Vliv simulace lidského trávení in vitro na obsah fenolických látek a biologické aktivity vodných extraktů z tureckého druhu Cistus část 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abych to shrnul

Vodný extrakt C. salvifolius vykazoval lepší inhibiční aktivitu na trávicí enzym než extrakty jiných druhů. Navíc IN vzorky všech vodných extraktů odhalily nižší enzymové inhibiční aktivity ve srovnání se vzorky ND.

2.4. AGEs inhibiční aktivita

Jak je uvedeno v tabulce 4, inhibiční aktivita AGE závislá na koncentraci byla pozorována ve všech vodných extraktech. ND vzorky CCA, CPA a CSA vykazovaly lepší inhibiční aktivitu než referenční sloučenina kvercetin v koncentracích 0,5 i 1 mg/ml. Avšak pouze extrakt C. saluifolius vykazoval lepší inhibiční aktivitu než kvercetin mezi IN vzorky extraktů. Biologicky dostupné vzorky vodných extraktů vykazovaly nižší AGE inhibiční aktivity ve srovnání s neštěpenými vzorky. Podle výsledků měl ND vzorek vodného extraktu C. salvifolius nejvyšší inhibiční aktivitu vůči AGE. Vzorek IN vodného extraktu C. monspeliensis však vykazoval nejslabší potenciál inhibice AGE v testovaných koncentracích.

Kliknutím sem se dozvíte více

3. Diskuse

Volné radikály mohou napadnout proteiny, lipidy nebo DNA, aby získaly elektron, což má za následek různé zdravotní problémy. Z tohoto důvodu je nezbytné vyvážit antioxidační systém těla a volné radikály vzniklé oxidací. V případě zhoršení této rovnováhy vzniká oxidační stres [29]. Oxidační stres je jedním z hlavních faktorů vedoucích k různým chronickým poruchám, jako je rakovina, cukrovka, kardiovaskulární onemocnění, Alzheimerova choroba atd. Zatímco v lidském těle existují samo-antioxidační systémy, které bojují protioxidačnípoškození tkání a orgánů mohou tyto obranné systémy ztratit svou účinnost v důsledku různých podmínek, jako je nadměrná konzumace alkoholu, kouření, stres, chronické užívání drog, radiace atd. [30]. Různé vědecké zprávy ukázaly, že sekundární rostlinné metabolity hrají významnou roli v prevenci oxidačního stresu a jeho škodlivých účinků [13,14,31] I když je biologická dostupnost důležitým parametrem ovlivňujícím biologickou aktivitu těchto sloučenin, nebyla brána v úvahu při většina studií. Je však dobře známo, že sekundární metabolity podléhají strukturálním transformacím v důsledku různých podmínek pH, enzymatické aktivity a tělesné teploty v gastrointestinálním systému. Navíc chemické charakteristiky sekundárních metabolitů, jako je napřmolekulárníhmotnost, polarita a stupeň vazby na makromolekuly v matrici rostliny jsou rovněž významnými faktory ovlivňujícími jejich biologickou dostupnost [13]. V souladu s tím je absorpce sloučenin nebo jejich metabolitů do krevního řečiště po požití nezbytná pro uplatnění jejich systémových fyziologických účinků. Simulační modely trávení in vitro mohou poskytnout důkazy pro posouzení možných charakteristik biologické dostupnosti látek. Zatímco potvrzení v humánních zkouškách je nezbytné pro tvrzení o jakékoli funkční vlastnosti, in vitro simulační modely se široce používají jako alternativy k in vivo studiím nebo humánním zkouškám, které jsou často eticky diskutabilní, náročné na zdroje, drahé a časově náročné [32].

Cistanche může zlepšit imunitu

Několik výzkumníků také zkoumalo antioxidační potenciál extraktů připravených z různých orgánů druhu Cistus. Podle literárního průzkumu se jedná o první studii na druzích Cistus týkající se biologické dostupnosti fenolických látek a jejich vlivu na antioxidační aktivitu pomocí simulačního modelu trávení in vitro. Karas a kol. [33] navrhli, že 10 procent polyfenolických složek zůstává nestráveno v rostlinné matrici a 90 procent z nich je podrobeno trávení v žaludeční nebo střevní fázi (přibližně 48 procent a 52 procent, v tomto pořadí). Jak již bylo zmíněno dříve, všechna fenolická množství ve vodných extraktech byla negativně ovlivněna postupem simulace lidského trávení in vitro. Byly tak zjištěny významné ztráty ve fenolických obsahech biodostupných vzorků všech extraktů. Kromě toho byly celkové koncentrace proanthokyanidinů ve vzorcích IN ve všech vodných extraktech pod hranicí detekce. Různé studie také podnítily negativní vliv procesu trávení na fenolické sloučeniny v rostlinných extraktech a tím související bioaktivity. Například jsme uvedli celkový obsah fenolů v Salvia virgata Jacq. byl také nepříznivě ovlivněn procesem trávení v naší předchozí studii. Navíc množství hlavních metabolitů extraktu, tj. rutinu a kyseliny rozmarinové, mělo tendenci klesat [13]. Naproti tomu několik studií uvádí protichůdné výsledky. Ve studii Celeba a kol. [34] pozorovali zvýšení celkového množství fenolové kyseliny, flavonoidů a fenolů v biodostupných vzorcích metanolového extraktu z Hypericum perfoliatum L. Ve skutečnosti měly hlavní metabolity, kvercitrin, chlorogenová a gallová, poměr biologické dostupnosti přes 100 procento . Tyto studie ukázaly, že účinky procesu trávení se mohou lišit v závislosti na rostlinných materiálech. Pro objasnění těchto rozdílů je nezbytné zvážit mechanismus působení trávicího systému na fenolické látky. Serra a kol. [35] navrhli, že fenolické sloučeniny se nacházejí hlavně v glykosidech, polymerech a esterových formách v rostlinné matrici a před absorpcí jsou hydrolyzovány v trávicím systému. Strukturální přeměny fenolických sloučenin v gastrointestinálním traktu mohou ovlivnit různé faktory. Například sloučeniny s vyšší molekulovou hmotností, jako jsou proanthokyanidiny nebo prokyanidiny, musí být před absorpcí ve střevě hydrolyzovány. Struktura rostlinné matrice je také významným faktorem biologické dostupnosti fenolických látek; fenolové sloučeniny se mohou vázat na makromolekuly v rostlinné matrici, jako jsou vlákna, proteiny a molekuly lipidů. Tedy pouze uvolněné fenolické složky z matrice se mohou stát absorbovatelnými z gastrointestinálního traktu. Rozdílné hodnoty pH a enzymatické působení střevní mikrobioty navíc patří k dalším rozhodujícím faktorům ovlivňujícím transformaci chemické struktury fenolických sloučenin [36]. Ve světle těchto údajů můžeme předpokládat, že odlišné výsledky získané z podobných typů experimentálních studií mohou být způsobeny složitostí trávicího systému a složením rostlinné matrice. Jak je uvedeno v tabulce 3, biologicky dostupné vzorky extraktů Cistus vykazovaly slabší antioxidační aktivitu než netrávené a postgastrické protějšky kvůli jejich nižšímu obsahu fenolů.

Navíc oba extrakty C. saluifolius vykazovaly lepší antioxidační aktivitu v testech DPPH, CUPRAC, FRAP a TOAC ve srovnání s jinými druhy. Kromě toho oba extrakty C. paroiflorus vykazovaly vyšší aktivitu vychytávání DMPD radikálů než extrakty jiných druhů. Jak je uvedeno v tabulce 1, celkový obsah fenolických látek, flavonoidů a kyseliny fenolové v C. salviifolius byl vyšší než v ostatních vzorcích. Vyšší antioxidační potenciál extraktů C. saloiifolius tedy může souviset s jeho fenolickým obsahem.

Kromě toho snížení antioxidačních potenciálů, inhibičních aktivit na enzymy související se sacharidy a AGEs biodostupných vzorků může souviset s poklesem markerových flavonoidních glykosidů. Extrakty Cistus však obsahovaly i další fenolické látky, jak je znázorněno na obrázku 1. Proto je nutná podrobná chromatografická analýza extraktů pro sledování vlivu trávení na biologickou aktivitu.

Inhibiční potenciál rostlinných extraktů na trávicí enzymy v poslední době přitahuje větší pozornost kvůli obavám o bezpečnost syntetických inhibitorů. Inhibiční účinek rostlinných extraktů byl proto stanoven v několika studiích a tento účinek byl obecně spojován s fenolickými látkami, jako jsou flavonoidy, fenolové kyseliny, proanthokyanidiny atd. Sun et al. [37] navrhli, že polyfenolické sloučeniny projevují své inhibiční účinky vazbou s enzymy uvedenými výše pomocí hydrofobních sil a nekovalentních vazeb. Proto inhibice enzymové aktivity -amylázy a -glukosidázy polyfenoly souvisí s jejich molekulárními strukturami. I když byl tento mechanismus interakce studován pomocí různých technik, jako je kinetika inhibice, zhášení fluorescence v molekulovém dokování atd., nebyl dosud učiněn žádný jistý závěr [38]. Četné studie však uvádějí, že inhibice trávicích enzymů rostlinných extraktů přímo souvisí s jejich fenolickým obsahem. Podobné studie o enzymatických inhibičních aktivitách druhů Cistus byly také popsány dříve. Sayah a kol. [39] zkoumali inhibiční aktivity -amylázy a a-glukosidázy 80 procent methanolických a vodných extraktů z C. monspeliensis a C. saluifolius. Jejich výsledky byly v souladu s touto studií a odhalily, že vodný extrakt C. salvijfolius vykazoval vyšší -glukosidázu （IC50 ug/mL∶0.95±0.14） a o -amyláza (IC50 ug/ml~217,1±0,15）inhibiční aktivita než vodný extrakt C.monspeliensis （IC50 ug/ml~14,58±1,26） a （ICsn ug/ml:886,1) Míry inhibice obou vodných extraktů na tyto enzymy byly vyšší než u referenční sloučeniny akarbózy (ICso ug/ml:18,01±2.00)Podobně jako v naší studii zjistili korelaci s mírami inhibice enzymů a celkovým množství fenolů a flavonoidů. Jak celkový obsah fenolických látek, tak celkový obsah flavonoidů ve vodném extraktu C. salvijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE a 140 00 ± 1,15 RE) byly vyšší než ve vodném extraktu C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE a 78.00±1,15 RE). Orhan a kol. [40] také zkoumali inhibiční potenciál trávicích enzymů 80% vodných a ethanolických extraktů z listů C.laurifolius. Podle jejich výsledků vykazoval 80% ethanolický extrakt (71,7 procenta ±0,6) silnou inhibiční aktivitu na amylázu ve srovnání s vodným extraktem (39,3 procenta ±2,2) při koncentraci 1 mg/ml. Navrhli, že fenolové sloučeniny, zejména flavonoidy, přímo ovlivňují sekreci inzulínu tím, že zabraňují apoptóze beta-buněk a podporují antidiabetickou aktivitu. Tato hypotéza, korelující s našimi výsledky, ukazuje, že ND vzorek vodných extraktů C. salviifolius vykazoval nejvyšší celkový obsah flavonoidů a fenolů a největší inhibiční aktivity o-amylázy a o-glukosidázy. Jak je uvedeno v tabulce 4, vodný extrakt C. salviifolius vykazoval lepší inhibiční aktivity na trávicí enzymy než ostatní extrakty.

Navíc IN vzorky vodných extraktů obsahovaly nižší množství fenolů a flavonoidů než vzorky ND, a proto v této práci odhalily nižší enzymové inhibiční aktivity. Zatímco fenolické obsahy extraktů byly negativně ovlivněny procesem trávení, stále vykazovaly významnou inhibiční aktivitu na trávicí enzymy. V několika studiích byly flavonoidní glykosidy hlášeny jako hlavní metabolity rostlinných extraktů se silnýmia-amylázaa -glukosidázový inhibiční potenciál [41-43]Zatímco inhibiční mechanismus fenolových sloučenin na trávicí enzymy nebyl dosud odhalen, byly provedeny studie vztahu mezi strukturou a aktivitou na některých fenolických složkách, jako jsou flavonoidy, fenolové kyseliny, proanthokyanidiny a taniny Studie vztahu mezi strukturou a aktivitou flavonoidů ukázaly, že dvojná vazba C2=C3 kruhu C zvyšuje potenciál těchto sloučenin inhibovat trávicí enzymy. Protože tato vazba zvyšuje elektronovou hustotu, zvyšuje se síla interakce mezi flavonoidem a enzymem [44]. Hydroxylové skupiny na C-5 a C-7 navíc usnadňují potenciál flavonoidů inhibovat o-amylázu. Bylo také navrženo, že hydroxylace skeletu flavonoidů pozitivně ovlivňuje jejich a-amylázu a- enzym glukosidázainhibiční potenciál[45]. Jak bylo uvedeno dříve, všechny markerové flavonoidy v této studii byly flavonolové glykosidy nesoucí výše popsané strukturální požadavky. Avšak po in vitro štěpení jejich související aktivity významně poklesly v biologicky dostupných vzorcích vodných extraktů.

Obecně platí, že inhibiční potenciál rostlinných extraktů na AGE souvisí s několika faktory, tj. s jejich fenolickým obsahem, antioxidačním potenciálem, schopností chelatovat kovy, interakcí s proteiny a aktivitami blokujícími AGE receptory[13]. Jak je uvedeno v tabulce 4, biologicky dostupné vzorky vodných extraktů vykazovaly nižší AGE inhibiční aktivity ve srovnání se vzorky ND, protože in vitro štěpení nepříznivě ovlivnilo obsah fenolů v extraktech. Podle aktuálních výsledků studie měl ND vzorek vodného extraktu C.salvifolius nejvyšší inhibiční aktivitu vůči AGE a také celkový obsah fenolů a flavonoidů. Pro srovnání, IN vzorek vodného extraktu C. monspeliensis vykazoval nejslabší inhibiční potenciál AGE, což lze přičíst jeho nejnižšímu obsahu celkových flavonoidů a fenolů. Vzhledem k tomu, že flavonoidy jsou široce distribuovány v rostlinných extraktech, ovoci, zelenině a nápojích, několik studií zintenzivnilo inhibiční potenciál flavonoidů na formace AGE. Stejné flavonoidy přiřazené jako markerové fenolické látky v této studii byly také uvedeny jako markerové sloučeniny v jiných studiích[46-48].

Podobně jako u inhibice trávicího enzymu byly AGE inhibiční aktivity flavonoidů stimulovány dvojnou vazbou C2=C3 a hydroxylací kruhů A a C. Navázání cukru na flavonoidní kostru však vede ke snížení inhibiční aktivity [49]. Na druhé straně Cervantes-Lauren et al. [50] navrhli, že flavon{5}}glykosidů má větší inhibiční potenciál AGE než ostatní flavonoidní glykosidy. Tato hypotéza může být vysvětlením pro sníženou inhibici AGE v biologicky dostupných vzorcích. Například kvercitrin a hyperosid nebyly detekovány v biologicky dostupných vzorcích vodného extraktu C. monspeliensis, což je důvodem nižší aktivity IN vzorků C. monspeliensis ve srovnání s extrakty z jiných druhů. I když kvercitrin nebyl ve vodném extraktu C. saloifolius detekován, významně vyšší množství hyperosidu a salidrosidu může být příčinou jeho vysoké inhibiční aktivity AGE. Obecně byla pozorována pozitivní korelace mezi obsahem markerových flavonoidů ve vzorcích a jejich inhibičními potenciály na AGEs.

4. Materiál a metody

4.1.Chemikálie

Všechny reference, enzymy a chemikálie použité v experimentech byly zakoupeny od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). V experimentech byly použity materiály analytické kvality.

4.2. Vzorky rostlin

Letecké části C.creticus a C.saloifolius byly shromážděny z kampusu Yeditepe University (Kayisdagi, Istanbul) během posledního týdne v dubnu 2018. Letecké části C.mon-speliensis a C.paroiflorus byly shromážděny z blízkosti AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir ve druhém květnovém týdnu 2018. Letecké části C. laurifolius byly odebrány z Kemer-Doganhisar road, Konya, v prvním červnovém týdnu 2018. Prof. Dr. Erdem Yesilada ověřil rostlinné materiály. Poukazové vzorky pro C. creticus (YEF18013), C. lauri-folios (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroifforus (YEF18016) a C. salvifolus (YEF18014) byly uloženy v Herbarium, oddělení Pharma Farmaceutická fakulta, Yeditepe University, Istanbul, Turecko.

4.3. Postup extrakce

Vodná extrakce byla zvolena, protože se běžně používá jako technika přípravy v tradiční medicíně. Hrubě na vzduchu vysušené a práškové vzdušné částiCistanchedruhy (100 g) byly extrahovány horkou destilovanou vodou (80 stupňů, 1,5 l) za použití třepacího zařízení po dobu 15 minut. Poté byly vodné extrakty zfiltrovány přes filtrační papír a odpařeny do sucha za sníženého tlaku. Po dokončení lyofilizační procedury byly extrakty rozpuštěny v destilované vodě k dalšímu zpracování (nenaštěpený vzorek: ND) (výtěžek extraktů: 13,04 procent pro C. creticus, 15,7 procent pro C. laurifolius, 12,8 procent pro C. monspeliensis ,14,94 procenta pro C.parviflorus,14,74 procenta pro C.salvifolius).

4.4. Metoda simulace lidského trávení in vitro

Simulační model lidského trávení byl aplikován na vzorky Cistus in vitro podle metody popsané dříve Celebem a kol.[34]. Nejprve se 1 g NaCl a 1,6 g pepsinu rozpustilo v 500 ml destilované vody, aby se získal simulovaný roztok žaludeční tekutiny. (SGF). Později bylo pH roztoku SGF upraveno na 2 pomocí HCl (5 M); 17,5 ml tohoto roztoku bylo smícháno s 2,5 ml rostlinných vzorků a tato směs byla umístěna do třepací vodní lázně při 37 stupních po dobu 2 hodin. napodobují peristaltické pohyby trávicího systému. Po 2 hodinách byly vzorky vloženy do ledové lázně k inaktivaci enzymatických reakcí; 2 ml vzorků byly ponechány stranou jako "postgastrický" (P)vzorek pro další experimenty. Ve studených roztocích vzorků byla umístěna celulózová dialyzační membrána naplněná správným množstvím NaHC03 (1 M, pH 7); tak byla napodobena gastrointestinální absorpce. Poté bylo s roztoky spojeno 4,5 ml roztoku žlučových kyselin/pankreatinu a směs byla inkubována další 2 hodiny při 37 stupních. Nakonec byla tekutina uvnitř dialyzační membrány získána jako "biologicky dostupný" vzorek (IN). Po ukončení procedury byly všechny vzorky uchovány při -20 stupních pro další experimenty. 4.5. Odhad fenolického profilu in vitro

4.5.1. Zkouška celkového obsahu fenolů

Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu fenolů ve vzorcích bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle metody popsané dříve Barakem a kol.【32】; 75 ul NagCO3 (20 procent v H2O) bylo přidáno do 20 μl čerstvě připraveného vzorku a referenčních roztoků. Poté bylo se směsí smícháno 100 ul Folin-Ciocalteuova činidla. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti ve tmě byla měřena absorbance při 690 nm. Kyselina galová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky a celkový obsah fenolů byl vyjádřen jako ekvivalenty kyseliny gallové (GAE).

4.5.2. Stanovení celkového obsahu flavonoidů

Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu flavonoidů ve vzorcích bylo řízeno v 96-jamkové destičce šablony v souladu s dříve vysvětlenou metodou Bardakci et al.[51]; 150 ul 75% etanolu, 10 ul chloridu hlinitého a 10 ul 1M trihydrátu octanu sodného bylo odděleně smícháno s 50 ul roztoku vzorku a referenčního roztoku. Poté byly tyto směsi inkubovány při teplotě temné místnosti po dobu 30 minut. Po inkubační době byla vypočtena absorbance při 405 nm.kvercetinbyl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky a celkový obsah flavonoidů byl reprezentován jako ekvivalenty kvercetinu (QE). 4.5.3. Zkouška celkového obsahu kyseliny fenolové

Celkový obsah fenolové kyseliny ve vzorcích byl měřen spektrofotometricky podle postupu popsaného dříve Barakem et al. [52]. Nejprve byla správná množství dusitanu sodného a molybdenanu sodného rozpuštěna v destilované vodě, aby se získalo Arnowovo činidlo. Poté byl 1 ml vzorků oddělen s 1 ml Arnowova činidla, 1 ml 0,1 M HCl a 1 ml 1M NaOH. Poté byl objem směsi upraven na 10 ml destilovanou vodou a okamžitě byla odečtena absorbance při 490 nm. Kyselina kávová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky a celkový obsah kyseliny fenolové byl uveden jako ekvivalenty kyseliny kávové (CAE).

4.5.4. Zkouška celkového obsahu proanthokyanidinů

Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu proanthokyanidinů ve vzorcích bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle metody Baraka et al. [1] Stručně, 25 ul roztoků vzorků bylo smícháno se 150 μl 4% vanilinu a 75 μl roztoků HCl (32%). Po 15 minutách inkubace při teplotě temné místnosti byla absorbance upravena na 492 nm. Katechin hydrát byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Jako kontrolní roztok byl použit methanol. Celkový obsah proanthokyanidinů ve vzorcích byl uveden jako ekvivalenty katechinů (CE).

4.6. Testy aktivity vychytávání volných radikálů 4.6.1. Test aktivity pohlcování radikálů DPPH

Aktivita vychytávání radikálů DPPH vzorků byla stanovena v 96-jamkové destičce podle metody upravené Celebem et al.[53]. Nejprve bylo čerstvě připraveno 150 uM roztoku DPPH. Poté bylo 200 μl roztoku DPPH smícháno s 25 μl roztoků vzorků. Poté byla tato směs inkubována při teplotě temné místnosti po dobu 50 minut. Absorbance byla vypočtena při 540 nm. Butylovaný hydroxytoluen (BHT) byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích. Jako kontrolní roztok byl použit methanol. Aktivita vzorků byla prezentována jako EC50, odpovídající koncentraci vykazující 50% aktivitu.

4.6.2. Test aktivity DMPD zachycující radikály

Aktivita zachycování radikálů DMPD plus (N,N-dimethyl-p-fenylendiamin) vzorků byla provedena v templátu 96-jamkové destičky podle metody popsané dříve Inanem et al. [13]. Za prvé, 10{{10}} mM roztok DMPD plus, 0,05 M FeCl; 6H20 roztok a 0,01 M acetátový pufr byly čerstvě připraveny. Potom 1 ml roztoku DMPD, 100 ml acetátového pufru a 0,2 ml FeCl; Roztok 6H2O byl smíchán a později bylo 15 μl roztoků vzorků smícháno s 210 μl této směsi. Po inkubační době při teplotě temné místnosti po dobu 50 minut byla měřena absorbance při 492 nm. Trolox byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Koncentrace roztoků vzorků byly 1 mg/ml. Aktivity DMPD pohlcující radikály vzorků byly uvedeny jako ekvivalenty Trolox (TE). 4.7. Zkoušky aktivity snižující kov

4.7.1. Ferric Reducing Antioxidant Power Assay (FRAP)

Stanovení FRAP aktivity vzorků bylo provedeno na 96jamkové destičce podle postupu popsaného dříve Bardakci et al.[54]. Na začátku experimentu bylo FRAP činidlo vytvořeno smícháním acetátového pufru, železitého tripyridyltriazinu a FeCl; 6H2O roztoky. Poté bylo činidlo FRAP vloženo do 37stupňové pece na 30min. Poté bylo 10 ul roztoků vzorků smícháno s 30 ul destilované vody a 260 ul FRAP činidla, v daném pořadí. Po inkubační době při 37 stupních po dobu 30 minut byla absorbance upravena na 593 nm. K vyhodnocení výsledků byla vytvořena standardní křivka použitím různých molarit roztoku síranu železnatého (0,{15}} mM). BHT byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích. FRAP aktivity vzorků byly prezentovány jako mM FeSO4 v 1 g suchého extraktu.

4.7.2. Test antioxidační kapacity snižující měď (CUPRAC)

Aktivita CUPRAC vzorků byla stanovena v 96-jamkové destičce templátu podle metody upravené Celebem et al. 【31】; 85 μl CuSO4 （10 mM）, roztoky neocuprainu a octanu amonného a 51 ul destilované vody bylo přidáno do 43 ul roztoků vzorků, odděleně. Po inkubační době (20 minut) při 50 stupních ve vodní lázni byla měřena absorbance při 450 nm. Kyselina askorbová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Aktivity CUPRAC vzorků byly prezentovány jako ekvivalenty kyseliny askorbové (AAE). 4.8. Zkouška celkové antioxidační aktivity (TOAC) Stanovení celkové antioxidační aktivity vzorků bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle postupu Celeba et al. [55]. Nejprve bylo smícháno určité množství dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​tetrahydrátu molybdenanu amonného a kyseliny sírové, aby se získal roztok oktaacetátu trehalózy. Poté bylo 300 μl roztoku oktaacetátu trehalózy přidáno do 30 μl roztoků vzorků. Po inkubační době při 95 stupních ve vodní lázni po dobu 90 minut byla stanovena absorbance při 690 nm. Kyselina askorbová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Aktivity oktaacetátu trehalózy vzorků byly reprezentovány jako ekvivalenty kyseliny askorbové (AAE). 4.9. Odhad indexu biologické dostupnosti

Index biologické dostupnosti (BAvI) byl vypočten podle teoretické rovnice popsané Inanem et al.[13]: BAVI=CIN/CND „Index biologické dostupnosti“ (BAvI) byl popsán jako poměr počtu fenolických látek. v biologicky dostupném vzorku (IN) na vzorek v neštěpeném vzorku (ND). 4.10. Kvantifikace markerových flavonoidů pomocí HPTLC

Kvantitativní stanovení koncentrací salidrosidu, hyperosidu a kvercitrinu ve všech simulačních vzorcích (ND, PG, IN) vodných extraktů z druhů Cistus bylo provedeno pomocí vysokoúčinné tenkovrstvé chromatografie (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Švýcarsko) podle metody ověřené Guzelmericem et al.[16]. Hyperosid, salidrosid a kvercitrin byly připraveny v koncentracích 25, 50 a 100 ug/ml a koncentrace čerstvě připravených roztoků vzorků byly upraveny na 10 mg/ml. Tyto roztoky byly aplikovány na normální fázi silikagelové desky se skleněným podkladem (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Německo） s určitými objemy (1-5 μl standardních roztoků a 5 ul roztoků vzorků) pomocí 100 μl injekčních stříkaček（ Hamilton, Bonaduz, Švýcarsko）. Postup aplikace byl proveden pomocí aplikátoru vzorků Linomat 5. Proces vývoje byl proveden v automatické vývojové komoře (ADC 2) a ethylacetát:dichlormethan.kyselina octová.kyselina mravenčí:voda (10:25:10 :10:10:10me) byla vybrána jako mobilní fáze.Poté byly destičky derivatizovány pomocí Natural Product Reagent (NPR) (1g difenylboricacid 2-aminoethylesterinu 200 ml ethylacetátu) v imerzním zařízení (CAMAG).hyperosida kvercitrin byly analyzovány spektrofotometricky při 260 nm, množství salidrosidu bylo měřeno při 330 nm UV skenerem. Hodnoty Rf standardů byly stanoveny jako hyperosid （≈0,35）, kvercitrin （≈0,45）, tilirosid （≈0,65）. Korelační koeficienty (r2）) byly zjištěny ×8. pro kvantifikaci markerových flavonoidů.

4.11. Inhibiční aktivita na enzymy související s diabetem

4.11.1. - Inhibiční aktivita glukosidázy

-glukosidázové inhibiční aktivity neštěpených a biologicky dostupných vzorků získaných z vodných extraktů druhů Cistus byly zkoumány podle metody dříve vysvětlené Balanem et al. [56]. Nejprve byla správná množství fosforečnanu sodného a fosforečnanu sodného smíchána se získáním 100mM fosfátového pufru (pH7). o--glukosidázový enzym byl rozpuštěn ve fosfátovém pufru, aby se získal roztok a-glukosidázy （0,2U/ml）. Poté bylo 170 ul fosfátového pufru, 20 μL roztoku -glukosidázy a 20 ul roztoků vzorků smícháno a inkubováno v sušárně při 37 stupních po dobu 15 minut. Poté byly ke směsi přidány 20 μl 2,5 mM roztoku p-nitrofenyl- -D-glukopyranosidu ve 100 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,0) a byla provedena další inkubační doba při 37 stupně po dobu 15 min. Poté bylo ke směsi přidáno 80 ul 0,2 M roztoku uhličitanu sodného pro ukončení reakce. Absorbance byla měřena při 405 nm. Jako referenční byl použit roztok kvercetinu v různých koncentracích. Výsledky byly odhadnuty jako procento inhibiční aktivity v 1 mg/ml a 0,5 mg/ml koncentracích ND a IN vzorků vodných extraktů druhů Cistus. 4.11.2. Inhibiční aktivita o-amylázy Inhibiční aktivita o-amylázy u neštěpených a biologicky dostupných vzorků získaných z vodných extraktů druhů Cistus byla stanovena podle postupu popsaného dříve Balanem a kol. [56]. Spektrofotometrické stanovení inhibičních aktivit a-amylázy vzorků bylo provedeno za použití činidla DNS (kyselina 3,5-dinitrosalicylová). Jak je uvedeno v metodě, maltóza vzniká přeměnou škrobu a žlutá barva alkalického DNS se změní na oranžovo-červenou barvu v důsledku maltózy vyrobené ze škrobu. Takto byl připraven 96 mM roztok DNS ze směsi roztoku vinanu sodnodraselného (rozpuštěného ve 2 M NaOH) a určitého množství DNS (rozpuštěného v destilované vodě). Poté byl připraven 20 mM pufr fosforečnanu sodného s 6,7 mM NaCl (kofaktor enzymu u-amylázy) při 20 stupních (pH: 6,9). enzym a-amyláza (1 U/ml) a škrob (10 mg/ml) byly rozpuštěny v tomto pufru. Poté bylo 50 μl pufru fosforečnanu sodného a 10 μl roztoku enzymu a-amylázy smícháno s 20 μl roztoků vzorků. Tato směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 45 minut. Po inkubační době bylo ke směsi přidáno 20 ul roztoku škrobu. Další inkubační doba byla zahájena při 37 stupních po dobu 45 minut. Stejný postup byl aplikován na vzorky bez přidání roztoku enzymu w-amylázy nazývaného "pozadí vzorku". Kontrolní skupina byla studována stejným postupem v nepřítomnosti roztoků vzorků. Absorbance byla měřena při 540 nm. Akarbóza byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích. Výsledky byly prezentovány jako procento inhibiční aktivity v koncentracích 1 mg/ml a 0,5 mg/ml vzorků ND a IN z vodných extraktů druhů Cistus. 4.11.3. AGE inhibiční aktivita AGE inhibiční aktivita neštěpených a biologicky dostupných vzorků z vodných extraktů druhů Cistus byla stanovena podle metody popsané Starow-icz et al. [57]. Před jakýmkoli procesem byly čerstvě připraveny vzorky ND a IN o koncentracích 1 mg/ml a 0,5 mg/ml. Poté byl 1 ml roztoku bovinního sérového albuminu (BSA) o koncentraci 10 mg/ml přidán k 1 ml roztoků vzorků ND a IN. Kontrolní vzorky byly připraveny bez přidání ND a IN vzorkových roztoků a slepé vzorky byly připraveny bez přidání 0,5 M glukózy. Poté byly všechny připravené vzorky inkubovány po dobu 40 hodin v třepané vodní lázni při 55 stupních. Po skončení inkubační doby byla pro výpočet intenzity fluorescence použita multimódová čtečka mikrodestiček Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX v rozsahu 370 nm excitace/440 nm emise. Quercetin byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích.

4.12 Statistická analýza

Všechny experimenty byly nezávisle prováděny třikrát v různých časech. K určení parametrického nebo neparametrického rozložení dat byl použit softwarový program GraphPad Prism (verze 6.1). Jednocestná ANOVA Tukey's Sekce analýzy vícenásobných porovnání byla použita k vyhodnocení testů TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH a DMPD. Na druhé straně byly výsledky experimentů inhibice o-amylázy, -glukosidázy a AGE zkoumány dvoucestnou srovnávací analýzou ANOVA Sidak. Významné výsledky byly prokázány s p<0.05. 5.="">

V této studii byly zkoumány vodné extrakty všech druhů Cistus zaznamenaných v turecké flóře na jejich fenolické profily a in vitro antioxidační a antidiabetický potenciál. Vzhledem k tomu, že odvar nebo infuze jsou běžnou formou v tradiční medicíně, je použití vodných extraktů pro hodnocení aktivity v experimentálních studiích obzvláště důležité. Na druhé straně hydrofilní složky ve vodném extraktu podléhají řadě metabolických přeměn v gastrointestinálním systému, jakmile jsou požity. Pro správné vyhodnocení aktivity tradičních formulací by proto měly být zkoumány také aktivity biologicky dostupných metabolitů.

Toto je první studie, která zkoumá důsledky in vitro simulační metody lidského trávení na turecké druhy Cistus. Kromě toho byl v této studii poprvé studován inhibiční potenciál tureckých druhů Cistus na AGE. Dále byly přiřazeny markery salidrosidu, hyperosidu a kvercitrinuflavonoidya změny jejich koncentrací byly sledovány v in vitro štěpení. Zatímco obsah fenolů a antidiabetické a antioxidační aktivity extraktů byly negativně ovlivněny gastrointestinálními trávicími procedurami, stále vykazovaly významnou bioaktivitu. Podle výsledků byl extrakt C.saloifolius detekován jako nejúčinnější rostlina z hlediska obsahu fenolů a antioxidační a antidiabetické aktivity. Závěrem lze říci, že nadzemní části z tureckých druhů Cistus mají bohatý obsah fenolů a potenciální antioxidační a antidiabetické aktivity. I když byla k hodnocení biologické dostupnosti použita metoda simulace trávení in vitro, nemusí plně napodobovat metabolické dráhy vyskytující se v organismu. Proto jsou nutné další in vivo a klinické studie, aby se podrobně vyhodnotila biologická dostupnost fenolických sloučenin a jejich podíl na uváděných farmakologických účincích.

Tento článek je extrahován z Molecules 2021, 26, 5322