potvrdily, že protinádorová aktivita vyžaduje nádorové zacílení (obrázek 4B a doplňkový obrázek 10). Důležité je, že systémové podávání trastuzumabu T785- ISAC a jeho izotypová kontrola byly dobře tolerovány s minimálním dopadem na tělesnou hmotnost (doplňkový obrázek 11).Aby se určilo, zda je mechanismus účinku přispívající k účinnosti ISAC in vivo podobný mechanismu popsanému in vitro, byly testovány Fc-inkompetentní (trastuzumab N297A-ISAC) a trastuzumab TLRnull-ISAC na stejném modelu xenograftu nádoru prsu vparalelně s divokým typem trastuzumabu T785-ISAC.Zatímco trastuzumab T785-ISAC vedl k regresi a clearance nádoru, Fc-inkompetentní ISAC ani TLRnull ISAC nedokázaly vyvolat protinádorovou aktivitu (obrázek 4C).Společně tato data naznačují požadavek na zacílení nádoru a zapojení FcR i TLR pro protinádorovou aktivitu ISAC.

Rozdílný příspěvek neutrofilů oproti jiným myeloidním buňkám při zprostředkování protinádorových účinků byl hodnocen buněčně specifickými deplecemi.Neutrofily byly depletovány pomocí protilátky Ly6G, zatímco deplece jak neutrofilů, tak nezralých APC (monocytů)bylo dosaženo s anti-Grl protilátkou.Fagocytární buňky byly depletovány pomocí lipozomů s obsahem klodronátu.Zjistili jsme, že fagocytární buňky, pravděpodobně makrofágy, významně přispěly ke zprostředkování protinádorové aktivity po léčbě ISAC (obrázek 4D).Deplece neutrofilů anti-Ly6G však neměla žádný dopad na účinnost ISAC.Deplece Gr1 neovlivnila okamžitě účinnost zprostředkovanou ISAC, ale zkrátila dobu trvání kontroly nádoru (obrázek 4D).Prozkoumat schopnost T785-ISAC kontrolovat růst nádoru u modelů s nižšíHER2 expresi, jsme dále modelovali účinnost na trastuzumab-rezistentním, HER2-středně exprimujícím nádorovém modelu, JIMT-1.Odhaduje se, že linie rakovinných buněk JIMT{0}} má přibližně 6,5 x 105 kopií povrchového HER2 a exprimuje sníženou hladinuHER2 ve srovnání s nádorovou buněčnou linií HCC1954 pomocí průtokové cytometrie 43.Zatímcotrastuzumab T785-ISAC významně zpomalil růst nádoru ve srovnání s izotypem ISAC nebo trastuzumabovými kontrolami, nebyla pozorována žádná regrese ani clearance nádoru (obrázek 4E).Předpokládali jsme, že pertuzumab, který se váže na epitop HER2 odlišný od vazebného místa trastuzumabu, zvýší Fc shlukování a následně zvýší ADCP a účinnost ISAC v modelu JIMT-1.Kombinace trastuzumabu T785-ISAC s pertuzumabem vedla k významně zvýšené účinnosti a významné regresi nádoru (obrázek 4F).Bez imunitní stimulace trastuzumabem T785-ISAC nepřinesla kombinace pertuzumabu s trastuzumabem žádný přínos.

Dále jsme zkoumali molekulární a buněčné události spouštěné trastuzumabem T785-ISAC, které v konečném důsledku vedou k protinádorové účinnosti.Časné změny genové exprese v nádorechbyly měřeny pomocí panelu imunitního profilování myší pan-cancer NanoString, který odhalil významnou upregulaci 13,7 procenta genů během 24 hodin po léčbě, včetně genů spojených se signalizací a aktivací TLR7 (IRF-7, geny spojené s NF-kB)ve srovnání s 0-0,1 procenta po léčbě trastuzumabem nebo izotypem T785-ISAC (obrázek 4G) 44.Analýza drah genové exprese hodnocená pomocí nSolver Advanced Analysis Pathway Score odhalila významnou upregulaci klíčových imunitně souvisejících genových signatur (funkce makrofágů, funkce DC, zpracování a prezentace antigenu), které bylyv souladu s in vitro a in vivo zjištěními, že interakce Fc-FcR jsou kritické pro aktivitu zprostředkovanou ISAC (obrázek 4H a doplňkový obrázek 12).Skóre genových signatur spojených s chemokiny a cytokiny bylo vysoce zvýšené po léčbě trastuzumabem T{0}}ISAC, což je v souladu s kvantifikací proteinu provedenou měřením sekrece cytokinů a chemokinů v nádoru 24 hodin po podání (obrázek 4Ha Doplňkový obrázek 13).Tato zjištění, v souladu s údaji o účinnosti in vitro a in vivo, naznačují, že ISAC indukuje silnou TLR- a FcR-zprostředkovanou odpověď.

Průtoková cytometrie a IHC byly použity k posouzení, zda zvýšená aktivace zprostředkovaná T785-ISAC a exprese chemokinů nakonec vedly k náboru imunitních efektorových buněk.Myeloidní imunitní infiltráty byly profilovány průtokovou cytometrií 24 hodin a 7 dní po podání jedné dávky trastuzumabu T785-ISAC nebo trastuzumabu a porovnány s neléčenými kontrolami.Analýza nádorů 24 hodin po léčbě odhalilainfiltrace CD11b plus Ly6C plus monocyty a CD11b plus Ly6G plus granulocyty v nádorech léčených trastuzumabem nebo trastuzumabem T785-ISAC ve srovnání s neléčenými kontrolami (obrázek 4I).Sedm dní po léčbě byly CD11b plus CD11c plus F4/80 plus pozitivní myeloidní APC významně zvýšeny ve skupině léčené trastuzumabem T785-ISAC ve srovnání strastuzumab nebo neléčené kontroly (obrázek 4I) 45,46.Toto zvýšení myeloidních APC může býtpřisuzováno významnému zvýšení produkce chemokinů souvisejících s myeloidem po léčbě trastuzumabem T785-ISAC.Zatímco v 24-hodinovém časovém bodě nedošlo k významnému zvýšení frekvence myeloidních APC, buňky tohoto fenotypu byly aktivovány po léčbě trastuzumabem T785-ISAC, jak bylo měřeno upregulací CD40 na buněčném povrchu ve srovnání se stejnou populací z trastuzumabu nebo neléčených kontrol (obrázek 4I).Toto zjištění spolu s daty NanoString dále prokazuje schopnost trastuzumabu T785-ISAC zapojit a aktivovat myeloidní buňky v mikroprostředí nádoru.Vzhledem k CD11b pozitivitě myeloidních APC pozorovaných jeden týden po léčbě může být časný infiltrát monocytů prekurzorem myeloidní populace APC, která dozrává v nádorech léčených ISAC, ale nikoli v nádorech léčených trastuzumabem.Zbývá však určit, jak prozánětlivé proximální události měřené 24 hodin po stimulaci ISAC pomocí NanoString a MSD nakonec ovlivnily distální události, jako je zrání myeloidních buněk v transformujícím se mikroprostředí nádoru v pozdějším 6-denním časovém bodě a nakonec ovlivnil regresi a clearance nádoru.
Nakonec byla provedena IHC k posouzení přítomnosti a umístění klíčových populací imunitních buněk v nádoru po léčbě trastuzumabem T785-ISAC ve srovnání s jeho kontrolami.V souladu s průtokovou cytometrií 7. dne byly buňky exprimující F4/80 vnádor a peritumorální oblast byly zvýšeny 9. den po jediné léčbě trastuzumabem T785-ISAC (obrázek 4J).Kromě toho cílená léčba ISAC vedla k dramatickému nárůstu buněk CD11c plus v peritumorální oblasti, který nebyl pozorován po léčbě protilátkou rHER2 nebo léčbě izotypem nebo izotypem-ISAC (obrázek 4J).Zvýšení v CD11c plus buňkách jak průtokovou cytometrií, tak IHC bylo také prokázáno v datech NanoString, ve kterých byla mRNA exprese ITGAX významně zvýšena 6. a 9. den po podání trastuzumabu T785-ISAC (doplňkový obrázek 14).

Obrázek 5: T785-ISAC vyvolávají silné protinádorové účinky v modelu syngenního nádoru MMC. (ah) Myším FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) byla implantována nádorová buněčná linie MMC. (a) Samice myší byly randomizovány, když objem nádoru dosáhl přibližně 500 mm3. Myši byly poté ošetřeny intraperitoneální injekcí 5 mg/kg q5d x 2 myší anti-krysí HER2 protilátka, myší anti-krysí HER2 T785-ISAC nebo izotyp T785-ISAC (TA99) (n =4-7 myší na paži). (b, c) Samci myší byli randomizováni, když objem nádoru dosáhl přibližně 500 mm3, a byli předléčeni počínaje jeden den před datem počáteční léčby klodronátem naplněným nebo kontrolními lipozomy pro depleci fagocytů (6 cyklů, do 15. dne) nebo anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 dní po jejich posledním ošetření byly stimulovány nádorovou buněčnou linií MMC. Nádorově naivní myši sloužily jako kontroly implantace (n=5 myší na skupinu). (ad) Údaje jsou reprezentativní pro alespoň 2 experimenty. Po nádorech byly myši humánně usmrcenydosáhl 2,000 mm3. Údaje jsou uvedeny pro ty skupiny, ve kterých nedosáhly žádné nádory2,000 mm3. (ei) Skupiny myší byly randomizovány, když objemy nádorů MMC dosáhly přibližně 500 mm3 a byly ošetřeny 5 mg/kg ISAC nebo kontrolními protilátkami dávkovanými v den 0 a den 5. Nádory byly zpracovány pro měření cytokinů pomocí MSD analýzu průtokovou cytometrií, kvantifikaci mRNA NanoString nebo fixaci ve formalínu a zalitou v parafínu proimunohistochemii v uvedených časech. (e) Grafy sopek znázorňují log2násobnou změnu genové exprese u léčených vs izotypových kontrolních nádorů měřených pomocí NanoString po 24 hodinách (n=5 myší na skupinu). Změny s upravenou p-hodnotou < 0,05="" jsou="" zobrazeny="" červeně.="" (f)="" skóre="" genové="" signatury="" kvantifikované="" pomocí="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" pro="" nádory="" analyzované="" 24="" hodin="" po="" léčbě="" (n="5" myší="" na="" skupinu).="" (g,="" h)="" průtoková="" cytometrická="" analýza="" složení="" nádorových="" buněk="" a="" aktivačního="" stavu="" 24="" hodin="" a="" 6="" dní="" po="" zahájení="" léčby="" (n="4" myší="" na="" skupinu).="" data="" jsou="" reprezentativní="" pro="" alespoň="" 2="" experimenty.="">Reprezentativní snímky a také kvantifikace F4/80, CD11c a CD8 IHC nádorů odebraných 6 dní po každé indikované léčbě. Měřítko je 50 μm. (ai) Data jsou uváděna jako průměr a SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

T785-ISAC cílené na nádor vyvolávají regresi nádoru v syngenním modelu nádoru MMC
Abychom vyhodnotili schopnost ISAC zprostředkovávat protinádorovou účinnost v přítomnosti B, T a NK buněk, použili jsme buněčnou linii myšího prsního karcinomu (MMC) exprimující syngenní potkaní HER2 (rHER2), která byla odvozena ze spontánní prsní žlázy. karcinom u rHER2- myší exprimujících FVB.Aby se minimalizovala mezidruhová imunogenicita spojená s expresí rHER2 v MMC, transgenní myši, které endogenně exprimují potkaní Her2 pod kontrolouMMTV promotoru byly použity jako hostitel (doplňkový obrázek 15) 47. Využitím přítomnosti plně neporušeného imunitního systému jsme se zaměřili na posouzení schopnosti ISAC bojovat s nádory s velkou nádorovou zátěží 500 mm3, protože větší nádory jsou obecně obtížnější léčit v preklinických modelech 48. Systémové podávání všech léčeb, včetně rHER2 T785-ISAC, bylo dobře tolerováno s minimálním dopadem na tělesnou hmotnost (doplňkový obrázek 16A). Pouze rHER2 T785-ISAC však dokázal vyléčit myši nesoucí velké zavedené nádory (obrázek 5A). Jak bylo vidět na modelu xenoimplantátu, studie buněčné deplece ukázaly, že významná protinádorová aktivita byla ztracena, když byly fagocytární buňky depletovány lipozomy s obsahem klodronátu (obrázek 5B). I když se neočekává, že ISAC bude působit přímo na T buňky, myši předem ošetřené protilátkou poškozující CD8-po dvou podáních rHER2 T785-ISAC ztratily schopnost odstraňovat nádory (obrázek 5C). To naznačuje, že ISAC cílené na nádor mohou působit nepřímo prostřednictvím T buněk po prezentaci antigenů spojených s nádorem. V souladu s přítomností imunologické paměti, myšivyléčené nádory MMC po léčbě rHER2 T785-ISAC byly chráněny proti opětovnému vyvolání nádoru (obrázek 5D).

Abychom dále prozkoumali mechanismus, který je základem účinnosti ISAC v syngenním modelu, dále jsme zkoumali buněčné, transkripční a cytokinové změny v mikroprostředí nádoru po dávkování ISAC. Dvě kohorty myší s velkými nádory MMC byly léčeny rHER2 T785-ISAC nebo kontrolami. Nádory z první kohorty byly odebrány 24 hodin po dávkování (den 1), kdy měly všechny nádory podobnou velikost (doplňkový obrázek 16B). Druhé kohortě byla podána druhá dávka 5 dní po první, poté byla sklizena o 24 hodin později (den 6), kdy nádory ve všech léčených skupinách rostly měřitelně kromě těch, které byly léčeny T785-ISAC (doplňkový obrázek 16B ). Nádory byly analyzovány pomocí IHC, exprese mRNA a sekrece cytokinů v proteinových lyzátech. Další podporu našich pozorování v modelech xenoimplantátů, že pro aktivitu ISAC je nutné zacílení na nádor, analýza mRNA nádorů 24 hodin po léčbě rHER2 T785-ISAC ukázala dramatickou upregulaci 34,1 procenta genů u myší NanoString proti rakovině imunitního systému. profilovací panel ve srovnání s nádory ošetřenými izotypem. Samotná protilátka anti-rHER2 měla pouze nepatrný vliv na genovou expresi (3,5 procenta analyzovaných genů), zatímco necílený izotyp T785-ISAC genovou expresi neovlivnil (obrázek 5E). Jak je vidět na modelu xenoimplantátu HCC1954, geny spojené se signalizací a aktivací zprostředkovanou TLR7- byly významně upregulovány rHER2 T785-ISAC zaměřeným na nádor, což svědčí o robustní odpovědi zprostředkované TLR (obrázek 5E). Analýza dráhy genové exprese opět odhalila významnou upregulaci klíčových imunitně souvisejících genových signatur, včetně signatur pro analýzu genové expresní dráhy, odhalila významnou upregulaci klíčových imunitně souvisejících genových signatur po léčbě rHER2 T785-ISAC, včetně těch souvisejících s chemokiny a cytokiny (obrázek 5F). Kvantifikace proteinu byla provedena na stejných nádorech, jaké byly analyzovány pomocí NanoString, a v souladu s nálezy genového podpisu byly měřeny významně zvýšené hladiny prozánětlivých cytokinů a chemokinů 24 hodin po léčbě rHER2 T785-ISAC (doplňkový obrázek 17 ). Skóre genových signatur bylo také významně zvýšeno pro zpracování a prezentaci antigenu, funkci dendritických buněk a funkci makrofágů, což dále podporuje reakci zprostředkovanou anFc-Fc R a řízenou fagocytózou 24 hodin po rHER2 T785-ISACošetření (obrázek 5F a doplňkový obrázek 18). Kromě významně zvýšeného skóre genového podpisu spojeného s robustní odpovědí zprostředkovanou TLR a Fc R bylo skóre genového podpisu pro funkce T buněk také významně zvýšeno během 24 hodin po léčbě rHER2 T785-ISAC, což dále podporuje zjištění, že T buňky jsou nutné pro účinnost zprostředkovanou ISAC (obrázek 5F a doplňkový obrázek 18).

Pro charakterizaci imunitních buněk, které mohou přispívat k časnému zvýšení produkce prozánětlivých cytokinů a chemokinů, byly nádory analyzovány průtokovou cytometrií 24 hodin po první dávce rHER2 T785-ISAC nebo kontrol a 6 dní po zahájení ošetření, 24 hodin po druhé dávce. Analýza nádorů v den 1 odhalila infiltraci CD11b plus Ly6C plus monocyty v nádorech léčených rHER2 T785-ISAC a CD11b plus Ly6G plus granulocyty v nádorech léčených rHER2 mAb nebo rHER2 T785-ISAC , ale ne izotyp ISAC nebo izotypové protilátky kontroly (obrázek 5G). Hladiny monocytů byly ještě dále zvýšeny v nádorech ošetřených rHER2 T785-ISAC po 6 dnech. Podobně jako to, co jsme pozorovali u modelu xenograftu HCC1954, byly myeloidní APC (CD11b plus CD11c plus F4/80 plus) významně zvýšeny 6. den po léčbě rHER2 T785-ISAC ve srovnání s kontrolami (obrázek 5G a doplňkový obrázek 19 ). Dále bylo zjištěno, že myeloidní APC jsou aktivovány specificky ve skupině léčené rHER2 T785- ISAC v obou časových bodech, jak bylo měřeno upregulací CD40 na buněčném povrchu (obrázek 5H). Důležité je, že zvýšení nádorových myeloidních APC nebylo měřeno po depleci fagocytů s použitím lipozomů naplněných klodronátem (doplňkový obrázek 20). Nakonec byla provedena IHC pro posouzení přítomnosti a umístění klíčových populací imunitních buněk v modelu MMC po léčbě rHER2 T785-ISAC. Jak bylo vidět na xenograftovém modelu HCC1954, léčba pomocí rHER2 T785-ISAC vedla k dramatickému nárůstu CD11c plus a F4/80 plus buněk v peritumorální oblasti, který nebyl pozorován po léčbě rHER2 protilátkou nebo léčbě izotypem nebo izotyp T785-ISAC (obrázek 5I). V souladu s časnou expresí chemokinů T buněk a zvýšeným skóre genového podpisu pro funkci T buněk byla pozorována významná infiltrace buněk CD8 plus pomocí IHC v nádorech myší léčených rHER2 T785-ISAC v den 6, zatímco Zbarvení CD8 u myší léčených protilátkou anti-rHER2 nebo izotypovými kontrolami zůstalo nízké (obrázek 51). Zvýšené barvení CD8 plus IHC spolu se zesílenou genovou expresí genů spojených s funkcí T buněk a CD8-závislou clearance nádoru podporuje potenciál T785-ISAC přeměnit studený nádor na horký.CL8- {58}}ISAC vyvolávají regresi tumoru v HER{59}}médiu exprimujícím xenoimplantátovém modelu tumoru Abychom prokázali, že ISAC jsou robustní platformou napříč mnoha imunostimulačními zátěžemi, vyvinuli jsme ISAC s použitím dobře známého agonisty TLR7, CL264 s DAR srovnatelné s trastuzumabem T785-ISAC (obrázek 6A a doplňkový obrázek 21). Schopnost trastuzumabových ISAC produkovaných s CL264 nebo T785 zprostředkovat intratumorální myeloidní aktivaci byla hodnocena v modelu xenoimplantátu HCC1954 24 hodin po jednorázovém podání trastuzumabu, trastuzumabu CL264-ISAC nebo trastuzumabu T{73}} . Zvýšená aktivace myeloidů byla pozorována u trastuzumabu CL264-ISAC, o čemž svědčí zvýšená exprese CD40 na tumor infiltrujících CD11b plus CD11c plus F4/80 plus myeloidní APC ve srovnání s trastuzumabem nebo trastuzumabem T785-ISAC (obrázek 6B ).Aby se určilo, zda se zvýšená myeloidní aktivační kapacita CL264-ISAC přenesla na vyšší protinádorovou aktivitu in vivo, byl trastuzumab CL264-ISAC porovnán sT785-ISAC v modelech nádorů HER2High HCC1954 a HER2Med JIMT-1. Zatímco obatrastuzumab ISAC zprostředkoval úplnou regresi nádoru v modelu HCC1954 HER2High, CL264-ISAC prokázal zvýšenou protinádorovou aktivitu v modelu JIMT-1 HER2Med, což naznačuje, že potence ISAC a schopnost cílit na nádory s nižší hustotou antigenu mohou být propojeny (obrázek 6C–D).

Oba ISAC byly dobře tolerovány, ale pozorovali jsme přechodný úbytek tělesné hmotnosti o 5-10 procent u zvířat léčených buď trastuzumabem CL264-ISAC nebo rituximabem CL264-ISAC, přičemž tělesná hmotnost se obnovila na nebo nad základní linií třetí dávkou (doplňkový obrázek 16A). Systémová sekrece cytokinů byla měřena po léčbě T785-ISAC nebo CL264-ISAC. Nízké hladiny TNF byly naměřeny v séru zvířat čtyři hodiny po podání T785-ISAC, zatímco cílené i izotypové CL264-ISAC vyvolávaly vyšší hladiny sekrece TNF systémově (doplňkový obrázek 11) . Je nepravděpodobné, že by tyto účinky mezi T785 a CL264 ISAC byly způsobeny přímým dopadem ISAC na růst nádorových buněk, protože ISAC neinhiboval proliferaci rakovinných buněk in vitro (doplňkový obrázek 9).

CL264-ISAC vyvolávají clearance nádoru a imunologickou paměť v modelech syngenních nádorů Vzhledem ke zvýšené potenci a účinnosti pozorované u CL264-ISAC v modelech xenoimplantátu lidského nádoru s různou hustotou antigenu HER2 jsme dále charakterizovali aktivitu CL 264-ISAC v modelech syngenních nádorů. Podobně jako T785-ISAC v modelu MMC vedl CL264-ISAC k regresi nádoru a vymizení způsobem závislým na T buňkách, což vedlo k trvalé imunologické paměti (doplňkový obrázek 22A). Pro posouzení účinnosti ISAC v modelu syngenního nádoru se sníženou expresí antigenu jsme vyvinuli buněčnou linii CT26, která stabilně exprimuje potkaní HER2 (CT26-rHER2). Důležité je, že asi 8,5 procenta buněk CT26 neexprimuje rHER2 po implantaci nádoru (obrázek 6E). Myši Balb/c divokého typu léčené rHER2 CL264-ISAC vykazovaly podstatnou protinádorovou imunitu v tom, že 75 procent (6 z 8) myší se zbavilo nádorů a zůstalo bez nádorů po dobu trvání experimentu, zatímco žádná z myší léčených protilátkou anti-rHER2 neměla úplnou regresi (obrázek 6F). Po léčbě rHER2 CL264-ISAC byl pozorován přechodný úbytek hmotnosti přibližně 10 procent tělesné hmotnosti, přičemž tělesná hmotnost se obnovila do osmi dnů po zahájení studie (doplňkový obrázek 22B). Hodnotili jsme, zda rHER2 CL264-ISAC zprostředkovává imunologickou paměť proti nádoru postrádajícímu expresi cílového antigenu, rHER2, vystavením myší dříve vyléčených z nádorů CT26-rHER2 rodičovskou buněčnou linií CT26, která postrádala rHER2 výraz. Myši dříve vyléčené z CT26-rHER2 nádorů pomocí rHER2 ISAC byly plně chráněny před expozicí rodičovské buněčné linii CT26 (obrázek 61). Deplece CD4 a CD8 T buněk před obnovením nádoru ukázala, že T buňky jsou nutné pro ochranu. Nakonec jsme testovali, zda imunologická paměť vyvinutá u myší dříve vyléčených pomocí ISAC byla specifická pro antigeny spojené s nádorem primárního léčeného nádoru. Během rodičovského opětovného vyvolání nádoru CT26 byly myši současně stimulovány jiným nádorem, 4T1, implantovaným do kontralaterálního boku. Data ukazují, že vývoj imunologické paměti bylspecifické pro antigeny spojené s nádorem CT26 odlišné od rHER2, protože růst nádorů 4T1 nebyl ovlivněn (obrázek 6G).