ABSTRAKTNÍ

Cíle:Maclura pomifera (Rafin.) Schneider je celosvětově rozšířený druh, který se také často pěstuje pro okrasné účely. Předchozí studie odhalily, že plody M. pomifera jsou bohaté na prenylované isoflavonoidy, vykazují pozoruhodné biologické aktivity a mají pravděpodobné výhody, zejména při místní aplikaci. Vzhledem k tomu, že fenolické sloučeniny jsou základními zdroji při vývoji kosmetických produktů proti stárnutí, tato studie zkoumala potenciál proti stárnutí M. pomifera 80% metanolového extraktu (MPM) vyhodnocením antioxidační aktivity a inhibiční aktivity enzymů degradujících extracelulární matrici.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý reparační účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Materiály a metody:Pro tuto studii byl hodnocen inhibiční potenciál 80 procent MPM proti různým enzymům spojeným s procesem stárnutí. Vzhledem k jednoznačné roli oxidačního stresu při stárnutí byly použity i antioxidační testy in vitro. Navíc byl osajin stanoven jako hlavní bioaktivní isoflavonoid vzorku pomocí vysokoúčinné chromatografie na tenké vrstvě.

Výsledek:Výsledky mechanisticky odlišných antioxidačních testů prokázaly významný antioxidační potenciál extraktu. Byl zkoumán inhibiční potenciál MPM proti enzymům hyaluronidázy, kolagenázy a elastázy, které jsou přímo spojeny s urychlením procesu stárnutí, a výsledky ukázaly, že MPM explicitně inhibuje výše uvedené enzymy. MPM měl jedinečný obsah fenolů a flavonoidů; 113,92 ± 2,26 mg ekvivalentu kyseliny gallové/ga 66,41 ± 0,74 mg QE/g, v daném pořadí. Když byly zváženy testy celkové antioxidační kapacity, je možné navrhnout, že MPM je slibným prostředkem proti stárnutí.

Závěr:Výsledkem této studie je zjištění, že extrakty z plodů M. pomifera mají významný potenciál proti stárnutí a lze je k tomuto účelu použít.

Klíčová slova:Maclura pomifera, anti-aging, antioxidanty, HPTLC, osajin

ÚVOD

Stejně tak všechny orgány, včetně lidské kůže, procházejí s postupujícím věkem různými fyziologickými změnami.1 Existují dvě třídy stárnutí: přirozené stárnutí je řízeno genetikou a vnější stárnutí je přirozeným výsledkem fyziologických změn v důsledku škodlivých účinků faktorů prostředí, jako je ultrafialové (UV ) záření, chemické toxiny a kouření.1,2 Degradace vaskulární a žlázové struktury, ztráta fibrózní tkáně a snížení regenerace buněk jsou základními faktory stárnutí,3 které vedou k nárůstu degenerace tkání, vráskám a úbytku extracelulární matrix (ECM ).4

Jako největší orgán má kůže několik rolí, jako je ochrana, regulace tělesné teploty a detekce smyslů.5 Kůže se skládá z epidermis, dermis a podkožní tkáně a je první bariérou mezi lidským tělem a vnější prostředí.6,7 ECM je největší jednotkou dermis a podporuje růst a elasticitu tím, že představuje strukturální lešení.8 Kolagen, elastin a fibronektin, které jsou tvořeny dermálními fibroblasty, tvoří ECM a jsou fúzovány s proteoglykany.5 Kolagen je základní protein obsahující přibližně 25-35 procent veškerého obsahu bílkovin v těle a nachází se v extracelulárním prostoru různých typů živočišných pojivových tkání.3 Jednou z hlavních příčin stárnutí kůže a tvorby vrásek je změna kolagenu struktura.1 Elastin je protein, který propůjčuje pokožce jedinečnou fyziologickou elasticitu a je přítomen v několika pojivových tkáních.6 Hydratace pokožky a udržování pokožky hladké, vlhké a promaštěné jsou důležitými faktory, které zabraňují stárnutí pokožky. V těchto činnostech hraje zásadní roli glykosaminoglykan (GAG), kyselina hyaluronová.8 Tyto klíčové složky jsou degradovány enzymy hyaluronidázou, kolagenázou a elastázou, což vede k urychlení stárnutí kůže. Kromě toho expozice mikroorganismům, znečištění, ionizujícímu záření, chemikáliím a toxinům vede k tvorbě reaktivních forem kyslíku (ROS) a má škodlivé důsledky urychlující stárnutí kůže.9 ROS může iniciovat složité molekulární dráhy a v důsledku toho kolagenáza, elastáza a aktivita hyaluronidázy může být zvýšena, což vede k detekovatelnému rozpadu ECM a úpravám textury pokožky.10 Z uvedených důvodů mohou nové přírodní látky, které snižují tvorbu ROS a inhibují proteázy degradující ECM, zpomalovat proces stárnutí kůže.11

Maclura pomifera (Rafin.) Schneider patří do čeledi Moraceae nebo morušovité a je také známá jako pomerančovník osikový, pěstovaný téměř po celém světě.12 M. pomifera má několik biologických aktivit, jako je antibakteriální, antifungální, antivirová, cytotoxická, protinádorová, estrogenní, a antimalarikum13 díky prenylovaným isoflavonům, tj. osajinu a pomiferinu, které jsou považovány za hlavní metabolity plodů.14 Ve výrobě kosmetiky proti stárnutí jsou významnými přírodními zdroji fenolické sloučeniny. Existuje tedy rostoucí zájem o studium rostlin bohatých na fenolické sloučeniny, jako je M. pomifera, pro takové aktivity. Předchozí studie zjistily, že isoflavony Maclura zvyšují hladiny exprese kolagenu, elastinu a fibrilinu srovnatelné nebo lepší než ekvivalentní koncentrace retinolu. Lze tedy předpokládat, že isoflavony Maclura jsou silnými stimulanty proteinů ECM.15 S ohledem na tato data je cílem této studie prozkoumat potenciál proti stárnutí M. pomifera 80% metanolového extraktu (MPM) zkoumáním jeho potenciálu pro antioxidační bioaktivitu a inhibici Enzymy degradující ECM. Kromě toho byla měřena kvantitativní analýza hlavní bioaktivní složky extraktu, osajinu, pomocí vysokoúčinné chromatografie na tenké vrstvě (HPTLC) a byly provedeny testy celkového obsahu fenolů a celkového obsahu flavonoidů pro přesnější pochopení fenolického profilu. Výsledky ukazují, že M. pomifera může být cenným zdrojem produktů proti stárnutí.

MATERIÁLY A METODY

Chemikálie

Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) poskytla všechny enzymy, chemikálie a reference použité v testech. Kvalita všech chemikálií byla analytické kvality.

Přírodní materiál

Plody M. pomifera byly shromážděny z Uşaku, Türkiye, v květnu 2020. Dr. Hilal Bardakcı provedl botanickou identifikaci vzorků rostlin. Poukázkový vzorek rostliny byl uložen na Acıbadem University, Herbář Farmaceutické fakulty (ACUPH 00002).

Příprava extraktů

Plody byly rozděleny na malé kousky a protlačeny mixérem. Plody (6,45 kg) byly macerovány s 3125 ml 80% methanolu (MeOH) za použití třepacího zařízení po dobu tří dnů při pokojové teplotě na tmavém místě. Macerát byl zfiltrován a tento postup byl dvakrát opakován. Získané filtráty byly spojeny a poté byl methanol odpařen na rotační odparce. Surový methanolický extrakt byl lyofilizován (výtěžek byl 204,37 g, 3,16 procent) a skladován při -20 stupni (MPM).

Postup kvantifikace hlavních bioaktivních sloučenin pomocí HPTLC

Všechny použité chemikálie a činidla byly analytické čistoty. Chloroform (CHC13) a ethylacetát (EtOAc) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich. Komerčně dostupný standard osajinu byl zakoupen od Sigma-Aldrich (SMB {{10}}0092). HPTLC analýzy byly provedeny na 20 cm x 10 cm skleněných HPTLC silikagelových 60 F254 deskách (Merck, Darmstadt, Německo). Obsah Osajinu v MPM byl stanoven analytickým systémem CAMAG HPTLC. Mobilní fázi použitou v této studii již dříve popsal Bozkurt et al.16 během izolace aktivních látek M. pomifera. Jako analytický testovací roztok byl použit 10 mg/ml MeOH extrakt. Standardní zásobní roztok (0,5 mg/ml) osajinu byl připraven za použití 2 ml acetonu. Pracovní roztok s koncentrací standardní sloučeniny 50 ug/ml byl připraven zředěním acetonem ze zásobního roztoku. Každý vzorek byl filtrován přes 0,45 um injekční filtr. 10 μl extraktu spolu s alespoň pěti různými koncentracemi standardního roztoku (3.3-4,7 μL) bylo naneseno ve formě pásů o délce 8 mm na silikagelové skleněné HPTLC desky 60 F254 s CAMAG Automatic TLC Sampler IV. Vývoj byl proveden v automatické vyvíjecí komoře CAMAG-2 (ADC- 2) a mobilní fáze byla CHCI3:EtOAc [8:2 (obj./obj.)]. Komora byla nasycena po dobu 10 minut a destička byla před vývojem předkondicionována po dobu 5 minut. Vlhkost byla řízena ADC-2 pomocí MgCl2 (33 procent RH) po dobu 10 minut. Denzitometrické vyhodnocení bylo provedeno pomocí CAMAG TLC Scanner IV ve fluorescenčním módu. Rozměr štěrbiny byl udržován na 5 x 0,2 mm, mikro, a rychlost skenování byla nastavena na 20 mm/s. Standardní obsahy byly získány porovnáním plochy pod provozními charakteristikami přijímače (AUC) s kalibrační křivkou standardů při 280 nm. Přítomnost standardů v extraktu byla zajištěna porovnáním obou retenčních faktorů (Rf) a překrývajících se UV spekter každého extraktu a standardu. Množství osajinu bylo stanoveno porovnáním intenzity difúzně odraženého světla z extraktu a frakcí se standardní sloučeninou.

Obsah osajinu v surovém rostlinném extraktu byl měřen pomocí HPTLC-denzitometrie. Bylo zjištěno, že hodnota Rf standardu osajin je 0,556. Výskyt osajinu v testovaných vzorcích byl ověřen porovnáním jejich Rf hodnot a překrývajících se jejich UV spekter (obrázek 1). Kvantifikace byla umožněna porovnáním AUC vzorků s kalibrační křivkou získanou za použití standardní sloučeniny osajin. Kalibrační funkce byla y=2.268*10-8x. Korelační koeficient (R) a variační koeficient kalibrační funkce byly 0,998 procenta a 1,{11}}6 procent. Analýza HPTLC ukázala, že MPM obsahuje 0,22 procenta (hmotn./hmotn.) osajinu. Výsledky HPTLC studie jsou uvedeny v tabulce 1.

Test fenolického profilu

Test celkového obsahu fenolu

Test byl proveden za účelem vyhodnocení celkového obsahu fenolů ve vzorcích metodou Folin-Ciocalteu, kterou dříve použili Kurt-Celep et al. ) a 100 ul FCR (Folin-Ciocalteuovo činidlo) zředěné H20 (1:9). Po inkubaci po dobu 30 minut při 45 stupních byla absorbance směsí odečtena spektrofotometricky při 765 nm. Výsledky byly vyjádřeny jako mg ekvivalentů kyseliny gallové (GAE) na g extraktu.

Test celkového obsahu flavonoidů

Měření celkového obsahu flavonoidů ve frakcích bylo provedeno způsobem, který již dříve uvedl Bardakci et al.18 Stručně, čerstvě připravený 1 M CH3 COONa a 10 procent AlCl3 byly smíchány se vzorky. Poté byla provedena 30 minutová inkubace směsí při teplotě místnosti a ve tmě. Po procesu inkubace byla vypočtena absorbance při 415 nm. Výsledky byly potvrzeny jako mg ekvivalentů kvercetinu (QE) v 1 g vzorku.

Stanovení antioxidační aktivity in vitro

2,2-test aktivity vychytávání radikálů difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH)

Pro stanovení aktivity vychytávání radikálů DPPH byla provedena kombinace čerstvě zředěných roztoků vzorků (různé koncentrace připravené z 1 mg/ml zásobního roztoku) a methanolického roztoku DPPH (100 mM). Po inkubačním intervalu při teplotě místnosti po dobu 45 minut byla odečtena absorbance při 517 nm. Butylovaný hydroxytoluen (BHT) byl použit jako referenční sloučenina pro získání kalibrační křivky. Hodnoty IC50 výsledků byly uvedeny jako ug/ml.19

Ferric redukční antioxidační síla (FRAP) test

K získání FRAP činidla, 25 ml 300 mM acetátového pufru (pH 3,6), 2,5 ml TPTZ [2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazin] a 2,5 ml FeCl3.6H20 (20 mM). Poté bylo 10 ml vzorku přidáno do 260 ml FRAP činidla a zředěno na 300 ml destilovanou vodou na 96jamkové destičce. Po inkubaci po dobu 30 minut při 37 stupních bylo provedeno měření absorbance při 593 nm. BHT byl použit jako referenční sloučenina. K získání standardní křivky byl použit roztok chloridu železnatého (0,252 mM) a výsledky byly uvedeny jako mM FeSO4 v 1 g suchého extraktu.

Test antioxidační kapacity snižující měď (CUPRAC).

Test CUPRAC byl odhadnut podle metody popsané dříve Barakem a kol.21 Stejné objemy 10 mM CuS04, neocuprainu a pufru octanu amonného (85 ml) byly smíchány v 96-jamkové destičce. Poté bylo ke směsi přidáno 51 ml destilované vody a 43 ml roztoků vzorků. Po inkubaci po dobu 20 minut byla odečtena absorbance při 450 nm. Výsledky byly uvedeny jako mg ekvivalentu kyseliny askorbové v 1 g suchého extraktu.

Stanovení testu celkové antioxidační kapacity (TOAC).

Test celkové antioxidační kapacity byl vypočten podle fosfomolybdenové metody vysvětlené dříve Barakem et al.22 Za prvé, k získání roztoku oktaacetátu trehalózy; Smísilo se 28 mM dihydrogenfosforečnan sodný, 4 mM molybdenan amonný a 600 mM H2S04. Poté bylo 300 ul roztoku oktaacetátu trehalózy smícháno s 30 ul roztoků vzorků v 96 zdravých destičkách. Po inkubační době při 95 stupních po dobu 90 minut byla odečtena absorbance při 695 nm. K získání standardní křivky byla použita kyselina askorbová a výsledky byly vypočteny jako ekvivalenty mg Troloxu v 1 g suchého extraktu.

Inhibiční aktivita na enzymy související se stárnutím pokožky

Anti-kolagenázová aktivita

Pro měření anti-kolagenázové aktivity MPM byl připraven 50 mM roztok tricinového pufru (pH: 7,5) (400 mM NaCl a 10 mM CaCl2). Clostridium histolyticum (ChC - EC. 3.4.23.3) bylo použito jako zdroj kolagenázy, která byla rozpuštěna v 50 mM roztoku tricinového pufru pro dosažení počáteční koncentrace 0,8 U/ml. Jako substrát byly použity 2 mM N-[3-(2-furyl)akryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) rozpuštěné v tricinovém pufru. Extrakty byly inkubovány s enzymem kolagenázou v roztoku pufru po dobu 15 minut před přidáním substrátu pro zahájení reakce. Finální reakční směs obsahovala celkový objem 150 ul; tricinový pufr, 0,8 mM FALGPA, 0,1 jednotky ChC a 25 ul MPM. Pro slepé výsledky byla použita voda. Po přidání substrátu bylo okamžitě provedeno měření absorbance. Pozitivní kontroly prováděly epigalokatechin galát (EGCG).23

Antielastázová aktivita

Hodnocení MPM na antielastázovou aktivitu bylo provedeno pomocí 0,2 mM Tris-HCl pufrového roztoku (pH: 8.0). Zásobní roztok elastázy (PE, EC 3.4.21.36) získaný z prasečí slinivky břišní byl připraven s destilovanou vodou o koncentraci 3,33 mg/ml. N-sukcinyl-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAAPVN), který má být použit jako substrát, byl rozpuštěn v roztoku pufru (1,6 mM). Extrakt MPM byl před přidáním substrátu inkubován s 1 ug/ml PE po dobu 15 minut při 37 stupních. Na konci 15minutové předinkubace byl k enzymové směsi obsahující 1 mg/ml rostlinného extraktu přidán 0,8 mM substrát AAAPVN a inkubace byla provedena znovu po dobu 15 minut při 37 stupních. Při použití 0,25 mg/ml EGCG jako pozitivní kontroly tento testovací vzorek obsahuje stejný objem EGCG místo MPM a nastavení testu bylo opakováno. Po inkubačních periodách byla provedena měření ve 4 různých časových bodech po dobu 5 až 30 minut pomocí Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer při excitaci 365 nm a emisi 410 nm.24, 25

Antihyaluronidázová aktivita

Antihyaluronidázová aktivita byla provedena modifikací metody popsané Kolayli et al.26 a Lee et al.3 Nejprve byla komerčně zakoupená hyaluronidáza (EC 3.2.1.35, Sigma-Aldrich) rozpuštěna v 0. 02 M fosfátový pufr (pH: 3,5) obsahující NaCl a hovězí sérový albumin. Poté byla kyselina hyaluronová, vhodný substrát enzymu, připravena v acetátovém pufru (0,1 M, pH: 3,5) a připravena k použití. Testovací směs sestávající z 20 ul MPM v koncentraci 1 mg/ml, 10 ul hyaluronidázy a 60 ul 0,1 M acetátového pufru byla preinkubována po dobu 20 minut při 37 stupních. Po inkubační době bylo ke směsi přidáno 10 ul kyseliny hyaluronové a znovu inkubováno při 37 stupních po dobu 20 minut. Na konci celkové inkubační doby byla provedena měření v různých časových bodech pomocí Thermo Scientific Multiskan SkyHigh Microplate spektrofotometru při 600 nm. Slepá skupina neobsahovala enzymy v experimentálním uspořádání, zatímco kontrolní skupina neobsahovala extrakt. Procento antihyaluronidázové aktivity bylo vypočteno pomocí následující rovnice:

Aktivity proti stárnutí ( procenta )= [(Abs kontroly - Abs vzorku)/ Abs kontroly] × 100

Statistická analýza

Experimenty s antielastázovou, antikolagenázovou a antihyaluronidázovou aktivitou zahrnuté v této studii byly opakovány třikrát nezávisle. Statistický rozdíl byl analyzován pomocí t-testu softwaru GraphPad Prism 8 (p menší nebo rovno 0,05).

VÝSLEDKY A DISKUSE

Stanovení potenciálu proti stárnutí

Elastin, kolagen a kyselina hyaluronová jsou známé obsahy ECM, které hrají klíčovou roli v mladém vzhledu pokožky. Elastin je životně důležitý protein pro udržení elastických vlastností pokožky, v důsledku toho úbytek elastinu v ECM vede k urychlení procesu stárnutí.27 Předchozí literatura uvádí přímou souvislost mezi vráskami a stárnutím pokožky se sníženým množstvím elastinu.28 Kyselina hyaluronová je hydrofobní molekula GAG, která je depolymerizována pomocí hyaluronidázy. Kyselina hyaluronová je zásadní pro udržení hladkosti pokožky a stabilní vlhkosti; proto bylo prokázáno, že nadměrné narušování vede k vysoušení a vrásnění kůže.29 Procesem stárnutí v průběhu času způsobuje snížená hladina kolagenu ztenčení dermis, což je při mikroskopickém vyšetření považováno za výraznou indikaci.3{{23 }} Bylo přesně uvedeno, že oddálení odbourávání kolagenu prostřednictvím inhibitorů kolagenázy následně zpomaluje vrásnění a stárnutí struktury kůže.5 Vzhledem k této informaci mají látky, které inhibují elastázu, kolagenázu a hyaluronidázu, pozoruhodný potenciál pro produkty proti stárnutí. Předchozí studie prokázaly, že různé isoflavonoidy vykazují významnou inhibiční biologickou aktivitu proti výše uvedeným enzymům. Addotey et al.31 prokázali, že čtyři různé isoflavonoidy inhibovaly hyaluronidázu až o 61,2 procenta. Kim et al.32 prokázali, že izolovaný isoflavonoid z Glycyrrhiza uralensis Fisch., licoricidin, má významnou inhibiční aktivitu na elastázu. Hodnota IC50 lékořice byla vypočtena jako 61,2 ± 4,2 uM, zatímco kyselina oleanolová byla vypočtena jako 131,4 ± 11,4 jako referenční sloučenina. Výsledky ukázaly, že isoflavonoidy mohou inhibovat enzymy elastázu. V souladu s výše uvedenou studií Kim et al.33 studovali devět různých prenylovaných isoflavonoidů, mimořádně příbuzných struktur s osajinem, izolovaných z kořenů Flemingia philippinensis Merr. & Rolfe. Výzkumníci oznámili, že pět z prenylovaných isoflavonů mělo silnou inhibiční aktivitu proti neutrofilní elastáze, hodnoty IC50 se pohybovaly mezi 1.9-12,0 µM, zatímco hodnota IC50 kyseliny oleanolové byla 28,4 µM. V jiné studii Ergene Öz et al. 34 zkoumali in vitro inhibiční aktivitu pěti isoflavonoidů izolovaných z kořenů Ononis spinoza L. proti hyaluronidáze, kolagenáze a elastáze. Hyaluronidázová inhibiční aktivita isoflavonů byla hlášena mezi 22.{29}},58 procenty, zatímco při stejné koncentraci kyselina tříslová vykazovala 88,32 procenta inhibice. Výsledky inhibice kolagenázy byly vypočteny mezi 20.41- 28,49 procenty a inhibice elastázy byla naměřena jako 20.47-46,88 procent . EGCG byl použit jako referenční pro oba testy a inhibiční aktivity při stejné koncentraci byly naměřeny jako 41,18 procenta a 84,64 procent, v daném pořadí. Další studie zkoumala místní léčbu pomiferinem přímo izolovaným z M. pomifera. 15 Pomiferin je prenylovaný isoflavonoid, který se nachází v plodech M. pomifera a jeho molekulární struktura se mimořádně podobá osajinu. Výzkumníci uvedli, že pomiferin vykazoval silnou aktivitu stimulace proteinu ECM zvýšením kolagenu a elastinu, který je lepší nebo ekvivalentní referenční sloučenině, retinolu. Všechny zmíněné studie odhalily, že isoflavony jsou středně silné až silné inhibitory těchto enzymů a mají významný potenciál jako přírodní materiály proti stárnutí.

V této studii byly zkoumány in vitro hyaluronidázové, kolagenázové a elastázové inhibiční aktivity MPM pro stanovení potenciálu proti stárnutí. Srovnávací test byl proveden pro test inhibice kolagenázy ve dvou časových bodech, např. 20 a 40 min, jak pro MPM, tak pro referenční sloučeninu, EGCG. Výsledky ukázaly, že inhibiční aktivita kolagenázy se s časem zvyšovala. 1 mg/ml MPM vykazoval 84,55 ± 1,99 procenta inhibice, zatímco 25{{40}}} ug/ml EGCG vykázal 84,66 ± 1,83 procenta po 20 minutách inkubace. Inhibiční biologická aktivita byla amplifikována v průběhu času, po 40 min. MPM a EGCG inhibovaly kolagenázu na 94,68 ± 2,42 procent a 94,98 ± 2,81 procenta, v daném pořadí. V souladu s literaturou vykazoval MPM významnou inhibiční aktivitu proti elastáze. Výsledky byly měřeny ve čtyřech bodech (5, 10, 20 a 30 minut) a prokázaly nárůst v čase (obrázek 2). EGCG (250 µg/ml) bylo použito jako reference a inhibiční aktivita se v každém časovém bodě zvýšila (44,07 ± 0.00 procent , 52,19 ± 0.00 procent , 64,69 ± 0.{{41 }} procent a 86,21 ± 0.00 procent, v tomto pořadí). Mezitím MPM v koncentraci 1 mg/ml vykazoval vyšší zesilující a inhibiční aktivitu, která vzrostla z 34,70 ± 0,57 procenta na 97,40 ± 1,04 procenta od 5 minut do 30 minut. Podobně 1 mg/ml MPM významně inhiboval hyaluronidázový enzym po 40 minutách inkubace. Po 40 minutách byla naměřena 83,91 ± 2,36 procenta inhibice, po těchto 80 minutách inkubace se míra inhibice zvýšila na 97,19 ± 0,45 procenta. Když byly zváženy celkové testy inhibice enzymů, výsledky zřetelně ukázaly, že MPM může být cenným přírodním prostředkem proti stárnutí a může být použit v obsahu různých produktů proti stárnutí; M. pomifera tak může získat mimořádný ekonomický význam.

Stanovení antioxidačního potenciálu

Četné exogenní a endogenní faktory vedou ke stárnutí kůže různými mechanismy. Většina těchto faktorů je přímo nebo nepřímo ovlivněna tvorbou ROS v ECM kůže.35 Jelikož kůže pokrývá vnější část našeho těla, setkává se v každodenním životě se značným množstvím UV záření. Většina kožních problémů, jako je spálení sluncem, hyperpigmentace a karcinogeneze kůže, tedy pochází nebo souvisí s přímými účinky UV záření. Stejně tak je fotostárnutí dalším důsledkem jeho nebezpečných vlastností.36 UV světlo navíc generuje tvorbu ROS a následně oxidační stres v kožní tkáni, což je jeden z nejdůležitějších mechanismů, které vedou k fotostárnutí.37 Byla vyslovena hypotéza, že od nadměrného Tvorba ROS způsobuje předčasné stárnutí kůže, látky s výraznou antioxidační schopností mohou být cenným nástrojem proti nebezpečným účinkům UV záření. V souladu s tím klinické studie ukazují, že lokální použití antioxidantů má ochranný účinek na kůži.38

Po vzájemném propojení mezi lokálním používáním antioxidantů a oddálením stárnutí pleti, které je dobře prokázáno v předchozí literatuře, poskytuje zkoumání antioxidačního potenciálu MPM in vitro cenné informace o jeho potenciálu proti stárnutí při lokální aplikaci. Dřívější literatura ukázala, že extrakty s vysokým počtem isoflavonoidů mohou být cennými antioxidanty. V předchozí studii extrakt z F. macrophylla bohatý na isoflavonoidy snižoval poškození kůže způsobené UVB zářením tím, že vychytával ROS. flavonoidní část a aditivní účinek prenylového postranního řetězce. Antioxidační potenciál extraktů a isoflavonoidů M. pomifera byl hodnocen v předchozí studii. Výsledky ukázaly, že hydroalkoholový extrakt a čistý osajin vykazovaly významnou aktivitu v testech DPPH, FRAP a TOAC, i když frakce pomiferinu a ethylacetátu vykazovaly vyšší aktivitu.41 Pro tuto studii byla aktivita vychytávání radikálů DPPH, testy FRAP, CUPRAC a TOAC provedené pro komplexní stanovení in vitro antioxidačního potenciálu MPM (tabulka 2). MPM vykazoval významnou aktivitu vychytávání radikálů DPPH, kde hodnota IC50 byla naměřena v roce 1998.86 ± {{20}},02. Testy FRAP a TOAC také vedly k významné aktivitě redukující kovy, 0,191 ± 0,01 mM FeS04/DE a 114,43 ± 0,02 AAE/g DE, v daném pořadí. Tato zjištění byla v souladu s předchozí studií publikovanou Orhanem et al.41 Poprvé, pokud je nám známo, byl test CUPRAC proveden na extraktech z plodů M. pomifera. V souladu s tím MPM vykazoval pozoruhodnou aktivitu redukující měď v testu CUPRAC, kde byly výsledky naměřeny jako 73,928 ± 0,01 AAE/g DE. Když byly zváženy testy celkové antioxidační kapacity, je možné navrhnout, že MPM je slibným prostředkem proti stárnutí.

Fenolický profil a analýza HPTLC

Isoflavonoidy jsou fenolické látky, které jsou známé jako rostlinné složky odpovědné za různé pozoruhodné biologické aktivity, jako jsou antioxidanty, protirakovinné a proti gynekologickým problémům.42 Předchozí studie ukázaly, že prenylované izoflavonoidy jsou hlavní fenolové sloučeniny v plodech M. pomifera.43 Četné studie identifikovaly osajin a pomiferin jako hlavní složky plodů M. pomifera, které jsou primárně zodpovědné za biologické aktivity.12 Osajin a pomiferin jsou velmi podobné prenylované isoflavonoidy, které se liší pouze jednou hydroxylovou skupinou.44 Předchozí zprávy ukázaly konfliktní výsledky pro obsahy osajinu a pomiferinu plodů M. pomifera. Kartal et al.45 vyvinuli metodu LC-MS pro stanovení osajinu a pomiferinu v M. pomifera, které byly odebrány z Ankarské provincie Türkiye. Výsledky ukázaly, že obsah pomiferinu byl mírně vyšší než obsah osajinu v různých částech vzorků ovoce. V jiné studii byly vzorky plodů M. pomifera shromážděny z různých oblastí Středozápadu a jihu Spojených států a obsah osajinu a pomiferinu byl měřen pomocí nové analytické metody HPLC. Výsledky ukázaly, že geografické rozdíly vedou k významným změnám množství isoflavonoidů ve vzorcích.46 Tsao et al.47 určili obsah osajinu a pomiferinu v ovoci sbíraném z Kanady a zjistili, že obsah pomiferinu byl mírně vyšší než obsah osajinu. Naproti tomu Hwang et al.48 shrnul několik studií, které nalezly množství osajinu vyšší než množství pomiferinu v různých extraktech. Lze tvrdit, že obsah osajinu a pomiferinu v plodech M. pomifera je výjimečně variabilní s geografickými rozdíly a extrakčními technikami kvůli jejich rozhodně analogické chemické struktuře. Pro tuto studii bylo poprvé, pokud je nám známo, množství MPM měřeno pomocí analýzy HPTLC. Výsledky analýzy ukázaly, že osajin je převládající složkou MPM, která byla shromážděna z provincie Uşak, 0. 22 procent vzorku tvořil osajin (tabulka 1). Dále, aby se dosáhlo dalšího hodnocení fenolického profilu MPM, byly provedeny testy obsahu celkových fenolů a celkových flavonoidů. Výsledky ukázaly, že MPM měl významný obsah fenolů a flavonoidů, jak je uvedeno dále; 113,92 ± 2,26 mg GAE/ga 66,41 ± 0,74 mg QE/g, v daném pořadí. Výsledky hodnocení fenolického profilu ukázaly, že MPM by mohl být prominentním kandidátem jako nový přírodní prostředek proti stárnutí.

ZÁVĚR

I když jsou studie zkoumající lokální použití plodů M. pomifera relativně nové, pozornost tímto způsobem roste s povzbudivými zprávami. Tato studie si proto kladla za cíl popsat komplexní hodnocení možného potenciálu extraktu z plodů M. pomifera proti stárnutí. Pro stanovení obsahu isoflavonoidů byla u plodů M. pomifera poprvé, pokud je nám známo, použita HPTLC analýza spolu s in vitro studiemi pro stanovení celkového fenolického profilu. Výsledky ukázaly, že hlavní složkou vzorků je osajin. Kromě toho byl in vitro antioxidační potenciál extraktu hodnocen čtyřmi různými testy a výsledky prokázaly významný antioxidační potenciál MPM. Kromě toho byla měřena inhibiční aktivita proti enzymům, které souvisejí s procesem stárnutí, a bylo vidět, že MPM má významnou inhibiční aktivitu na enzymy. Na závěr tato studie poskytuje informace, které mohou vést k výrobě nových produktů péče o pleť.

Etika

Schválení etické komise:Ke studii není nutný souhlas etické komise.

Informovaný souhlas:Není nezbytné.

Vzájemné hodnocení:Externě recenzováno.

Autorské příspěvky

Koncept: THB, TBŞ., HB, Design: THB, İ.KC, EC, Sběr nebo zpracování dat: THB, İ.KC, HB, Analýza nebo interpretace: THB, İ.KC, Vyhledávání v literatuře: THB, TBŞ., Zápis: THB, EC

Konflikt zájmů:Autoři neprohlásili žádný střet zájmů.

Finanční zveřejnění:Tuto studii podpořila Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar University Commission of Scientific Projects (č: 2020/02/07).

REFERENCE

1. Hwang E, Park SY, Yin CS, Kim HT, Kim YM, Yi TH. Antiaging účinky směsi Panax ginseng a Crataegus pinnatifida v lidských dermálních fibroblastech a zdravé lidské kůži. J Ginseng Res. 2017;41:69-77.

2. Ganceviciene R, Liakou AI, Theodoridis A, Makrantonaki E, Zouboulis CC. Strategie proti stárnutí pleti. Dermatoendokrinol. 2012; 4:308-319.

3. Lee H, Hong Y, Tran Q, Cho H, Kim M, Kim C, Kwon SH, Park S, Park J, Park J. Nová role ginsenosidu RG3 v antiagingu prostřednictvím funkce mitochondrií u ultrafialově ozářených lidských dermálních fibroblasty. J Ginseng Res. 2019; 43:431-441.

4. Rouvrais C, Bacqueville D, Patrick B, Haure MJ, Duprat L, Coutanceau C, Castex-Rizzi N, Duplan H, Mengeaud V, Bessou-Touya S. Hodnocení antiagingových vlastností retinaldehydu, delta-tokoferol glukosidu a glycylglycinu kombinace oleamidů. J Invest Dermatol. 2017;137(Suppl 2):S303.

5. Bravo K, Alzate F, Osorio E. Plody vybraných divokých a pěstovaných andských rostlin jako zdroje potenciálních sloučenin s antioxidační a anti-aging aktivitou. Ind Crops Prod. 2016; 85:341-352.

6. Yepes A, Ochoa-Bautista D, Murillo-Arango W, Quintero-Saumeth J, Bravo K, Osorio E. Semena mučenky fialové (Passiflora edulis f. edulis Sims) jako slibný zdroj látek proti stárnutí pleti: enzymatické , antioxidační a víceúrovňové výpočetní studie. Arab J Chem. 2021;14:102905.

7. Rittié L, Fisher GJ. Signální kaskády indukované UV zářením a stárnutí pleti. Aging Res Rev. 2002;1:705-720.

8. Duque L, Bravo K, Osorio E. Holistický přístup proti stárnutí aplikovaný ve vybraných pěstovaných léčivých rostlinách: pohled na fotoprotekci pokožky různými mechanismy. Ind Crops Prod. 2017; 97:431-439.

9. Manjia NJ, Njayou NF, Joshi A, Upadhyay K, Shirsath K, Devkar VR, Moundipa FP. Potenciál proti stárnutí léčivých rostlin v KamerunuHarungana madagascariensis Lam. a Psorospermum aurantiacum Engl. zabránit poškození kůže ultrafialovým B světlem in vitro. Eur J Integr Med. 2019;29:100925.

10. Pujimulyani D, Suryani CL, Setyowati A, Handayani RAS, Arumwardana S, Widowati W, Maruf A. Kosmeceutické potenciály Curcuma mangga Val. extrakt v lidských fibroblastech BJ proti MMP1, MMP3 a MMP13. Heliyon. 2020;6:e04921.

11. Stavropoulou MI, Stathopoulou K, Cheilari A, Benaki D, Gardikis K, Chinou I, Aligiannis N. NMR metabolické profilování vzorků řeckého propolisu: srovnávací hodnocení jejich fytochemického složení a zkoumání jejich anti-agingových a antioxidačních vlastností. J Pharm Biomed Anal. 2021;194:113814.

12. Filip S, Djarmati Z, Lisichkov K, Csanadi J, Jankov RM. Izolace a charakterizace extraktů Maclura (Maclura pomifera) získaných extrakcí superkritickou tekutinou. Ind Crops Prod. 2015;76:995-1000.

13. Saloua F, Eddine NI, Hedi Z. Chemické složení a profilové charakteristiky osage pomeranče Maclura pomifera (Rafin.) Schneider semeno a olej ze semen. Ind Crops Prod. 2009; 29:1-8.

14. Veselá D, Kubínová R, Muselík J, Zemlicka M, Suchý V. Antioxidační a EROD aktivity osajinu a pomiferinu. Fitoterapie. 2004;75:209-211.

15. Gruber JV, Holtz R, Sikkink SK, Tobin DJ. In vitro a ex vivo vyšetření topické léčby pomiferinem. Fitoterapie. 2014; 94:164-171.

16. Bozkurt İ, Dilek E, Erol HS, Çakir A, Hamzaoğlu E, Koç M, Keleş ON, Halici MB. Výzkum účinků pomiferinu z Maclura pomifera na žaludeční vřed vyvolaný indometacinem: experimentální studie na potkanech. Med Chem Res. 2017; 26:2048-2056.

17. Kurt-Celep İ, Celep E, Akyüz S, İnan Y, Barak TH, Akaydın G, Telci D, Yesilada E. Hypericum Olympic L. obnovuje poškození DNA a zabraňuje aktivaci MMP-9 indukované UVB v lidské dermální fibroblasty. J Ethnopharmacol. 2020;246:112202.

18. Bardakci H, Cevik D, Barak TH, Gozet T, Kan Y, Kirmizibekmez H. Sekundární metabolity, fytochemická charakterizace a antioxidační aktivity různých extraktů Sideritis congesta PH Davis et Hub.- Mor. Biochem Syst Ecol. 2020;92:104120.

19. Celep E, Seven M, Akyüz S, İnan Y, Yesilada E. Vliv extrakční metody na inhibici enzymu, fenolický profil a antioxidační kapacitu Sideritis trojan Bornm. Jihoafričan J Bot. 2019;121:360–365.

20. Bardakcí H, Barak TH, Özdemir K, Celep E. Vliv varného materiálu a různých přísad na polyfenolické složení a antioxidační bioaktivitu komerčního Tilia platyphyllos Scop. infuzemi. J Res Pharm. 2020; 24:133-141.

21. Barak TH, Celep E, İnan Y, Yesilada E. Vliv lidského trávení in vitro na biologickou dostupnost obsahu fenolů a antioxidační aktivitu extraktů z ovoce Viburnum opulus L. (brusinka evropská). Ind Crops Prod. 2019;131:62-69.

22. Barak TH, Celep E, İnan Y, Yeşilada E. In vitro simulace lidské trávení biologické dostupnosti a antioxidační aktivity fenolických látek z extraktů plodů Sambucus ebulus L.. Food Biosci. 2020;37:100711.

23. Ersoy E, Eroglu Ozkan E, Boga M, Yilmaz MA, Mat A. Potenciál proti stárnutí a antityrosinázová aktivita tří druhů Hypericum se zaměřením na fytochemické složení pomocí LC-MS/MS. Ind Crops Prod. 2019;141:111735.

24. Lee KK, Kim JH, Cho JJ, Choi JD. inhibiční účinky 150 rostlinných extraktů na aktivitu elastázy a jejich protizánětlivé účinky. Int J Cosmet Sci. 1999; 21:71-82.

25. Itoh S, Yamaguchi M, Shigeyama K, Sakaguchi I. Potenciál proti stárnutí výtažků z Chaenomeles sinensis. Kosmetika 2019;6:21.

26. Kolayli S, Can Z, Yildiz O, Sahin H, Karaoglu SA. Srovnávací studie antihyaluronidázových, nemrznoucích, antioxidačních, antimikrobiálních a fyzikálně chemických vlastností různých jednokvětých stupňů kaštanového (Castanea sativa Mill.) medu. J Enzyme Inhib Med Chem. 2016;31(Dodatek 3):96-104.

27. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Neutrofilní elastáza, proteináza 3 a katepsin G jako terapeutické cíle u lidských onemocnění. Pharmacol Rev. 2010;62:726-759.

28. Akazaki S, Nakagawa H, Kazama H, Osanai O, Kawai M, Takema Y, Imokawa G. Změny v kožních vráskách související s věkem hodnocené pomocí nové trojrozměrné morfometrické analýzy. Br J Dermatol. 2002;147:689- 695.

29. Barla F, Higashijima H, Funai S, Sugimoto K, Harada N, Yamaji R, Fujita T, Nakano Y, Inui H. Inhibiční účinky alkylgalátů na hyaluronidázu a kolagenázu. Biosci Biotechnol Biochem. 2019; 73:2335-2337.

30. Chung JH, Kang S, Varani J, Lin J, Fisher GJ, Voorhees JJ. Snížená kináza regulovaná extracelulárním signálem a zvýšená aktivita kinázy MAP aktivovaná stresem ve stárnoucí lidské kůži in vivo. J Invest Dermatol. 2000;115:177-182.

31. Addotey JN, Lenger's I, Jose J, Gampe N, Béni S, Petereit F, Hensel A. Isoflavonoidy s inhibičními účinky na lidskou hyaluronidázu-1 a norneolignan klitorienolakton B z extraktu kořene Ononis spinosa L.. Fitoterapie. 2018;130:169-174.

32. Kim KJ, Xuan SH, Park SN. Licoricidin, isoflavonoid izolovaný z Glycyrrhiza uralensis Fisher, zabraňuje UVA-indukovanému fotostárnutí lidských dermálních fibroblastů. Int J Cosmet Sci. 2017;39:133-140.

33. Kim JY, Wang Y, Uddin Z, Song YH, Li ZP, Jenis J, Park KH. Kompetitivní isoflavony inhibující neutrofilní elastázu z kořenů Flemingia philippinensis. Bioorg Chem. 2018; 78:249-257.

34. Ergene Öz B, Saltan İşcan G, Küpeli Akkol E, Süntar İ, Bahadır Acıkara Ö. Isoflavonoidy jako látky při hojení ran z Ononidis radix. J Ethnopharmacol. 2018;211:384-393.

35. Azevedo Martins TE, de Oliveira Pinto CAS, de Oliveira AC, Robles Velasco MV, Gorriti Guitiérrez AR, Cosquillo Rafael MF, Huamani Tarazona JP, Retuerto-Figueroa MG. Příspěvek lokálních antioxidantů k udržení zdravé pokožky - recenze. Sci Pharm. 2020;88:27.

36. Krutmann J, Schroeder P. Role mitochondrií při fotostárnutí lidské kůže: model defektní elektrárny. J Investig Dermatol Symp Proc. 2009;14:44-49.

37. Dong KK, Damaghi N, Picart SD, Markova NG, Obayashi K, Okano Y, Masaki H, Grether-Beck S, Krutmann J, Smiles KA, Yarosh DB. Poškození DNA způsobené UV zářením iniciuje uvolňování MMP-1 v lidské kůži. Exp Dermatol. 2008;17:1037-1044.

38. Oresajo C, Pillai S, Manco M, Yatskayer M, McDaniel D. Antioxidanty a kůže: porozumění složení a účinnosti. Dermatol Ther. 2012; 25:252-259.

39. Chiang HM, Chiu HH, Liao ST, Chen YT, Chang HC, Wen KC. Extrakt plstnaté makrofyly bohatý na isoflavonoidy zmírňuje poškození kůže způsobené UVB zářením tím, že zachycuje reaktivní formy kyslíku a inhibuje expresi MAP kinázy a MMP. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:696879.

40. Santos CMM, Silva AMS. Antioxidační aktivita prenylflavonoidů. Molekuly. 2020;25:696.

41. Orhan IE, Sezer Senol F, Demirci B, Dvorská M, Smejkal K, Zemlická M. Antioxidační potenciál některých přírodních a polosyntetických derivátů flavonoidů a extraktů z Maclura pomifera (Rafin.) Schneider (osage orange) a jeho esenciálních složení oleje. turecký J Biochem. 2016;41:403-411.

42. Křížová L, Dadáková K, Kašparovská J, Kašparovský T. Isoflavones. Molekuly. 2019;24:1076.

43. Su Z, Wang P, Yuan W, Grant G, Li S. Fenoly z plodů Maclura pomifera. Nat Prod Commun. 2017; 12:1743-1745.

44. Orazbekov Y, Ibrahim MA, Mombekov S, Srivedavyasasri R, Datkhayev U, Makhatov B, Chaurasiya ND, Tekwani BL, Ross SA. Izolace a biologické hodnocení prenylovaných flavonoidů z Maclura pomifera. Evid Based Complement Alternat Med. 2018;2018:1370368.

45. Kartal M, Abu-Asaker M, Dvorská M, Orhan I, Zemlická M. LC-DAD-MS metoda pro analýzu pomiferinu a osajinu, hlavních isoflavonů v Maclura pomifera (Rafin.) Schneider. Chromatography 2009;69:325-329.

46. ​​Darji K, Miglis C, Wardlow A, Abourashed EA. HPLC stanovení hladin isoflavonů v rosage orange ze středozápadu a jihu Spojených států. J Agric Food Chem. 2013; 61:6806-6811.

47. Tsao R, Yang R, Young JC. Antioxidační isoflavony v pomeranči osage, Maclura pomifera (Raf.) Schneid. J Agric Food Chem. 2003;51:6445-6451.

48. Hwang HS, Winkler-Moser JK, Tisserat B, Harry‐O'kuru RE, Berhow MA, Liun SX. Antioxidační aktivita extraktu z pomerančovníku osikového v sójovém oleji a rybím oleji během skladování. J Am Oil Chem Soc. 2021;98:73-87.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】