Abstraktní:Quercetin byl rozsáhle studován pro své účinky proti Alzheimerově chorobě (AD) a proti stárnutí. Naše předchozí studie zjistily, že kvercetin a jeho glykosidová forma, rutin, může modulovat funkci proteazomu v buňkách neuroblastomu. Zaměřili jsme se na zkoumání účinků kvercetinu a rutinu na intracelulární redoxní homeostázu mozku (redukovaný glutathion/oxidovaný glutathion, GSH/GSSG), jeho korelaci s aktivitou enzymu 1 štěpícího APP (BACE1) a amyloidového prekurzorového proteinu (APP). exprese v transgenních myších TgAPP (nesoucích transgen APP lidské švédské mutace, APPswe). Na základě toho, že zpracování proteinu BACE1 a APP je regulováno cestou ubikvitin-proteazom a že suplementace GSH chrání neurony před inhibicí proteazomu, jsme zkoumali, zda dieta obsahující kvercetin nebo rutin (30 mg/kg/den, 4 týdny) snižuje rané známky AD. Genotypizační analýzy zvířat byly prováděny pomocí PCR. Pro stanovení intracelulární redox homeostázy byly přijaty spektrofluorometrické metody pro kvantifikaci hladin GSH a GSSG pomocí o-ftalaldehydu a byl zjištěn poměr GSH/GSSG. Hladiny TBARS byly stanoveny jako marker peroxidace lipidů. Enzymové aktivity SOD, CAT, GR a GPx byly stanoveny v kortexu a hipokampu. Aktivita BACE1 byla měřena sekretázově specifickým substrátem konjugovaným se dvěma reportérovými molekulami (EDANS a DABCYL). Genová exprese hlavních antioxidačních enzymů: APP, BACE1, proteinu 10 obsahujícího dezintegrin a metaloproteinázovou doménu (ADAM10), kaspázy-3, kaspázy{16}} a zánětlivých cytokinů byla stanovena pomocí RT-PCR. Za prvé, nadměrná exprese APPswe u myší TgAPP snížila poměr GSH/GSSG, zvýšila hladiny malonaldehydu (MDA) a celkově snížila aktivity hlavních antioxidačních enzymů ve srovnání s myšmi divokého typu (WT). Léčba TgAPP myší kvercetinem nebo rutinem zvýšila GSH/GSSG, snížila hladiny MDA a podpořila antioxidační kapacitu enzymu, zejména rutinu. Za druhé, exprese APP i aktivita BACE1 byly sníženy pomocí kvercetinu nebo rutinu u myší TgAPP. Pokud jde o ADAM10, měl tendenci se zvyšovat u myší TgAPP s léčbou rutinem. Pokud jde o expresi kaspázy{21}}, TgAPP vykazoval nárůst, který byl opačný u rutinu. A konečně, zvýšení exprese zánětlivých markerů IL-1 a IFN- u myší TgAPP bylo sníženo jak kvercetinem, tak rutinem. Souhrnně tato zjištění naznačují, že ze dvou flavonoidů může být rutin zahrnut do každodenní stravy jako forma adjuvantní terapie u AD.

Klikněte na Antioxidant Cistanche Chemist Warehouse

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova:kvercetin; rutin; glutathion; APPswe; BACE1; Alzheimerova choroba

1. Úvod

Pokles kognitivních funkcí je základním klinickým příznakem neurodegenerace striktně souvisejícím s věkem [1]. Vliv výživy na kognitivní pokles související s věkem je stále rostoucím tématem, protože jde o životně důležitý faktor, který lze snadno změnit. Patologické změny v mozku pozorované během kognitivního poklesu probíhají dlouho před jakoukoli klinickou manifestací, která se většinou vyskytuje ve stáří. To poskytuje delší období pro stanovení strategií prevence týkající se poklesu kognitivních funkcí souvisejících s věkem a demence, což je hlavní problém veřejného zdraví [2]. Po mnoho let byl prováděn intenzivní výzkum sloučenin přírodního původu, které se nacházejí v každodenní stravě, v rámci kognitivní terapie [3].

Jedním z nejčastějších neurodegenerativních onemocnění souvisejících s věkem je Alzheimerova choroba (AD), která se vyznačuje dvěma neuropatologickými znaky: amyloidními (A) plaky a neurofibrilárními klubky. Pokud jde o výzkum na zvířatech, zvířecí modely mohou simulovat asymptomatickou fázi AD modifikací prekurzorového proteinu A (APP), například [4,5].

Je pozoruhodné, že několik bioaktivních fytochemikálií pocházejících z rostlin spojených s různými zdravotními přínosy a sníženým rizikem mnoha onemocnění bylo testováno na tvorbu nekovalentních komplexů s amyloidním (A) peptidem [3].

Přestože řada tradičních léků a přírodních dietních produktů prokázala velký pokrok směrem ke zmírnění patologie AD, jsme si plně vědomi omezení zvířecích modelů AD, protože slibné účinky těchto látek nejsou vždy replikovatelné ve studiích na lidech [6]. Vzhledem k obtížnosti analýzy mozkové tkáně u lidí, zejména ve velmi raných stádiích progrese, jsou však studie na modelech hlodavců nezbytné. V důsledku toho mohou tyto experimentální modely podporovat vývoj uživatelských látek z tradičních léků a bezpečných přírodních sloučenin ke zpomalení progrese neurodegenerativních onemocnění. Prioritou by tedy mělo být testování přírodních sloučenin, které se nacházejí v každodenní stravě, pro prevenci onemocnění a ochranu před rizikem AD.

Mezi tyto důležité přírodní látky patří kvercetin, který je hlavním polyfenolickým flavonoidem v několika druzích ovoce a zeleniny [7]. Quercetin je přítomen především ve své glykosidové formě, tj. rutinu. Rutin (kvercetin-3-O-rutinosid) prokázal hluboké účinky na různé buněčné funkce, které jsou základem několika patologických stavů, jmenovitě antimikrobiální, antikarcinogenní, antitrombotické, kardioprotektivní a neuroprotektivní. Tyto farmakologické účinky jsou spojeny především s protizánětlivými a antioxidačními aktivitami rutinu. Díky své schopnosti procházet hematoencefalickou bariérou a/nebo jeho metabolity bylo prokázáno, že rutin může měnit jak kognitivní, tak behaviorální symptomy neurodegenerativních onemocnění [8].

Naše předchozí studie zjistily, že jak flavonoidy, kvercetin, tak rutin ovlivňují různé signální dráhy a molekulární sítě spojené s modulací funkcí proteazomu v buňkách neuroblastomu [9]. Kromě toho bylo prokázáno, že exprese BACE1 a zpracování APP jsou regulovány cestou ubikvitin-proteazom [10] a že suplementace redukovaným glutathionem (GSH) chrání neurony před inhibicí proteazomu [11]. Deplece GSH v mozku je častým nálezem u pacientů s neurodegenerativními onemocněními, jako je AD, a může způsobit neurodegeneraci před nástupem onemocnění [12]. Ubikvitinace BACE1 a blokování ubikvitin-proteazomové dráhy inhibuje degradaci BACE1 a následně vede ke zvýšené produkci enzymatické aktivity BACE1 [10].

Na základě těchto zjištění a toho, že stravovací návyky a suplementace mohou ovlivnit buněčný redoxní stav, jsme se zaměřili na prozkoumání účinků diety obsahující kvercetin nebo rutin na intracelulární redoxní homeostázu mozku (GSH/GSSG), její korelaci s aktivitou BACE1, a APP exprese v myších modelech AD (nesoucích lidskou švédskou mutaci amyloidního prekurzorového proteinu APP transgen, APPswe).

Konečně, protože existují přesvědčivé důkazy o účinku suplementací flavonoidů na zlepšení specifických kognitivních domén a/nebo nálezů MRI [13], pokusili jsme se na zvířatech napodobit intervenci podáváním zdravé stravy obsahující mírná množství konkrétní potenciální aktivní látky. přísada (kvercetin nebo rutin) jako účinná strategie pro prevenci exprese markerů AD.

2. Výsledky

2.1. Genotypizace myší

Myší kolonie TgAPP byla vyvinuta v naší laboratoři z heterozygotních samců Tg2576 a samic divokého typu. Pro detekci transgenních jedinců byla provedena genotypizace myší. Ze všech testovaných myší bylo přibližně 40 procent zjištěno, že jsou transgenní (TgAPP).

Získané produkty PCR byly separovány elektroforézou v 1,5% agarózových gelech v 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) pufru při 70 V (konstantní napětí) a poté zobrazeny barvením GelRed (Millipore). Profil amplifikace pro transgenní myši i myši WT je znázorněn na obrázku 1.

2.2. glutathion

Pro vyhodnocení intracelulární redoxní homeostázy v neuronech u myší TgAPP byly kvantifikovány hladiny GSH a GSSG a poměr GSH/GSSG byl stanoven jako marker buněčně redukční síly u samců i samic (obrázek 2).

Při hodnocení účinku transgenu na glutathionový systém byl u TgAPP myší pozorován pokles schopnosti redukovat buňky (GSH/GSSG) u WT zvířat, a to jak u samců, tak u samic a v obou oblastech mozku (obr. 2C3, H3), zejména v hipokampu. U WT i TgAPP myší byl poměr GSH/GSSG významně nižší u samců než u samic (obrázek 2C3, H3; p < 0,05). Zatímco u žen TgAPP je tento pokles důsledkem nižších hladin GSH (obrázek 2C1, H1), u mužů TgAPP je většinou připisován zvýšení hladin GSSG (obrázek 2C2, H2).

Změny hladin GSH a GSSG u myší TgAPP po léčbě kvercetinem nebo rutinem jsou výraznější u samců než u samic. Zdá se, že kvercetin má tendenci zvyšovat hladiny GSH (obrázek 2C1, H1; p < 0.05) a rutin snižovat hladiny GSSG (obrázek 2C2, H2; p < 0,05).

Léčba kvercetinem a rutinem u samců i samic dokázala zvrátit pokles poměru GSH/GSSG v hipokampu (obrázek 2H3), kde bylo obnovení redoxní síly významné oproti neléčeným myším TgAPP. U samců dosáhl tento index podobných hodnot jako u WT myší v hippocampu (H3). U samic, i když tento poměr není vyšší než u WT myší, léčba kvercetinem a rutinem jej významně zvýšila ve srovnání s TgAPP myší v jejich hippocampu (H3: kvercetin, p < 0.{{{{101} 6}}01; rutin, p < 0,05).

2.3. Látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou (TBAR)

Hladiny TBAR byly stanoveny jako marker peroxidace lipidů. Pomocí kalibračních křivek byly výsledky vyjádřeny jako koncentrace malondialdehydu (MDA) (obrázek 3).

Po nadměrné expresi APP bylo pozorováno významné zvýšení hladin MDA ve srovnání s WT myšmi jak v kůře (obrázek 3C), tak v hipokampu (obrázek 3H) a jak u mužů, tak u samic (p < 0,001) .

U samic TgAPP léčba kvercetinem i rutinem téměř obnovila hladiny MDA na stejné hodnoty jako u WT myší (obrázek 3C, H). U samců TgAPP podobně léčba kvercetinem i rutinem obnovuje hladiny MDA na stejné hodnoty jako u WT myší v kortexu (obrázek 3C) a v hipokampu se ještě dále snižují (obrázek 3H). U myší WT i TgAPP, neléčených a léčených flavonoidovou dietou, byly hladiny MDA závislé na pohlaví (obrázek 3C, H; p < 0,05), s výjimkou myší TgAPP léčených kvercetinem v hipokampu.

2.4. Enzymová aktivita a exprese antioxidačních enzymů

Aby se zjistilo, zda k regulaci enzymatické aktivity nebo genové exprese hlavních antioxidačních enzymů nebo obojího dochází při kvercetinové nebo rutinní dietě, bylo provedeno stanovení enzymatické aktivity a hladin mRNA.

Obrázek 4 ukazuje enzymové aktivity SOD, CAT, GR a GPx, stanovené u samic a samců myší, v mozkové kůře (obrázek 4a) a hippocampu (obrázek 4b).

V důsledku nadměrné exprese APP byl u myší TgAPP ve srovnání s myšmi WT pozorován pouze významný pokles aktivity CAT v kortexu (obrázek 4a(C2); p < 0.05) a hippocampus (obrázek 4b(H2); p < 0,05).

Léčba kvercetinem nevyvolala žádné významné rozdíly v enzymových aktivitách ve srovnání s TgAPP myší, u samců nebo samic, ve studovaných oblastech mozku. Naproti tomu u zvířat léčených rutinem došlo ke zvýšení aktivity CAT v kortexu (obrázek 4a(C2)) a v aktivitě GR v hippocampu (obrázek 4b(H3)) u samců i samic (p < 0 .05). Kromě toho rutin zvýšil aktivitu hipokampální CAT u mužů TgAPP (obrázek 4b(H2)) a aktivitu GPx u žen (obrázek 4b(H4)).

Obrázek 5 ukazuje genovou expresi hlavních antioxidačních enzymů, SOD, CAT, GR a GPx, stanovenou u samic a samců myší v mozkové kůře (obrázek 5a) a hippocampu (obrázek 5b).

U hlavních antioxidačních enzymů nebyly pozorovány žádné rozdíly v genové expresi mezi TgAPP a WT myšmi (obrázek 5a,b). Samci TgAPP léčení rutinem vykazovali významné zvýšení exprese CAT v hippocampu (obrázek 5b(H2)). Pokud jde o hipokampální GPx, byl pozorován podobný vzorec jako CAT, i když zvýšení nebylo významné (obrázek 5b(H4)).

2.5. Zpracování APP: BACE1 a ADAM10

Výsledky aktivity enzymu BACE1 jak v mozkové kůře, tak v hippocampu u samců a samic jsou uvedeny na obrázku 6, vyjádřené jako procenta aktivity týkající se neléčených myší TgAPP.

Na obrázku 6 bylo zjištěno, že aktivita enzymu BACE1 u myší TgAPP vzrostla přibližně o 10 procenta ve srovnání s myšmi WT, a to jak ve zkoumaných oblastech mozku, tak u obou pohlaví, a bylo zjištěno, že je statisticky významná (p < 0,05).

Zvýšení aktivity pozorované u transgenních myší bylo sníženo ošetřením kvercetinem i rutinem, a to jak v kortexu, tak v hipokampu. Přesto bylo možné poznamenat, že účinek rutinu byl o něco větší než účinek kvercetinu u mužů.

Jakmile byla známa aktivita BACE1, rozhodli jsme se provést studii genové exprese APP, hlavní charakteristiky transgenního zvířecího modelu, a jeho hlavních zpracovatelských enzymů: BACE1 a ADAM10. Obrázek 7 ukazuje výsledky získané u samic a samců myší, jak v kortexu, tak v hippocampu.

U obou pohlaví bylo u WT myší pozorováno významné zvýšení exprese APP o více než 85 procent, což dokazuje nadměrnou expresi genu v mozkové kůře (obrázek 7C1; p < 0.05) a v hippocampu (obrázek 7H1; p < 0,05). Léčba kvercetinem a rutinem dokázala snížit tuto expresi o více než 45 procent (p < 0,05) u samců i samic myší v obou zkoumaných oblastech mozku (obrázek 7C1, H1), přičemž účinky byly výraznější v hipokampu ( Obrázek 7H1).

Pokud jde o expresi proteinu BACE1, ačkoli aktivita BACE1 byla změněna, nebyly mezi transgenními a netransgenními myšmi bez ohledu na pohlaví a zkoumanou léčbu flavonoidy žádné významné rozdíly.

Hodnotili jsme tedy expresi ADAM10 zapojenou do neamyloidogenního zpracování APP. Ačkoli změny v expresi ADAM10 u myší TgAPP ve srovnání s myšmi WT nebyly statisticky významné, byl pozorován mírný pokles. Co se týče léčby flavonoidy, rutin vykazoval rostoucí trend v expresi ADAM10, a to jak u mužů, tak u žen a v obou oblastech mozku (obrázek 7C3, H3).

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】