In vitro a in vivo metabolismus extraktu z Cistanche Tubulosa u normálních a chronických nepředvídatelných depresivních potkanů ​​vyvolaných stresem

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li a kol

ABSTRAKTNÍ

Nedávno bylo potvrzeno, že Cistanche tubulosa, jeden druh Cistanches Herba, má antidepresivní účinnost u potkanů ​​s inchronickým nepředvídatelným stresem (CUS) obnovením homeostázy střevní mikrobioty. V tomto článku se snažíme prozkoumat metabolický profil C. tubulosa u normálních a CUS-indukovaných depresivních modelových potkanů ​​in vitro a in vivo. Pomocí UPLC-Q-TOF-MS byl in vitro gastrointestinální metabolismusExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE) byla hodnocena u normálních i CUS potkanů. Současně in vivo metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálních a depresivních potkanů ​​byl také zkoumán v moči a výkalech potkanů. Celkem 20 a 26 metabolitů bylo charakterizováno z metabolismu in vitro a in vivo u normálních potkanů ​​a potkanů ​​CUS. CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl metabolizován na aglykony a degradační produkty fenylethanoidních glykosidů (PhGs) a iridoidních glykosidů, ať už normální nebo utlumenou střevní mikrobiotou potkana in vitro. Metabolity fáze II aglykonů a degradační produkty PhGs a iridoidní glykosidy byly hlavními metabolity v moči a stolici potkanů. Metabolická schopnost generovat sekundární glykosidy a aglykony u depresivní střevní mikroflóry potkana byla navíc mnohem slabší než u normální střevní mikrobioty potkana, což bylo přičítáno neuspořádaným glykosidovým hydrolázám produkovaným střevní mikrobiotou u potkanů ​​s depresí CUS. Výsledky této studie položily základ pro pochopení metabolického procesu a terapeutického mechanismu antidepresivních vlastností CTE.

Klíčová slova: Cistanche tubulosa, Depresivní metabolismus, In vitro, In vivo, Střevní mikroflóra

1. Úvod

Cistanches Herba je oficiálně zaznamenána jako sušené sukulentní stonky Cistanche deserticola (YC Ma) a C. tubulosa (Schrenk), které se používají k léčbě ledvinové nedostatečnosti, impotence, ženské neplodnosti, morbidleucorrhea, profuzní metroragie a stařecké zácpy [1]. Moderní farmakologické studie ukázaly, že Cistanches Herba má různé biologické aktivity, jako je antineurodegenerační, imunoregulační a protizánětlivá [2,3]. Naše předchozí vyšetřování to potvrdilaExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE), které se skládají ze 48,6 procenta fenylethanoidních glykosidů (PhGs), 6,9 procenta iridoidních glykosidů a 20,0 procenta celkových sacharidů, by mohly výrazně zmírnit depresivní symptomy u depresivních potkanů ​​vyvolaných chronickým nepředvídatelným stresem (CUS). obnovení homeostázy střevní mikroflóry [4]. Nedávné studie naznačují, že změny ve složení střevní mikrobioty byly spojeny s rozvojem a progresí deprese [5,6]. Relativní početnost mikrobiálních rodů byla výrazně narušena u CUSdepresivních modelových potkanů ​​ve srovnání s normálními kontrolami [7]. U pacientů s depresí byla také významně změněna diverzita a bohatost střevní mikrobioty [8]. Kromě toho byly různé sloučeniny včetně fenylethanoidových glykosidů (PhGs) a iridoidních glykosidů považovány za hlavní složky Cistanches Herba [2,3], které byly snadno metabolizovány na své sekundární glykosidy a aglykony včetně hydroxytyrosolu (HT), 3,4-dihydroxyfenethyl glykosid, deglykosylovaná kyselina geniposidová atd. lidskou střevní mikroflórou. Tyto metabolity se snadněji vstřebávají střevem a vyvíjejí biologickou aktivitu v souladu s prototypovou složkou [9–11]. Domníváme se tedy, že během výskytu a rozvoje deprese narušení struktury střevní mikroflóry nevyhnutelně ovlivní metabolismus orálních tradičních čínských léků (TCM) v gastrointestinálním traktu, kromě ovlivnění fyziologického stavu hostitele. Většina existujících metabolických údajů o Cistanches Herba pochází z metabolických studií na zdravých zvířatech[12–15]. Proto by mělo větší klinický význam prozkoumat metabolický profil CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v patologickém stavu při objasnění jeho bioaktivních složek a pochopení mechanismu účinku pro jeho antidepresivní účinnost.

V této studii se zaměřujeme na charakterizaci metabolických profilů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u zdravých i u depresivních krys vyvolaných CUS pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie kvadrupólové hmotnostní spektrometrie s dobou letu (UPLC-Q-TOF-MS). Žaludeční šťáva, střevní tekutina a mikrobiota normálních a depresivních patologických potkanů ​​byly použity k simulaci metabolického procesu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v gastrointestinálním traktu in vitro, nezávisle a postupně. Metabolity in vivo jsou také objasněny po perorálním podání CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálních a CUS potkanů. Tato studie poskytuje nové poznatky o metabolismu a aktivních metabolitech CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)na deprese.

2. Materiál a metody

2.1. Materiál

Sušené stonky C. tubulosa byly shromážděny z okresu Hetian (Xinjiang, Čína). Vzorky voucherů byly ověřeny prof. Xiaobo Li a uloženy v herbáři School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Čína). Byla použita metoda extrakce, jak je uvedeno v naší předchozí publikaci [4]. TheExtrakt z Cistanche tubulosa(CTE) vzorky byly skladovány při 4 stupních a před použitím znovu rozpuštěny ve sterilní vodě. Sterilní vodní roztoky CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)vzorky byly poté filtrovány přes 0.22 μm membránu a filtráty byly shromážděny do sterilních zkumavek.

Echinacoside poskytla laboratoř Dr. Pengfei Tu, PekingUniversity (Peking, Čína). Akteosid, isoakteosid, 2'-acetylakteosid a cistanosid A byly zakoupeny od Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Hydroxytyrosol, kyselina kávová, 3,4-dihydroxybenzenpropionová kyselina, 3-hydroxyfenylpropionová kyselina a 3-fenylpropionová kyselina byly zakoupeny od Aladdin IndustrialInc. (Šanghaj, Čína). Čistota každé složky byla stanovena na > 95 procent pomocí HPLC-UV. Acetonitril čistoty pro HPLC byl zakoupen od společnosti Merck (Darmstadt, Německo). Deionizovaná voda byla připravena z destilované vody za použití systému pro čištění vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Všechna ostatní použitá činidla a chemikálie byly analytické čistoty.

2.2. Pokusy na zvířatech

Samci krys Sprague-Dawley (200 ± 20 g) byli získáni od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Čína) a umístěni v Laboratory Animal Center Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Čína). Zvířata byla chována ve skupinách při kontrolované pokojové teplotě (25 ± 2 stupně, 55 ± 10 procent relativní vlhkosti) s cyklem světlo-tma 12:12 h. Krysám byl umožněn volný přístup k běžné laboratorní krysí potravě a vodě po dobu 1 týdne. Zařízení a protokoly pro zvířata byly schváleny Výborem pro etiku zvířat Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Čína).

Po týdenní aklimatizaci bylo dvanáct naivních potkanů ​​náhodně rozděleno do dvou skupin (n=6), kontrolní skupiny a skupiny s chronickým nepředvídatelným stresem (CUS). Krysy CUS byly vyvinuty jako v naší předchozí zprávě [4], které byly vystaveny různým stresorům: bílý šum (100 dB) po dobu 1 hodiny, noční stroboskopické osvětlení nízké intenzity (120 záblesků/min), nedostatek vody po dobu 24 hodin, prázdný láhve na vodu na 1 h (po nedostatku vody), nedostatek potravy na 24 h, fyzická omezení (1–2 h), nucené plavání (5 min), znečištěná klec na 24 h (200 ml vody ve 100 g podestýlky z pilin), štípnutí ocasu ( 1 min), šok po dobu 30 min, naklonění klece o 45 stupňů po dobu 24 hodin a noční osvětlení (12 hodin). Stresory byly aplikovány nepřetržitě a náhodně po dobu 4 týdnů, podrobné uspořádání je popsáno v tabulce S1. Po 4 týdnech stresu byly provedeny sacharosepreferenční test, test na otevřeném poli a test potlačení novosti krmení, jak bylo popsáno dříve [4]. Nástin CUS a behaviorální test je znázorněn na obr. S1. Po behaviorálních testech byly od každého potkana získány alespoň 4 fekální pelety a umístěny do sterilních kónických zkumavek pro in vitro analýzu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolismus.

2.3. Gastrointestinální metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálními a CUS potkany in vitro

2.3.1. Metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žaludečních a střevních šťávách

Padesát miligramů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly přidány do 10 ml simulované žaludeční šťávy, respektive střevní šťávy. Pak CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl inkubován při 37 stupních po dobu 4 hodin v žaludeční šťávě a 6 hodin ve střevní šťávě. Kultivovaná směs (1 ml) byla okamžitě zastavena 3 ml vodou nasyceného n-butanolu v 0 a 4 h v žaludeční šťávě a v 0 a 6 h ve střevní šťávě. Způsob zpracování použitého vzorku byl popsán dříve [9].

2.3.2. Metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normální a CUS střevní mikroflórou potkanů

Čerstvé vzorky fekálií normálních a CUS potkanů ​​byly nejprve smíchány a homogenizovány s 25násobným objemem živné půdy GAM. Sedimenty byly odstraněny filtrací přes tři kusy gázy. Suspenze byla poté inkubována při 37 stupních v anaerobním inkubátoru, ve kterém byl vzduch nahrazen směsí plynů (H2 5 procent, CO2 10 procent, N2 85 procent). Padesát miligramů CTE bylo přidáno do 5 ml normální a CUS potkaní fekální suspenze samostatně a suspenze byla inkubována při 37 stupních po dobu 48 hodin. Kultivovaná směs byla odstraněna a extrahována vodou nasyceným n-butanolem při 0, 12, 24 a 48 hodinách. Způsob zpracování vzorku byl popsán výše [9].

2.3.3. Sekvenční metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)žaludeční šťávou, střevní šťávou, normální a CUS střevní mikroflórou potkanů

Za prvé, 100 mg CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byla přidána do 1{{10}} ml simulované žaludeční šťávy a inkubována při 37 stupních po dobu 4 hodin. Celá reakce byla zastavena 3násobným objemem vodou nasyceného n-butanolu a centrifugována při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, poté následovalo odpaření supernatantu pod proudem dusíku plyn na 37 stupňů. Za druhé, zbytek byl znovu rozpuštěn v 0,4 ml sterilní vody, přidán k 8 ml simulované střevní šťávy a inkubován při 37 stupních po dobu 6 hodin. Vzorek se žaludeční šťávou byl připraven stejným způsobem. Nakonec byl zbytek znovu rozpuštěn v 0,3 ml sterilní vody, přidán k 6 ml normální a CUS krysí fekální suspenze v daném pořadí a inkubován při 37 stupních po dobu 48 hodin v anaerobikubátoru. Jeden mililitr reakce byl zastaven 3 ml vodou nasyceného n-butanolu okamžitě v 0 a 4 h v žaludeční šťávě, v 0 a 6 h ve střevní šťávě a v 0, 12, 24 a 48 h ve střevní mikrobiotě potkana . Vzorek byl zpracován identicky CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulované žaludeční šťávě.

2.4. Metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálními a CUS potkany in vivo

Každý potkan ve dvou skupinách byl poté umístěn v individuální metabolické kleci. Po celonočním hladovění, které umožňovalo pouze volný přístup k vodě, byly všem potkanům orálně podávány 2 ml vody pomocí agastrické sondy. Od 0 hodin do 12 hodin byly odebírány slepé vzorky moči a stolice od všech potkanů. Dále CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) bylo podáváno žaludeční sondou. Vzorky moči a stolice byly odebírány od 0 h do 24 h. Všechny vzorky moči a stolice byly okamžitě skladovány při -80 stupních.

Vzorky moči a stolice od normálního potkana a potkana CUS byly předem ošetřeny, jak bylo popsáno dříve [12]. Všechny výsledné vzorky byly analyzovány pomocí UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analytická metoda

UPLC byla provedena na systému Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) s kolonou ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) gradientovou elucí s použitím {{10}},1 procenta kyseliny mravenčí, acetonitrilu (A) a 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě (B) při průtoku 0,4 ml/min . Profil gradientu byl: 0–5 minut (A:5–20 procent), 5–7,5 minut (A: 20–30 procent), 7,5–10 minut (A: 30–70 procent), 10–11 minut (A : 70–100 procent) a byla držena po dobu 1,5 minuty. Gradient byl recyklován zpět na 5 procent během 0,5 minuty a byl udržován po dobu 2,5 minuty pro další běh. Objem nástřiku byl 3 μl. Teplota kolonové pece byla nastavena na 35 stupňů.

Hmotnostní spektrometrie byla prováděna za použití hmotnostního spektrometru Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionizace byla provedena v režimu negativního elektrospreje (ESI−). Parametry MS byly následující: kapilární napětí, −2.0 kV; napětí kužele, 20 V; teplota zdroje, 120 stupňů; teplota desolvace, 500 stupňů; průtoky plynu kuželové a desolvatační, 50 a 1000 l/h, v daném pořadí. Pro přesné měření hmotnosti byl použit leucin-enkefalin jako blokovací hmota pro generování [M–H]- iontu (m/z 554,2615). Experiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) ve dvou funkcích skenování byl proveden následovně: funkce 1 (nízká energie): m/z 50–1000, doba skenování 0,25 s, zpoždění mezi skeny 0,02 s, energie srážky 6 eV; funkce 2 (vysoká energie): m/z50–1000, doba skenování 0,25 s, zpoždění mezi skeny 0,02 s, kolizní energetická rampa 20–45 eV.

2.6. Zpracování dat

Data byla zpracována pomocí softwaru UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) pro identifikaci metabolitů v rámci přesných nezpracovaných dat s plným skenováním shromážděných prostřednictvím MSE. Sloučeniny byly identifikovány na základě přesné hmotnosti, fragmentů ve vysokoenergetické hmotnostní spektrometrii. Prahová hodnota intenzity byla nastavena jako 100,0 impulzů. Identifikace cíle, tolerance shody fragmentů a další parametry byly nastaveny automaticky.

3. Výsledky

3.1. Změny chování u krys s depresí vyvolanou CUS

Krysy s depresivními symptomy vyvolanými CUS byly hodnoceny behaviorálními testy včetně testu preference sacharózy, testu v otevřeném poli a testu potlačení novosti krmení. Studentův t-test odhalil, že preference sacharózy v testu preference sacharózy (p < 0,001),="" celková="" vzdálenost="" uražená="" v="" testu="" na="" otevřeném="" poli="" (p="">< 0,001)="" a="" latence="" k="" jídlu="" v="" testu="" krmení="" potlačeným="" novostí="" (p="">< 0,01)="" byly="" významně="" odlišné="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" po="" 4-týdenní="" léčbě="" cus="" (obr.="" 1).="" tato="" zjištění="" ukázala,="" že="" model="" chronického="" nepředvídatelného="" stresu="" byl="" úspěšně="">

3.2. Charakterizace chemických složek CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)

Komplexní analýza prototypových prvků CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byla provedena pomocí UPLC-Q-TOF-MS. Celkem 27 složek z CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly detekovány a předběžně charakterizovány, včetně 20 PhG, 5 iridoidů a iridoidních glykosidů a 2 oligosacharidů. Podrobné informace včetně retenčního času, přesné MS a fragmentových iontů MS/MS jsou uvedeny v podpůrných informacích (tabulka S2), které poskytují pohled na strukturu těchto chemických složek. UPLC-Q-TOF-MS celkový iontový chromatogram (TIC) CTE byl ukázán na obr. S2.

3.3. Gastrointestinální metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálními a CUS potkany in vitro

V této studii jsou potenciální metabolity CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normálními a CUSrats in vitro byly detekovány z TIC a identifikovány kombinací elementárních kompozic a hmotnostních spekter MS/MS fragmentů po jejich srovnání s kontrolními vzorky. Všechny metabolity z CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žaludečních a střevních šťávách jsou normální a CUS potkaní střevní mikrobiota uvedeny v tabulce 1.

3.3.1. Metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulovaných žaludečních a střevních šťávách

Sedm metabolitů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v simulované žaludeční šťávě byly předběžně identifikovány pomocí přesné hmotnosti a informací o fragmentu MSE: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z,150101,1545,1 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H804, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H4580723, m, 18231, m .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglykosylace, dehydroxylace, dehydrogenace a izomerizace byly považovány za hlavní metabolické dráhy pro CTE v žaludeční šťávě. Bylo zjištěno, že M4 a M5 mají molekulovou hmotnost o 2 Da a 16 Da nižší než jejich prototypová složka, dekafeoylakteosid, a byly tedy identifikovány jako jeho dehydrogenované a dehydroxylované produkty. M12 byl identifikován jako izomer echinakosidu, produkující stejné ionty jako echinakosid při m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Stejné metabolity byly detekovány po CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)inkubace ve střevní šťávě. Je pozoruhodné, že kafeoylová skupina v poloze C{0}}′ vPhGs byla snadno metabolizována trávicími enzymy ve střevní šťávě za vzniku jejích dekofeylových metabolitů a kyseliny kávové.

3.3.2. Metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)normální a CUS střevní mikroflórou potkanů

Celkem 20 metabolitů biotransformovaných z CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v normální potkaní mikrobiotě byly detekovány a identifikovány (obr. 2). Z výsledků bylo pozorováno, že PhG byly degradovány na aglykon hydroxytyrosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) a kyselinu kávovou (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, poté 2,85 min). byly dále metabolizovány na M3 (m/z 163,0390, C9H803, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 5,512 min), m/z/5125 C9H10O3, 4,36 min) prostřednictvím dehydroxylace, redukce a methylace. Kromě toho jsou centrálními metabolickými cestami, které produkovaly přímé metabolity prototypových sloučenin PhG z CTE v normální střevní mikrobiotě potkana, redukce, methoxylace, deglykosylace, dekafeoyl, dehydrogenace a izomerizace.

Po inkubaci v CUS-indukované depresi střevní mikroflóry potkana, CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl přeměněn na 20 metabolitů stejnými metabolickými cestami jako normální potkani.

3.3.3. Sekvenční metabolismus CTE žaludeční šťávou, střevní šťávou, normální a CUS střevní mikroflórou potkanů

Po postupné inkubaci v žaludeční šťávě, střevní šťávě, normální a CUS střevní mikrobiotě potkana, CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl metabolizován na 14 metabolitů (včetně 8 se žaludeční šťávou, 7 se střevní šťávou, 11 s normální a 10 s CUS krysí střevní mikroflórou). Mezi nimi byly M2(HT) a M11 (3-kyselina hydroxyfenylpropionová, 3-HPP) konečnými metabolity PhGs po postupné inkubaci CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v žaludeční šťávě, střevní šťávě a střevní mikrobiotě. Mezi normálními a CUS potkany nebyl žádný významný rozdíl v metabolitech.

M8, M9, M14, M17, M19 a M20 byly detekovány pouze v nezávislém metabolismu CTE normální a CUS krysí střevní mikrobiotou. Tyto metabolity byly převážně metabolické meziprodukty, které byly při studiu sekvenčního metabolismu CTE kompletně metabolizovány na konečné metabolity, a proto je obtížné je detekovat.

3.3.4. Rozdíly mezi rychlostí metabolismu CTE normální a CUS potkaní mikroflórou

Objasnit rozdíly mezi rychlostí metabolismu CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normální a CUS střevní mikroflóry potkana byly odděleně a postupně stanoveny relativní obsahy 27 prototypových sloučenin a 20 metabolitů po inkubaci se žaludeční šťávou, střevní šťávou, normální a CUS potkaní střevní mikroflórou (tabulky S3 a S4). Výsledky ukázaly, že i když mezi CTE nebyly žádné významné rozdíly(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolitů normálních a depresivních potkanů, byl pozorován významný rozdíl v jejich metabolické rychlosti. Například C2 a C5 byly identifikovány jako 8-epiloganová kyselina nebo její izomer. V normálních vzorcích byly kompletně metabolizovány během 12 hodin inkubace. U patologicky snížené střevní mikrobioty potkana však byly po 48 hodinách inkubace důkladně metabolizovány. Bylo zřejmé, že rychlost metabolismu u normálního potkana byla rychlejší než u potkana CUS. Podobné výsledky byly objeveny u C18 (isoakteosid). Kromě toho je pozoruhodné, že plocha píku M12 (izomerizace echinakosidu) a M16 (izomerizace tubulosidu A) v normálních vzorcích byla mnohem větší než u vzorků CUS, což naznačuje, že izomerizační reakce CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl více převládající u normální střevní mikrobioty potkanů ​​než u depresivní střevní mikrobioty potkanů.

3.4. Metabolismus CTE u normálních a CUS potkanů ​​in vivo

Porovnáním biologických vzorků skupiny léčené CTE s blankbiologickými vzorky bylo zjištěno celkem 26 metabolitů (sloučenina 1–26) CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly detekovány normální a CUS krysy (tabulka 2). Typické UPLC chromatogramy vzorků moči normálních a CUS potkanů ​​jsou uvedeny na Obr.

3.4.1. Charakterizace metabolitů CTE v normálním a CUS raturinu

Celkem 18 in vivo metabolitů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)ve vzorcích moči normálních potkanů ​​byly předběžně identifikovány. Degradační metabolity PhG včetně HT a CA a jejich další sulfatační (sloučenina 1, 2, 3, 5, 8 a 16), methylační (6, 21, 22 a 24) a methoxylační (13 a 14) metabolity byly hlavní metabolity v normální moči potkanů. Iridoidní glykosidy byly snadno metabolizovány na aglykony (23, 25 a 26) prostřednictvím deglykosylace. Je pozoruhodné, že ve vzorku moči normálních potkanů ​​nebyla detekována žádná prototypová složka.

Ve vzorku depresivní moči potkanů ​​bylo 22 metabolitů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly zjištěny a charakterizovány. Jeden prototyp sloučeniny, 8-epiloganová kyselina, byl detekován v moči patologických potkanů. Ostatní metabolity byly v souladu s těmi, které byly nalezeny v moči normálních potkanů, včetně sulfatovaných metabolitů (1, 2, 3, 8, 10 a 16), methylovaných metabolitů (6, 11, 19 a 22), methoxylovaných metabolitů (13 a 14). HT a CA a theaglykony iridoidních glykosidů (25 a 26).

3.4.2. Charakterizace metabolitů CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)v normálních a CUS ratfeces

V této studii byl pouze jeden metabolit (sloučenina 20, 3-HPP) CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl identifikován v normálních potkaních výkalech. Většina PhG byla nejprve degradována na CA a následně podstoupila další metabolismus na svůj hlavní mikrobiální metabolit, 3-HPP. Ve vzorku stolice od potkana CUS byly předběžně charakterizovány 3 metabolity, včetně sulfatovaného 3-HPP (sloučenina 16) a sulfatovaného HT (sloučeniny 2 a 3).

3.4.3. Rozdíly mezi in vivo metabolity CTE u normálních a CUSkrys

Po perorálním podání CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolity in vivo vykazovaly zjevné rozdíly u zdravých a depresivních krys. 21 metabolitů (sloučenina 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 a 19–26) bylo detekováno ve vzorcích zdravých potkanů ​​a potkanů ​​CUS. Sloučenina 23 (deglykosylovaná kyselina geniposidová) byla identifikována pouze ve vzorcích zdravých potkanů, zatímco sloučeniny 4 (HT), 7 (8-epiloganová kyselina), 15 (3, 4-dihydroxybenzenpropionová kyselina) a 18 ({{ 19}}HPP glukuronidová konjugace) byly detekovány pouze ve vzorcích krys modelu CUS. Stručně řečeno, prototypové složky byly detekovány pouze u potkanů ​​CUS, zatímco metabolity vícefáze II byly objeveny u normálních potkanů.

4. Diskuze

V této studii byly nezávisle a postupně použity tři inkubační modely včetně žaludeční šťávy, střevní šťávy, normální střevní mikroflóry a CUS potkaní střevní mikroflóry ke zkoumání gastrointestinálního metabolického profilu CTE.(extrakt z Cistanche tubulosa)in vitro. Bylo zjištěno, že PhGsand iridoidní glykosidy v CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly snadno metabolizovány na své sekundární glykosidy a aglykony pomocí CUS-indukované depresivní krysí střevní mikrobioty. Poté in vivo metabolismus CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u normálních a CUS potkanů ​​byl také ověřen. Navrhované metabolické dráhy pro CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u zdravých a CUS-indukovaných depresivních potkanů ​​jsou znázorněny na obr. 4. PhG, jako je echinakosid a akteosid, byly metabolizovány na HT a CA a CA podléhaly dalšímu metabolismu na svůj hlavní mikrobiální metabolit, 3-HPP. HT, CA a 3-HPP byly poté metabolizovány na své sulfatované, methylované a methoxylované metabolity. Iridoidní glykosidy včetně kyseliny geniposidové, kankanosidu A a kankanosidu N byly metabolizovány na své aglykony deglykosylací. Tyto dále ukázaly, že PhGs a iridoidní glykosidy v CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byly u CUS potkanů ​​snadno metabolizovány na sekundární glykosidy a aglykony. Tyto metabolity obvykle vykazují lepší střevní absorpci a biologickou dostupnost, aby se dále absorbovaly do krve a projevily biologickou aktivitu [16–18]. Stojí za zmínku, že u PhGs v gastrointestinálním traktu převládala izomerizace, relevantní metabolity byly identifikovány po srovnání s UPLC retenčním časem jejich prototypových sloučenin na základě optimalizovaného ideálního gradientového profilu UPLC.

Kyselina kávová byla primárním degradačním produktem CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)depresivní patologickou střevní mikrobiotou potkana. Předchozí publikace uváděly, že kyselina kávová má antidepresivní účinky v testu nuceného plavání u myší. Hladina mRNA mozkového neurotrofního faktoru (BDNF) ve frontálním kortexu i hladina mRNA TrkB v theamygdale byla po testu nuceného plavání významně snížena a dřívější snížení bylo významně inhibováno kyselinou kávovou [19]. Hydroxytyrosol byl aglykon PhGs, který chrání neurogenezi a kognitivní funkce prevencí stresem indukované downregulace neurálního proteinu BDNF [20]. Je tedy nutné věnovat větší pozornost některým bioaktivním metabolitům (tj. HT a CA) transformovaným střevní mikrobiotou po perorálním podání.

Kromě toho tato zjištění poskytují důkaz, že u střevní mikrobioty depresivních potkanů ​​byla metabolická schopnost generovat sekundární glykosidy a aglykony výrazně slabší než u normální střevní mikrobioty potkana. Důvodem jsou pravděpodobně strukturální změny střevní mikroflóry vyvolané depresí, které vedou ke snížení aktivity metabolických enzymů produkovaných střevní mikroflórou [21]. Je zajímavé, že předchozí studie ukázala, že kmen Bacteroidetes kóduje nejhojnější geny glykosidové hydrolázy a polysacharidové lyázy pro glykosidovou hydrolýzu a štěpení komplexních sacharidů s eliminačním mechanismem [22]. Konkrétně Bacteroides spp. včetně B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. inneris, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis a B. xylanisolvens vykazovaly dominantní celkový počet genů kódujících GH a PL. Stejné vlastnosti má také Parabacteroides distasonis [22]. Naše předchozí studie potvrdily, že 28-denní chronická nepředvídatelná stresová stimulace snížila relativní početnost rodů Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas a Weissella, zatímco u potkanů ​​zvýšila výskyt Ruminococcus a Deinococcus [4]. Je pozoruhodné, že Bacteroides a Parabacteroides byly dva nejhojnější mikrobiální taxony, které představovaly přibližně 20 procent relativního zastoupení u normálních potkanů. Po léčbě CUS se relativní četnost Bacteroides a Parabacteroides prudce snížila na přibližně 5 procent u depresivního modelu potkanů. Proto to nevyhnutelně povede k redukci celkového počtu GH a PL enzymů u CUS potkanů ​​a dále naruší deglykosylovanou reakci CUS depresivní střevní mikroflórou po perorálním podání CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)u krysích modelů.

5. Závěr

V této studii byla zavedena a použita technika UPLC-Q-TOF-MS ke screeningu a identifikaci metabolitůExtrakt Cistanche tubulosau normálních a CUS depresivních potkanů ​​in vitro a in vivo. Výsledky ukázaly, že CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)byl metabolizován na aglykony a degradační produkty PhGs a iridoidní glykosidy zdravou i deprimovanou střevní mikrobiotou. Po perorálním podání CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)metabolity aglykonů fáze II a produkty degradace PhGs a iridoidglykosidů byly nalezeny převážně v moči potkanů. Metabolická schopnost generovat sekundární glykosidy a aglykony u depresivní potkaní mikroflóry byla mnohem slabší než u normální střevní mikroflóry potkana, což bylo připisováno neuspořádaným glykosidhydrolázám produkovaným střevní mikroflórou u potkanů ​​s depresí CUS. Tato studie poskytuje nový pohled pro pozdější vývoj CTE(extrakt z Cistanche tubulosa)jako potenciální antidepresivum.

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty z Národního klíčového výzkumného a vývojového programu Číny (2017YFC1702400).

Příloha A. Doplňující údaje

Doplňující údaje k tomuto článku lze nalézt online na adrese HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Z: ' Metabolismus in vitro a in vivoExtrakt z Cistanche tubulosau normálních a chronických nepředvídatelných depresivních krys vyvolaných stresemYang Li a kol

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Reference

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Peking, Čína, 2015, s. 135 Část I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analýza chemických složek u druhů Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: přehled jeho chemie, farmakologie a farmakokinetických vlastností, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepresivní účinkyExtrakt z Cistanche tubulosana krysách s chronickým nepředvídatelným stresem prostřednictvím obnovení homeostázy střevní mikroflóry, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Osa střeva a mozku: jak mikrobiom ovlivňuje úzkost a depresi, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nedávný vývoj v chápání role střevní mikroflóry ve zdraví a onemocnění mozku, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in gut microbiota and fekální metabolický fenotyp spojený s depresí sekvenováním genu 16S rRNA a LC/ Metabolomika založená na MS, J. Pharm. Biomed. Anální. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: deprese-associated gut microbiota induces neurobehaviorální změny u potkanů, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Lidský gastrointestinální metabolismus vodního extraktu Cistanches Herba in vitro: objasnění metabolického profilu na základě komplexní identifikace metabolitů v žaludeční šťávě, střevě šťáva, lidské střevní bakterie a střevní mikrozomy, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikace metabolitů echinakosidu produkovaných lidskými střevními bakteriemi pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie/kvadrupólové hmotnostní spektrometrie s časem letu, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Screening a identifikace tří typických metabolitů fenylethanoidových glykosidů z Cistanches Herba lidskými střevními bakteriemi pomocí UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anální. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Rychlý screening a identifikace rozdílů mezi metabolity Cistanche deserticola a vodním extraktem C. tubulosa u krys pomocí UPLC- Q-TOF-MS kombinovaná analýza rozpoznávání vzorů, J. Pharm. Biomed. Anální. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Systematicky charakterizujte metabolity echinakosidu a akteosidu z Cistanche tubulosa v potkaní plazmě, žluči, moči a výkalech na základě UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Přístup k identifikaci sekvenčních metabolitů typický fenylethanoidní glykosid, echinakosid, založený na kapalinové chromatografii-iontové pasti
analýza letové hmotnostní spektrometrie, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolismus echinacosidu, dobrého antioxidantu, u potkanů: izolace a identifikace jeho biliárních metabolitů, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Porozumění molekulárním mechanismům souhry mezi rostlinnými léky a střevní mikroflórou, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorpce a likvidace ginsenosidů po perorálním podání podávání extraktu Panax notoginseng potkanům, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakce střevní mikroflóry s funkčními složkami potravy a nutraceutiky, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kyselina kávová zmírňuje pokles kortikální exprese BDNF mRNA vyvolaný vystavením nuceným stres z plavání u myší, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Mateřské podávání hydroxytyrosolu zlepšuje neurogenezi a kognitivní funkce u prenatálně stresovaných potomstvo, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Vliv střevní mikrobioty na metabolismus a toxicitu léčiv, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, The abundance and variety of carbon-active enzymes in the human gut microbiota, Nat. Microbiol. 11 (2013) 497–504.