Integrativní omická analýza odhaluje dráhy související s mikrovaskulárním zánětem v biopsiích aloštěpů ledvin

edmund.chen@wecistanche.com

Při transplantaci pevných orgánů se mikroRNA (miRNA) ukázaly jako klíčoví hráči v regulaci funkce aloštěpů v reakci na poranění. Abychom získali přehled o úloze miRNA v protilátkami zprostředkované rejekci, fenotyp rejekce histologicky definovaný mikrovaskulárním zánětem,ledvina biopsie aloštěpu byly podrobeny profilování miRNA, ale také messenger RNA (mRNA). Pomocí jedinečného vícekrokového selekčního procesu specifického pro studii BIOMARGIN (objevná kohorta, N=86;výběrová kohorta, N=99; validační kohorta, N=298), bylo konzistentně identifikováno šest odlišně exprimovaných miRNA: miR-139-5p (dolů) a miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (nahoru). Úroveň jejich exprese postupně korelovala s intenzitou mikrovaskulárního zánětu. Buněčná specifita cílových genů miRNA byla zkoumána integrací jejich in vivo cílů mRNA se sekvenováním jednobuněčné RNA z nezávislé kohorty biopsie aloštěpu. Exprese miR-139-5p odvozená z endotelu negativně korelovala s expresí genů souvisejících s MHC. Naopak nadměrná exprese miR-222-3p odvozená z epitelu byla silně spojena s degradovanou renální elektrolytovou homeostázou a potlačenými imunitními drahami. V imunitních buňkách miR-150-5p reguloval aktivaci NF-kB v T lymfocytech, zatímco miR-155-5p reguloval sestřih mRNA v buňkách prezentujících antigen. Celkově nám integrované omiky umožnily odhalit nové cesty zapojené do mikrovaskulárního zánětu a naznačují, že k metabolickým modifikacím v tubulárních epiteliálních buňkách dochází jako důsledek odmítnutí zprostředkovaného protilátkou za blízkým endoteliálním kompartmentem.

klíčová slova:transplantace ledvin, mikroRNA, multi-omika, mikrovaskulární zánět, rejekce zprostředkovaná protilátkou

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

ÚVODvtransplantaci ledviny(KT) se aloimunitní poškození obvykle dichotomizuje na dva typy rejekce aloštěpu podle prostorové distribuce imunitní infiltrace a informace o přítomnosti nebo nepřítomnosti dárcovských specifických anti-HLA protilátek. Diagnóza se opírá o biopsii aloštěpu s klasifikací histologických lézí podle klasifikace Banff International Consensus(1). Tubulitida ("t" léze) a intersticiální zánět ("I" léze) jsou charakteristickým histologickým rysem rejekce zprostředkované T buňkami (TCMR) a souvisí s přímou cytotoxicitou vůči tubulointersticiálnímu kompartmentu. Rejekce zprostředkovaná protilátkou (ABMR) je nejčastěji spojena s cirkulujícími anti-HLA protilátkami se zánětem zaměřeným na mikrovaskulární kompartment. Aktivní histologické léze ABMR zahrnují přítomnost mononukleárních buněk v glomerulárních kapilárách ("g" léze) a v peritubulárních kapilárách ("ptc" léze), společně označované jako "mikrovaskulární zánět" (MVI). U chronické aktivní ABMR se k těmto akutním lézím přidává chronické poškození tkáně, jako je transplantační glomerulopatie nebo arteriální intimální fibróza(1). Při použití současných imunosupresivních látek cílených na T'-buňky se má za to, že TCMR má omezený prognostický dopad, zatímco ABMR je hlavní příčinou selhání štěpu, což souvisí s nedostatkem účinných terapeutických přístupů (2).

Pro nalezení lepších terapií pro MVI a ABMR je zapotřebí lepší přehled o biologických mechanismech, které jsou základem těchto procesů poškození. Vysoce výkonné omické technologie se zdají být pro tento účel vhodné, protože umožňují přesné a současné testování tisíců genů, proteinů a metabolitů (3). Celý přepis výslechuledvinabiopsie aloštěpu prokázaly hluboké změny exprese genu mRNA v poškozených rezidentních buňkách nebo v infiltrujících buněčných populacích během ABMR(4). Mezitím se mikroRNA (miRNA) objevily jako klíčoví hráči v buněčném metabolismu tím, že regulují messenger RNA (mRNA) na posttranskripční úrovni. Ve skutečnosti miRNA způsobily revoluci v našem chápání jemného ladění fyziologických procesů těla, které se podílejí na proliferaci, apoptóze, diferenciaci a vývoji(5). Není překvapením, že dysregulovaná exprese miRNA vede k rozvoji mnoha patologií včetněnemoc ledvin(6). Protože se profily exprese miRNA mezi nemocnými a zdravými stavy liší, mnoho studií analyzovalo miRNA buď samotné, nebo v kombinaci s jinými tradičnějšími markery, a to nejen za účelem diagnostiky onemocnění a prognózy progrese onemocnění, ale také za účelem navržení potenciálních terapeutických aplikací (7).

V kontextu transplantace pevných orgánů se miRNA mohou podílet na rejekci prostřednictvím své role v regulaci funkce imunitních buněk a v odpovědi rezidentních buněk aloštěpu na poranění (6,8). Několik studií zkoumalo aloštěpové miRNA jako biomarkery a/nebo efektory v nastavení TCMR (8,9), ale žádná se dosud nezaměřovala na MVI a ABMR. V této studii jsme se zaměřili na integraci různých úrovní omikledvinabiopsie aloštěpu, abychom získali přehled o úloze miRNA v tomto škodlivém fenotypu odmítnutí.

MATERIÁLY A METODY Návrh studieTato studie je součástí programu BIOMArkers financovaného FP7-RenálníVýzkumný program poranění štěpu (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, číslo NCT02832661), vedený evropským výzkumným konsorciem při hledání biomarkerů aloštěpových imunitních lézí vtransplantace ledvinpříjemců, s diagnostickou a/nebo prognostickou hodnotou. BIOMARGIN je multicentrická, prospektivní, vícefázová studie, prováděná ve čtyřechtransplantace ledvincentra v Evropě (Necker Hospital, Paříž, Francie; Univerzitní nemocnice, Leuven, Belgie; Hannover Medical School, Hannover, Německo; a University Hospital, Limoges, Francie). Vzorky byly prospektivně odebírány v době screeningu a indikačních biopsií mezi dubnem 2013 a červnem 2015 (obrázek IA). Všechny transplantace byly provedeny s negativními křížovými shodami cytotoxicity závislé na komplementu. V těchto čtyřech klinických centrech byly kromě indikačních biopsií provedeny protokolární biopsie 3, 12 a někdy 24 měsíců po transplantaci, podle praxe místního centra. Institucionální kontrolní komise na každém místě studii schválila a všichni pacienti poskytli písemný informovaný souhlas.

Studijní kohortyStudie byla rozdělena do tří fází (obrázek 1A). V první fázi objevování případu a kontroly bylo použito N=88 bioptických vzorků pro analýzu globální exprese miRNA (N=754 miRNA, s vyloučením potenciálních normalizačních miRNA) . Vzorky jsme vybírali na základě dostupnosti a histologických kritérií (vyjma případů s diagnózou glomerulonefritidy nebo nefropatie asociované s polyomaviry a případů s nejasnou diagnózou). Na základě výsledků lokální biopsie byl proveden první výběr, který byl dále zpřesněn centrálním čtením skupinou patologů, nezávislých na původním centru. Statistická analýza (viz selekce miRNA) byla použita k výběru rozšířeného seznamu miRNA, nejvíce odlišně exprimovaných mezi histologickými fenotypy, které byly následně kvantifikovány ve 2. fázi.

Podobný design případové a kontrolní studie byl použit pro druhou (výběrovou) fázi, kde byla provedena cílená analýza exprese miRNA (N=143) na N=99 bioptických vzorcích. Stejný statistický kanál byl použit pro výběr ještě omezenějšího seznamu miRNA, které měly být následně kvantifikovány ve 3. fázi. Nakonec ve třetí (validační) kohortě byly všechny vzorky prospektivně a následně odebrané podle protokolu BIOMARGIN mezi 24. červnem 2014 a 2. červencem 2015 s odpovídajícímledvinakvalita biopsie aloštěpu, byly hodnoceny pro 38 miRNA vybraných jako výsledek druhé selekční fáze. V této kohortě v reálném životě nebyla provedena žádná selekce na základě histologie, demografie, času nebo jakéhokoli jiného faktoru než dostupnosti vzorku a kritérií kontroly kvality (adekvátnost biopsie a výtěžek RNA).

Výběr miRNAPro studii BIOMARGIN v R(R Core Team(10), verze 1.0.44) byl speciálně vyvinut robustní statistický kanál jako rozšíření balíčku biosignal R(1l). Stručně řečeno, ve fázi objevování jsme provedli strategii výběru funkcí včetně jednorozměrných a vícerozměrných přístupů. Pro jednorozměrný výběr jsme použili neparametrický test (Wilcoxon-Mann-Whitney test) a parametrický test (Studentův t-test) a kohortu Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Predikční skóre každého transkriptu miRNA v každém multivariačním modelu byla integrována za zisku "multivariančního skóre". Kombinací výsledků těchto jednorozměrných a vícerozměrných analýz jsme byli schopni seřadit a vybrat podmnožinu kandidátů miRNA, kteří budou součástí rozšířeného seznamu, který bude kvantifikován během další fáze.Pro tuto posthoc analýzu zaměřenou na VMI dráhy byla střední normalizovaná exprese každé miRNA porovnána mezi případy a kontrolami pomocí Wilcoxonova testu ve všech třech kohortách. Kontrolovali jsme vícenásobné testování pomocí metody Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR).

Klinickopatologické hodnoceníSkóre jednotlivých histologických lézí bylo semikvantitativně hodnoceno podle kritérií Banff 2019(16). Termín "mikrovaskulární zánět" (MVI) byl použit k označení jakéhokoli stupně kombinace glomerulitidy (g) a/nebo peritubulární kapilární záněty (ptc). Všechny případy ABMR splnily první 2 kritéria klasifikace Banf 2015 nebo Banff 2017 (histologické důkaz akutního poškození tkáně a důkaz současné/nedávné interakce protilátek s vaskulárním endotelem), ale ne všechny splnily třetí kritérium [sérologický důkaz dárcovských specifických protilátek (DSA) a/nebo barvení CAD]. DSA po transplantaci byly stanoveny podle praxe místního centra, přičemž pozitivita DSA byla definována jako detekovatelné dárcově specifické sérové ​​anti-HLA protilátky s hodnotou střední intenzity fluorescence (MFI) 500 v době biopsie nebo kdykoli předtím.

Extrakce RNA z bioptických vzorků pro profilování mRNA a miRNAU každého byla odebrána dvoujehlová jádraledvinabiopsie aloštěpu. Jedna byla použita pro konvenční histologické hodnocení a alespoň polovina druhé byla okamžitě uložena v Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Nizozemsko). Zkumavky Allprotect byly skladovány při 4C (minimálně 24 hodin až maximálně 72 hodin). a poté uloženy při -20 stupni až do extrakce RNA. Celková RNA byla izolována zledvinabioptické vzorky aloštěpu pomocí Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) na přístroji QIAcube (Qiagen Benelux BV). Množství (absorbance při 26{{20}} nm) a čistota (poměr absorbance při 230,260 a 280 nm) izolované RNA byly měřeny pomocí spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgie). Číslo integrity RNA (RIN) bylo hodnoceno pomocí sady Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgie) na přístroji Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indexy kontroly kvality se mezi VMI a č. Skupiny MVI [RIN(průměr±SD):5,6±1,96vs5,4±1,97,P=0,66;poměr 260/280 (průměr±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. Pro vzorky RNA s nízkým RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL

miRNA profilováníSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 bylo považováno za nevyjádřené. RNU44 a RNU48 vykázaly konzistentní expresi ve všech vzorcích, průměrný (RNU44 plus RNU48) koeficient variace byl 3,73 procent v Array Card A a 3,79 procent v Array Card B] a byly použity jako provozní geny pro normalizaci dat ve všech dílčích studiích.

mRNA transkriptomická analýzaTranskriptomická analýza byla provedena pomocí microarray, jak již bylo popsáno (17). Stručně řečeno, celková RNA extrahovaná ze vzorků biopsie byla nejprve amplifikována a biotinylována na komplementární RNA (cRNA) pomocí GeneChip 39 IVT PLUS Reagent Kit (Affymetrix) a hybridizována s Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays( Affymetrix), který zahrnoval 54 675 sad sond pokrývajících celý genom. Použili jsme robustní vícečipovou průměrnou (RMA) normalizaci. Medián normalizované exprese každé mRNA byl porovnán mezi případy a kontrolami pomocí Wilcoxonova testu. Kontrolovali jsme inflaci rizika alfa díky vícenásobnému testování použitím metody Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR). S daty microarray bylo nakládáno v souladu s pokyny pro Minimum Information About Microarray Experiment.

Analýzy In SilicoPro diferenciální analýzu transkriptomických dat byl použit software Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments (BIOMEX) s použitím anotace Ensembl ID(18). Analýza cesty vynalézavosti (IPA, Build: 478438M Verze obsahu: 44691306, Qiagen) a OMICSnet(19) byly použity ke stanovení sad genů regulovaných vybranými miRNA. OMICSnet byl použit k provedení analýzy genové ontologie s databází cest Reactome s použitím kompletní cesty (20). Budování genových sítí bylo plně bez dozoru a spoléhalo se na počet hlášených molekulárních interakcí každého jednotlivého genu se všemi ostatními geny v síti. Geny s nejvyšším počtem interakcí byly automaticky umístěny do středu sítě, zatímco geny s nižším počtem interakcí byly rozšířeny do periferie. Buněčný původ vybraných miRNA byl zkoumán pomocí projektu Fantom5(21), který poskytuje cap analýzu genové exprese v lidských buňkách a tkáních. Pro analýzu exprese miRNA jsme vzali v úvahu všechnyledvina-příbuzné strukturální buňky a všechny cirkulující hematopoetické buňky, bez další selekce.

Analýza dat jednobuněčného sekvenování RNAByla použita dříve publikovaná data sekvenování lidské jednobuněčné RNA (siRNA-seq) ze dvou biopsií ABMR a čtyř zdravých referencí odpovídajících biopsiím při sledování transplantací. Přidružené nezpracované počty nebo matice byly staženy z GEO (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) aledvinyProjekt precizní medicíny (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Surové matice genové exprese generované na vzorek byly sloučeny a analyzovány pomocí balíčku Seurat V4 (23). Parametry použité k vytvoření a filtrování Seuratových objektů byly následující: zahrnutí buněk exprimujících mezi 500 a 10 000 detekovaných genů a méně než 25 procent mitochondriálních transkriptů. Po filtrování byly všechny objekty integrovány pomocí pracovního postupu integrace SCTransform na Seurat (24). Stručně řečeno, pro integraci pomocí funkce PrepSCTIntegration bylo použito 3000 funkcí a k omezení dávkového efektu byla použita funkce FindIntegrationAnchors. Pomocí funkce DimPlot a 16 hlavních komponent byla vytvořena úplná datová sada UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). Clustery byly vytvořeny pomocí funkcí FindNeighbors a FindClusters s rozlišením 0,6. Identifikace shluků byla provedena pomocí funkce FeaturePlot vyhodnocením exprese specifických markerů v každém shluku. Bodové grafy byly vytvořeny pomocí funkcí vykreslování DotPlot a FeaturePlot, s normalizovanými počty v testu RNA jako vstupními daty.

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL

Statistická analýzaCharakteristiky pacientů a dárců byly popsány čísly, procenty a frekvencemi pro kategorické proměnné. Uváděli jsme spojité proměnné pomocí průměrů a směrodatných odchylek (SD), pokud jsou normálně rozděleny, mediánů a interkvartilových rozsahů (IQR) pro proměnné se zkreslenou distribucí. Porovnali jsme jejich charakteristiky pomocí Fisherova nebo Wilcoxonova testu, pokud to bylo vhodné. Pro srovnání střední exprese miRNA podle intenzity MVI jsme použili Kruskal-Wallisův test a pro korelační analýzu Spearmanův test. Zvažovali jsme statistickou významnost pro P-hodnoty menší než 0.05. Pro statistickou analýzu a prezentaci dat jsme použili GraphPad Prism (verze 8; GraphPad Software, San Diego, CA) a RStudio (verze 4.0.3). Byly použity následující balíčky R: heatmap3 (heatmap3_1.1.9) pro analýzy teplotních map, balíčky fmsb(fmsb_0.7.0) a scales (scales_1.1.1) pro radarové grafy, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) pro sloupcové grafy a complot(corrplot_0.90) pro analýzu korelační matice.

VÝSLEDEK

Vícekroková identifikace miRNA spojených s MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Dalších 59 pacientů (MVI-) vykazovalo různé diagnózy zahrnující rejekci zprostředkovanou T-buňkami (TCMR, N=8), intersticiální fibrózu a tubulární atrofii (IFIA,N=20) a normální biopsie (N{{6 }}), ale ne MVI. Ze 754 kandidátů miRNA bylo 18 miRNA odlišně exprimováno mezi skupinami MVI plus a MVI- (obrázek 1B). Ve výběrové kohortě byl kvantifikován omezený seznam 143 miRNA v 99 vzorcích. V této selekční kohortě bylo 14 miRNA odlišně exprimováno mezi případy s (N=28) a bez (N=71)ABMR (obrázek 1C). Nakonec v největší transsekční kohortě bylo kvantifikováno 38 miRNA ve 298 vzorcích, z nichž 12 miRNA bylo rozdílně exprimováno mezi biopsiemi ABMR(N=29)vs.žádné ABMR (N=269) (obrázek 1D ).

Konzistentní identifikace 6 MVI-asociovaných MiRNA a korelace s histologiíDále jsme protli 3 seznamy odlišně exprimovaných miRNA a identifikovali 6 miRNA, které byly konzistentně asociovány s MVI nebo ABMR ve 3 nezávislých kohortách (obrázek 2A). miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p a miR-223-3p byly nadměrně exprimovány v MVI/ABMR, zatímco exprese miR-139-5p byla snížena. Radarové grafy (obrázek 2B) zobrazují pro každý krok rozdílnou expresi mezi případem a kontrolami 6 miRNA a podporují robustnost profilů miRNA ve třech nezávislých kohortách. Dále jsme studovali, jak je exprese 6 miRNA spojena s jednotlivými histologickými lézemi napříč všemi 483 biopsiemi aloštěpu dohromady. Exprese 5 up-regulovaných miRNA se postupně zvyšovala s intenzitou lézí MVI, zatímco exprese miR-139-5p byla negativně korelována (obrázek 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p byly nejen vysoce spojeny s rysy souvisejícími s ABMR (g, ptc, depozice C4d), ale také s lézemi souvisejícími s TCMR (i, t ) a léze IFTA (ct, ci), což naznačuje jejich zapojení do běžných, pro ABMR nespecifických, zánětlivých a zjizvených procesů. Alternativně může mezi lézemi přirozeně existovat určitá vnitřní kolinearita, což vede k naší neschopnosti identifikovat skutečnou specifitu pro jednu lézi. MiR-222-3p nekoreloval s histologickými lézemi TCMR nebo IFTA (obrázek 2D).

Integrace Multi-Omics: souhra mRNA-miRNA v MVDále jsme hodnotili odlišně exprimované geny mezi případy MVI plus a MVI- v dříve publikovaném souboru objevů (25). Z 54 675 sond bylo identifikováno celkem 2 755 odlišně exprimovaných genů (DEG) mezi MVI plus a MVI-

skupiny obsahující 1085 down-regulovaných a 1670 up-regulovaných genů (obrázek 3A). Nejvíce odlišně exprimované mRNA ve vzorcích MVI plus byly CXCL9 a CXCL10, v souladu s předchozími zprávami(17,26), že tyto geny jsou nejvíce overexprimovány v ABMR. Dále jsme použili IPA a OMICSnet k identifikaci in silico domnělých cílových genů pro každou miRNA. Bylo předpovězeno, že celkem 4504 mRNA bude cíleno alespoň jednou ze 6 miRNA. Poté jsme integrovali těchto 4504 předpokládaných cílů s DEG v biopsiích aloštěpu. Integrovaná miRNA/mRNA analýza identifikovala 61° cílené miR-139-5p, které byly významně zvýšeny v MVI plus biopsie. Identifikoval také 28, 58, 52, 43 a 27 stupňů významně snížené v MVI plus biopsie, na které se zaměřily miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p a miR-223-3p (obrázek 3B).

Buněčný původ miRNA spojených s MVBuněčný původ šesti miRNA byl charakterizován různými způsobyledvinovésubtypy buněk a hematopoetických buněk pomocí atlasu miRNA dostupného online [databáze Fantom (27)]. Diskriminované shlukování bez dozoruledvinovémiRNA odvozené z buněk z miRNA odvozených z imunitních buněk (obrázek 4A). Také odhalil jeden nebo dva dominantní typy buněk pro každou miRNA. Zdá se, že MiR-139-5p je exprimován hlavně glomerulárními endoteliálními buňkami (EC). MiR-222-3p, ačkoli jeho exprese nekorelovala s tubulárním zánětem (Banffovy léze"t", obrázek 2D), souvisela především sledvinovéepitelové buňky. Čtyři zbývající miRNA byly primárně exprimovány v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) nebo granulocytech, s miR-142-3p obohaceným o NK buňky a monocyty, miR-150-5p v CD4 plus a CD8 plus T buňkách, miR -155-5p v CD19 plus B buňkách a makrofázích amiR-223-3p v neutrofilech.

Jednobuněčné sekvenování RNA identifikovalo všechny renální buňky a infiltrující imunitní buňky Abychom charakterizovali potenciální roli každé miRNA asociované s MVI, analyzovali jsme veřejně dostupná data sc-RNAseq ze dvouledvinovébiopsie aloštěpu s ABMR a vysokým skóre MVI (g2, ptc3)(22). Tyto soubory dat byly integrovány se 4 zdravými referenčními biopsiemi bez MVI. Po kontrole kvality a filtraci bylo detekováno 31545 buněk a shlukování bez dozoru odhalilo 12 shluků (obrázek 4B). Použili jsme dobře zavedené markery (28) k identifikaci všech hlavních rezidentních a infiltrujících buněčných subtypů a jejich označení (doplňkový obrázek S2). Dále jsme se zaměřili na buněčné populace, ze kterých se předpokládalo, že pochází našich šest miRNA. Za tímto účelem jsme stratifikovali buňky do 4 hlavních shluků odpovídajících endotelu, epitelu, lymfocytům a APC (obrázek 4C). V souladu s předchozí analýzou těchto dat (22) nebyly v souborech dat sc-RNASeg detekovány populace neutrofilních ani NK buněk.

miR-139-5p řídí aktivaci EC a dráhu prezentace antigenu během MVIMiR-139-5p byla jedinou downregulovanou miRNA v naší studii v případech s MVI/ABMR (obrázek 2A) a bylo zjištěno, že pochází hlavně z glomerulární EC (obrázek 4A). Bylo potvrzeno, že 61 z jeho cílových genů je upregulováno v hromadném mikročipu z případů MVI plus (obrázek 3B) a jejich exprese byla dále zkoumána při rozlišení jedné buňky ve 3 dříve identifikovaných subklastrech EC (obrázky 4B, C). Jak je znázorněno na obrázku 5A, aktivovaný ECcluster byl detekovatelný pouze ve vzorcích MVI plus. Kromě toho polovina z 61 genů (N=30) byla konzistentně zvýšena v sc-RNAseq MVI plus biopsie, bez ohledu na tři EC subklastry. Mezi nimi byl GBP5 nejvíce zvýšeným genem. Dále analýza genové ontologie pomocí těchto 30 transkriptů odvozených z endotelu identifikovala UBE2D1 a YWHAG jako centrální hráče v genové síti (obrázek 5B). Konkrétněji byly obohaceny dráhy související s imunitou a dráhy zpracování a prezentace antigenu zprostředkované hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) (obrázek 5C). Pseudočasová analýza byla provedena pro lepší charakterizaci změn genové exprese v průběhu aktivace EC, trajektorie stavu napříč buňkami (obrázky 5D, E), UBE2D1, YWHAG a GBP5 kontinuálně rostly během aktivace endotelu spojené s MVI. Velmi podobné trajektorie byly nalezeny pro geny HLA-A,-B a -DRA související s MHC, ale také pro bonafide endoteliální aktivaci a markery zánětu, jako jsou VCAM1, CXCL9 a CXCL10, což naznačuje, že všechny tyto geny jsou současně exprimovány během aktivace endotelu. Celkově tyto výsledky naznačují, že miR-139-5p je snížena během MV lézí a již nepotlačuje dráhu prezentace antigenu MHC v aktivované EC.

miR-222-3p Poškozuje obojíRenálníFyziologické a imunitně související dráhy v epiteliálních buňkách během MVI Dále jsme se zaměřili na miR-222-3p, upregulovanou miRNA ve vzorcích MVI sledvinovépůvod epiteliálních buněk a výlučnější korelace s histologickými lézemi souvisejícími s ABMR (obrázky 2A, D, 4A). rozlišení buněk v různýchledvinovéepiteliální populace, které jsme dříve identifikovali (obrázky 4B, C). Masivní pokles o 41 z těchto 43 (95 procent) genů napříč všemi identifikovanýmiledvinovéshluky epiteliálních buněk naznačují umlčování genů

profil ve VMI (obrázek 6A). Zajímavé je, že se na něm podílejí 4 genyledvinovéfyziologické dráhy (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 a KIF3B), ale také geny související s imunitou (TRAPI a PEBPI) byly identifikovány jako centrální geny v síti (obrázek 6B). Genová ontologie 43 genů odhalila obohacení signálních drah ErbB, ale také imunitních drah a cytokinová odpověď (obrázek 6C) a exprese ERBB4 byly dále potvrzeny napříč všemiledvinovébuňky (obrázek 6D). Celkově tyto výsledky naznačují, že během VMI je vysoká úroveň-222-3p inledvinovéepiteliálních buněk je spojena se silnou represí genů zapojených do obouledvinovédráhy homeostázy elektrolytů a dráhy související s imunitou v epitelu.

miR-150-5p reguluje aktivaci NF-kB v T lymfocytech během MVI Podobně jsme zkoumali regulační roli (zvýšeného) miR-150-5p během MVI v shluku T-buněk, kde byl nejvíce dominantně exprimován (Obrázek 4A). Vynesli jsme do grafu 58 snížených DEG asociovaných s MVI identifikovaných ve vzorcích biopsie aloštěpu ve velkém (obrázek 3B) a konfrontovali jsme to s genovou expresí v sc-RNAseq T-buněčném shluku (obrázek 7A). Podíl genů cílených miR150-5p a specificky nedostatečně exprimovaných v T-buňkách během MVI byl překvapivě nízký (15/58, 25,9 procenta), což naznačuje, že globální pokles těchto genů in vivo nebyl způsoben výhradně T lymfocytární kompartment. Nicméně z tohoto vysoce vybraného seznamu 15 genů a pomocí platformy OMICSnet jsme zkonstruovali genovou síť (obrázek 7B) a provedli analýzu genové ontologie (obrázek 7C). Pozorovali jsme, že nadměrná exprese miR-150-5p byla spojena s NF -regulace KB v T lymfocytech během MVI.

miR-155-5p Reguluje sestřih mRNA v APC během MV Nakonec byla přesně stejná strategie aplikována na 52miR-155-5cílové geny p, podexprimované během MVI (obrázek 3B). Na rozdíl od miR-150-5p v T lymfocytech jsme pozorovali, že téměř dvě třetiny miR-155-5p cílených genů bylo konzistentně sníženo v APC sc-RNAseq clusteru (31/52,59,6 procenta, obrázek 8A). Analýza genové sítě odhalila, že AIFMI a CIAO1 byly centrální geny (obrázek 8B). Navíc genová ontologie odhalila silné obohacení v drahách souvisejících se sestřihem mRNA (obrázek 8C).

DISKUSESvým jedinečným designem je studie BIOMARGIN typickým rámcem pro integraci multi-omických dat. Opravdu, velmi robustní potrubí bylo použito jak při objevování, selekci a ověřování kohort, které zahrnovaly velký počet pacientů z různých transplantačních center. Ve třech nezávislých kohortách jsme současně pozorovali a potvrdili zvláštní profil exprese 6 miRNA během MVI: miR-139-5p byl snížen, zatímco miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3pa miR-223-3p byly zvýšeny. Důležité je, že hladina každé z těchto 6 miRNA korelovala se závažností MVI, což naznačuje mechanismus regulace závislý na dávce. Dále jsme použili křemíkové platformy ke zkoumání každého buněčného původu miRNA. Překvapivě byly pozorovány dvě odlišné skupiny miRNA: první odvozená z infiltrujících imunitních buněk a druhá specifičtější pro rezidentníledvinovébuňky. Poté byly miRNA i mRNA měřeny ve stejné sadě vzorků biopsie, což umožňuje integrovanou analýzu in vivo validovaných odlišně exprimovaných mRNA/miRNA spojených s MVI. Nakonec, po popisu asociace mRNA/miRNA při rozlišení bulk-tkáň, jsme potvrdili souhru mRNA/miRNA při rozlišení jedné buňky pro čtyři ze 6 identifikovaných miRNA.

Je zajímavé, že miR-139-5p byla jediná miRNA negativně korelující s lézemi MVI. Pochází hlavně z EC a bylo popsáno, že reguluje geny související s MHC. Mezi jeho cílovými geny byl UBE2D1 vysoce upregulován během aktivace endotelu spojené s MVI. Rodina UBE2D je rodina enzymů konjugujících ubikvitin E2 v systému ubikvitin-proteazom(29, 30) a ukázalo se, že UBeD1 zvyšuje ubikvitinaci March-I, což vede k up-regulaci proteinů MHC třídy II(31). Kromě toho byl GBP5 nejvíce zastoupeným genem inaktivovaným EC během MVI, což je v souladu s našimi nedávnými zprávami, které ukazují, že GBP5 je vysoce upregulován v biopsiích ABMR(17), ale také ve vzorcích krve(32). Je zajímavé, že se ukázalo, že exprese GBP5 je indukovatelná interferonem typu II v lidských děložních mikrovaskulárních endoteliálních buňkách spolu s CXCL9 a CXCL10(33). Časná úloha těchto dvou prozánětlivých chemokinů v procesech akutní rejekce je dobře zdokumentována a jejich hladina v moči se navrhuje pro monitorování rizika akutní rejekce při rutinním sledování příjemců transplantátu ledviny (34). Dalším cílem miR-139-5p je YWHAG.YWHAG kódující proteinovou rodinu HLA-F a byl popsán jako rozdílně exprimovaný během aktivního profibrotického procesu u diabetické nefropatie (35). Možná role miR-139-5p ve fibróze, poslední společné cestě po zánětu, je o to relevantnější, že IFTA byla nedávno zahrnuta do složeného skóre pro predikci přežití ledvinového aloštěpu po ABMR(36). Celkově tyto výsledky naznačují, že miR-139-5p již nepotlačuje expresi antigenu MCH na povrchu Anethum během MVI a mohl by se účastnit procesu chemoatrakce a fibrózy, ale tyto mechanismy je třeba ještě experimentálně potvrdit expresi na povrchu endotelu během MVI a by se mohly podílet na procesech chemoatrakce a fibrózy, ale tyto mechanismy je třeba ještě experimentálně potvrdit.

Druhýledvinové-odvozená miRNA, kterou jsme identifikovali, je miR-222- 3p, jejíž exprese je specifičtější pro léze MVI: je spojena se skóre g a PTC a také s ukládáním C4d, ale ne s lézemi i nebo t. Pocházel však především z epiteliálních buněk. Po multi-omické integraci při rozlišení buněk jsme zjistili, že miR-222-3p potlačuje hlavně signalizaci ErbB, která je klíčová pro základní buněčné funkce, jako je proliferace, migrace, růst a diferenciace (37). V biologii člověka je potřebná fyziologická signalizace ErbBledvinovéhomeostáza elektrolytů a udržování integrity ledvin (38). Naše výsledky také identifikovaly ADAM22, NRG1, ZNF91 jako geny související se signalizací ErbB, které jsou výrazně potlačeny v epitelu během MVI. Další geny nezbytné pro fyziologii ledvin, jako je ATP1B1 a KIF3B, byly také potlačeny v renálním epitelu pomocí miR-222-3p během MVI. Dříve Baker a kol. ukázaly, že ATP1B1 (b1 podjednotka Na plus /K plus -ATPáza) řídíledvinovétubulární reabsorpce sodíku (39). Kromě toho Aguado-Fraile et al. identifikovali člena rodiny kinesinů 3B (KIF3B), který se účastní přenosu buněk v buňkách proximálních tubulů potkanů. KIF3B se jeví jako klíčový mediátor buněčné odpovědi proximálního epiteliálního tubulu na ischemii/reperfuzi s potenciální aplikací vledvinovémanagement ischemického poškození (40). Můžeme tedy spekulovat, že miR-222-3p potlačuje základní fyziologické dráhy během MVI v epitelu. Kromě toho jsou imunitní dráhy také regulovány nadměrnou expresí miR-222-3p: důležité geny jako TRAP1 a PEBP1 byly ve vzorcích se silným MVI zcela inhibovány. Je zajímavé, že se ukázalo, že TRAP1 se zlepšilledvinovétubulointersticiální fibróza u myší s jednostrannou ureterální obstrukcí ochranouledvinovémitochondrie tubulárních epiteliálních buněk (41). Kromě toho poskytuje PEBP1 protizánětlivé účinky prostřednictvím inhibice MAPK i NF-kB drah za homeostatických/bazálních podmínek (42). vledvinovéepitel, studie Marka et al. elegantně ukázal, že postischemická aktivace NF-kB zhoršuje tubulární poškození a zhoršuje zánět (43). V našich rukou byl PEBP1 zcela potlačen miR-222-3p, což naznačuje, že dráha NF kB se uvolňuje během MVI. Celkově tyto výsledky ukazují, že biologie epitelu je narušena během MVI aledvinovéepiteliální buňky aktivně reagují na poranění MVI, zatímco zapojení této tkáně do MVI se řeší jen zřídka. Tyto molekulární nálezy by mohly vrhnout nové světlo na akutní tubulární léze poranění, dobře zavedená, ale dlouho opomíjená kritéria ABMR. Kromě toho bylo prokázáno, že epiteliální buňky mohou vylučovat exosomální miR-222-3p a indukovat fenotyp M2 v makrofázích (44). Mezitím Li a kol. nedávno oznámili, že makrofágy M2 nadměrně exprimují miR-155 a dodávají tuto miRNA do mikroprostředí, také prostřednictvím sekrece exozomů. Při transplantaci ledvin byl miR-155 zvýšen u různých stavů (IFTA, akutní rejekce a TCMR) a v tělesné tekutině nebo tkáních (45). Je zajímavé, že miR- 155 může podporovat epiteliálně-mezenchymální přechod prostřednictvím cílení RASSF4 v epiteliálních buňkách (46). Tento přeslech založený na miRNA mezi makrofágy aledvinovéepiteliální buňky zbývá posoudit vtransplantaci ledvina konkrétněji v kontextu MVI. V souladu s těmito zjištěními jsme pozorovali, že miR{0}}p byl exprimován hlavně APC zahrnujícími monocyty a makrofágy. V této konkrétní podskupině odhalila ontologie miR- 155-5p-cílových-genů obohacení v drahách sestřihu premRNA. Zajímavé je, že Janssen a kol. uvedli, že zánět plic indukoval dráhy sestřihu pre-mRNA v alveolárních makrofázích. Kromě toho se aktivace sestřihu pre-mRNA lišila u tkáňových rezidentních makrofágů ve srovnání s (krevně rekrutovanými) makrofágy odvozenými od monocytů. Byly hlášeny změny v základním metabolismu v rekrutovaných makrofázích se zvýšeným efluxem prostřednictvím glykolýzy a sníženým efluxem prostřednictvím cyklu trikarboxylových kyselin (cyklus TCA, tj. Krebsův cyklus) (47). Pokud jde o miR-150-5p, zjistili jsme, že jeho nadměrná exprese během MVI byla spojena s dráhou NF-kB v lymfocytovém shluku zahrnujícím jak vrozené NKT buňky, tak adaptivní T buňky. Je zajímavé, že miR-150-5p je zásadní pro tvorbu zralých a funkčních NK buněk (48) a miR-150-5p deficitní CD8 plus T buňky byly hlášeny jako méně cytotoxické (49). Kromě toho mohou CD8 T buňky také vylučovat miR-150-5p v exozomech (50), což by mohlo naopak podporovat aktivaci fibroblastů v tubulárních epiteliálních buňkách a následnéledvinovéfifibróza, jak naznačují nedávné zprávy (51, 52).

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL

Naše studie má určitá omezení. Náš výzkum jsme zaměřili na 6 miRNA, konzistentně identifikovaných v našem vícekrokovém designu. Pokračovali jsme však se selekcí miRNA krok za krokem, přičemž ve validační kohortě byl kvantifikován pouze zlomek všech známých miRNA. Statistická dráha pro selekci miRNA se spoléhala na původní design BIOMARGIN, který je vhodný k identifikaci diagnostických biomarkerů pro více koncových bodů (ABMR, ale také TCMR a IFTA). I když se tedy miR-146a významně zvýšil v kohortách objevů a selekce (obrázek 2A), nebyl ve validační kohortě kvantifikován. Tím byla miR-146a de facto vyloučena z našeho selekčního procesu, i když literatura naznačuje roli v ischemii/reperfuzi při transplantaci ledvin (53) a při kontrole aloimunitních odpovědí zprostředkované Treg (54). Navíc nemůžeme vyloučit, že výkonnější velikost vzorku by poskytla více miRNA, jako je miR-138 (dolů) a miR{10}} (nahoru), které byly rozdílně vyjádřeny v případech ABMR výběrové kohorty a ukázaly trend ve stejném směru v kohortě objevů. Kromě toho jsme neprováděli analýzu sc-RNAseq na našich vlastních bioptických vzorcích, ale použili jsme online dostupný datový soubor sc-RNAseq. V době návrhu studie a odběru vzorků biopsie nebyla technologie scRNAseq skutečně ještě dostupná a potřeba čerstvě odebraných vzorků neumožňovala retrospektivní použití zmrazených vzorků nebo vzorků zalitých do parafínu. Podobně se profilování mRNA provádělo pomocí microarrays, v té době srovnávací technologie, která byla nyní překonána RNA-seq nové generace. Použití online dostupného datového souboru sc-RNAseq omezuje naši schopnost hlásit základní demografické charakteristiky pacientů. Tyto chybějící informace by mohly vyvolat obavy ohledně reprezentativnosti skupin obyvatelstva. Navíc jsme nekontrolovali žádný technický aspekt sekvenování. Proto při zvoleném rozlišení naše sc-RNAseq analýza nezjistila v těchto vzorcích žádný shluk neutrofilů nebo NK buněk. Proto byly naše následné analýzy miR-142-3p a miR{20}}p omezeny na vytvoření jejich příslušné cílové genové sítě a ontologie (doplňkový obrázek S2) a neumožňovaly žádné zkoumání rozlišení jedné buňky. Genová síť a ontologie 27 cílových genů miR-223-3p však odhalila obohacení cyklu TCA (doplňkový obrázek S2) spolu se signalizací ERBB. Můžeme tedy spekulovat, že jak miR-155-5p v monocytech, tak miR-223-3p v neutrofilech hrají roli v metabolismu a zánětlivé reakci těchto buněk během MVI. Kromě toho již bylo prokázáno, že miR-142-3p je zvýšena při odmítnutí aloštěpu ledviny (9, 55, 56), ale dosud nebyla specificky spojena s ABMR. Dalším omezením naší studie je, že specifické změny genové exprese ve vzácných infiltrujících buňkách mohou být maskovány při analýze hromadné genové exprese. Jsou tedy nutné další studie zahrnující více vzorků, aby bylo možné řádně prozkoumat všechny, dokonce i vzácné podtypy buněk, ale v současnosti jsou omezeny relativně vysokou cenou techniky.

Na závěr jsme zde zkoumali molekulární dráhy spojené s MVI, hlavním histologickým poškozením souvisejícím s ABMR. Použitý integrovaný omický přístup nám umožnil odhalit nové cesty zapojené do MVI a naznačuje, že k modifikacím tubulárního epiteliálního metabolismu dochází v důsledku ABMR mimo blízký endoteliální kompartment. Naše studie ilustruje velký potenciál multiomik při odhalování mechanismů onemocnění a připravuje cestu k novým výzkumům, které dále objasňují vzájemnou komunikaci meziledvinovérezidentní a aloštěp infiltrující buněčné podskupiny.