Polysacharid Cistanche Deserticola zeslabuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních druhů kyslíku

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song a kol

Osteoporóza je metabolické onemocnění charakterizované osteopenií a deteriorací kostní mikrostruktury. Osteoklasty jsou primární efektorové buňky, které degradují kostní matrix a jejich abnormální funkce vede k rozvoji osteoporózy. Akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS) během buněčného metabolismu podporuje proliferaci a diferenciaci osteoklastů, a proto hraje důležitou roli při osteoporóze.Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) má protinádorovou, protizánětlivou a antioxidační aktivitu. Dopad CDP na osteoklasty je však nejasný. V této studii bylo použito barvení kyselou fosfatázou rezistentní na tartrát, imunofluorescence, reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce a analýza western blot k prokázání, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibovala osteoklastogenezi a resorpci hydroxyapatitu. Kromě toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)také inhiboval expresi osteoklastových markerových genů včetně Ctsk, Mmp9 a Acp5 a neměl žádný účinek na expresi aktivátoru nukleárního faktoru κB (RANK). Mechanické analýzy odhalily, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresi antioxidačních enzymů ke zmírnění produkce ROS zprostředkované RANKL v osteoklastech a inhibuje nukleární faktor aktivovaných T buněk a aktivaci mitogenem aktivované proteinkinázy. Tyto výsledky naznačují, že CDP může představovat kandidátní léčivo pro léčbu osteoporózy způsobené nadměrnou aktivitou osteoklastů.

KLÍČOVÁ SLOVAkostní resorpce,Cistanchedeserticolapolysacharid, MAPK, osteoklasty, reaktivní formy kyslíku

cistanche kulturistika

1|ÚVOD

Rovnováha mezi tvorbou kosti zprostředkovanou osteoblasty a kostní resorpcí zprostředkovanou osteoklasty hraje zásadní roli při udržování kostní metabolické homeostázy (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Když kostní resorpce převyšuje kostní tvorbu, dochází k osteoporóze, která je charakterizována snížením kostní hmoty a mikrostrukturálním poškozením kosti (Ikeda, 2008). Osteoporóza je běžné onemocnění u starších jedinců a žen po menopauze a její patogeneze není plně objasněna (Cooper & Melton, 1992). Nedostatek estrogenu je primární příčinou osteoporózy (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Navíc reaktivní formy kyslíku (ROS) mohou být indukovány receptorovým aktivátorem ligandu jaderného faktoru κB (RANKL) a jsou spojeny s tvorbou osteoklastů (Yip et al., 2005), a tak mohou přispívat k rozvoji osteoporózy (Manolagas, 2010). Některé studie zjistily, že nedostatek antioxidantu Nrf2 zvyšuje hladiny ROS a podporuje diferenciaci osteoklastů indukovanou RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Snížení produkce ROS během diferenciace osteoklastů by proto mělo být hodnoceno jako terapeutická strategie léčby osteoporózy.

Osteoklasty pocházejí z monocytární nebo makrofágové hematopoetické linie a jsou jedinými vícejadernými buňkami, které provádějí kostní resorpci (Teitelbaum, 2000). Výzkum zahrnující tvorbu osteoklastů má proto velký význam při vývoji účinné léčby onemocnění kostního metabolismu (Lorenzo, 2017). Faktor stimulující kolonie makrofágů (M‐CSF) a RANKL, produkované osteoblasty a aktivovanými T buňkami, jsou důležité cytokiny, které regulují osteoklastogenezi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indukuje expresi jaderného faktoru aktivovaných T buněk (NFATc1), což je kritický transkripční faktor aktivní během tvorby osteoklastů (Ishida et al., 2002). Aktivovaný NFATc1 podporuje expresi genů osteoklastových markerů, jako je tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAcP) a katepsin K (CTSK), které regulují osteoklastogenezi a funkci osteoklastů (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) se izoluje z dužnatých stonkůCistanchea má imunitní regulační, protinádorové, antiagingové a další farmakologické účinky (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)měl inhibiční účinek na lipopolysacharidem indukovanou produkci oxidu dusnatého (NO) v myších mikrogliálních buňkách (BV‐2 buňky; Nan et al., 2013). Kromě toho extrakt bohatý na fenylethanoidy (ECD).Cistanchezlepšila schopnost plavání myší snížením poškození svalů, oddálením akumulace kyseliny mléčné a zlepšením ukládání energie (Cai et al., 2010). Účinky CDP na funkci a aktivitu osteoklastů však zůstávají neznámé.

V této studii jsme prokázali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje RANKL-indukovanou diferenciaci osteoklastů a kostní resorpci. Základním mechanismem bylo CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresi antioxidačních enzymů ke zmírnění produkce ROS a následně potlačuje RANKL-aktivovaný NFAT a mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK)-signální kaskády. Tyto výsledky naznačují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)může být použit k léčbě osteoporózy způsobené nadměrnou osteoklastickou kostní resorpcí.

maca ginseng cistanche

2|MATERIÁLY A METODY

2,1|Materiály

CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(čistota > 98 procent) byla zakoupena od Solarbio (Peking, Čína) a připravena v zásobní koncentraci 1 mM ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Protilátky jsou specifické pro c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforylovaný (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK a ‐aktin byly získány od Santa Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Protilátky proti V-ATPáze d2 byly produkovány, jak bylo popsáno dříve (H. Feng et al., 2009). Testovací systém 3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐karboxymethoxyfenyl)‐2‐(4‐sulfofenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) a luciferázový testovací systém byly získány od společnosti Promega (Sydney, Austrálie) . Rekombinantní M-CSF byl zakoupen od R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantní protein GST‐rRANKL byl exprimován a purifikován, jak bylo popsáno dříve (Xu et al., 2000).

2,2|Buněčná kultura

Buňky RAW264.7 (buňky myších makrofágů) byly získány z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a kultivovány v modifikovaném minimálním esenciálním médiu (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Austrálie) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 2 mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (kompletní médium). Monocyty odvozené z kostní dřeně (BMM) byly izolovány z 6 týdnů starých myší C57BL/6J, které byly usmrceny podle postupů schválených Výborem pro etiku zvířat na University of Western Australia (RA/3/100/1244). Dlouhé kosti byly vypreparovány bez měkkých tkání a kostní dřeň byla propláchnuta z femuru a tibie, která byla poté kultivována v kompletním médiu v přítomnosti M‐CSF (50 ng/ml).

2,3|Test osteoklastogeneze

BMM byly naneseny na 96jamkové kultivační destičky v hustotě 6 × 103 buněk na jamku a ošetřeny kompletním médiem obsahujícím M‐CSF (50 ng/ml) a GST‐rRANKL (100 ng/ml), v přítomnosti popř. nepřítomnost různých koncentrací CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tři jádra) byla identifikována jako osteoklasty.

2,4|Testy cytotoxicity

BMM byly nasazeny do 96-jamkových destiček v množství 6 × 103 buněk na jamku a ponechány přes noc, aby přilnuly. Následující den byly buňky inkubovány s různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Po dalších 48 hodinách byl přidán roztok MTS (20 ul/jamka) a inkubován s buňkami po dobu 2 hodin. Absorbance při 490 nm byla stanovena pomocí čtečky mikrodestiček (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Imunofluorescenční barvení

BMM byly nasazeny v hustotě 6 × 103 buněk na jamku v přítomnosti M‐CSF (50 ng/ml) přes noc. Buňky byly poté stimulovány M‐CSF a GST‐rRANKL (100 ng/ml), dokud se nevytvořily zralé osteoklasty. Osteoklasty byly poté ošetřeny různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)po dobu 48 hodin před fixací 4% paraformaldehydem, permeabilizací pomocí 0,1% Triton X-100-PBS a blokováním 3% hovězím sérovým albuminem v PBS. Připravené buňky byly inkubovány s rhodaminem konjugovaným faloidinem po dobu 45 minut ve tmě, aby se obarvily na F-aktin. Buňky byly poté promyty PBS, jádra kontrastně obarvena 4′,6‐diamidino‐2‐fenylindolem (DAPI) a připevněna krycími sklíčky pro konfokální mikroskopii.

cistanche zkušenost

2,6|Test resorpce hydroxyapatitu

Pro měření aktivity osteoklastů byly BMM (1 × 105 buněk na jamku) kultivované na šestijamkových destičkách potažených kolagenem (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stimulovány pomocí GST‐rRANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ ml), dokud nebyly generovány zralé osteoklasty (Zhou et al., 2016). Buňky byly poté jemně odděleny od destičky pomocí roztoku pro disociaci buněk (Sigma-Aldrich) a stejný počet zralých osteoklastů byl naočkován do jednotlivých jamek v hydroxyapatitem potažených 96jamkových destičkách (Corning Osteoassay, Corning, NY). Zralé osteoklasty byly inkubovány v médiu obsahujícím GST‐rRANKL a M‐CSF s nebo bez CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)v uvedených koncentracích. Po 48 hodinách byla polovina jamek imunohistochemicky obarvena na aktivitu TRAcP, jak je popsáno výše, aby se vyhodnotil počet vícejaderných buněk na jamku. Zbývající jamky byly běleny po dobu 10 minut, aby se odstranily buňky a umožnilo měření resorbovaných oblastí. Resorbované oblasti byly fotografovány pod standardní světelnou mikroskopií a software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) byl použit ke kvantifikaci procentuální plochy povrchu hydroxyapatitu resorbovaného osteoklasty.

2,7|Luciferázové reportérové ​​testy

Pro zkoumání aktivace transkripce NFATc1 byly buňky RAW264.7 stabilně transfekovány luciferázovým reportérovým konstruktem reagujícím na NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekované buňky byly kultivovány na 48jamkových destičkách v hustotě 1,5 × 105 buněk na jamku a předem ošetřeny různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na 1 hod. Po předběžném ošetření byly buňky stimulovány GST‐rRANKL (100 ng/ml) po dobu 24 hodin a luciferázová aktivita byla měřena pomocí luciferázového reportérového testovacího systému podle protokolu výrobce (Promega).

2,8|Kvantitativní analýza reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (RT-PCR).

Celková RNA byla izolována z buněk pomocí činidla Trizol podle protokolu výrobce (Thermo Fisher Scientific). Komplementární DNA byla syntetizována pomocí reverzní transkriptázy viru myší leukémie Moloney s 1 ug RNA templátu a oligo‐dT primerů. Amplifikace specifických sekvencí polymerázovou řetězovou reakcí byla provedena pomocí následujícího programu: 94 stupňů po dobu 5 minut, následovalo 30 cyklů 94 stupňů po dobu 40 s, 60 stupňů po dobu 40 s a 72 stupňů po dobu 40 s a konečný krok prodloužení 5 minut při 72 stupních. Podrobné informace o specifických primerech jsou uvedeny v tabulce 1. Relativní hladiny messenger RNA byly vypočteny normalizací na expresi provozního genu Hmbs.

2,9|Western blot analýza

BMM byly kultivovány v kompletním médiu s M‐CSF v šestijamkových destičkách a stimulovány GST‐rRANKL (100 ng/ml) po uvedené časy. Buňky byly lyžovány v radioimunoprecipitačním lyzačním pufru a proteiny byly rozděleny elektroforézou na gelu dodecylsulfát sodný-polyakrylamid a přeneseny na poly(vinylidenfluoridové) membrány (GE Healthcare, Silverwater, Austrálie). Membrány byly blokovány v 5% odstředěném mléce po dobu 1 hodiny a poté sondovány různými specifickými primárními protilátkami za jemného třepání přes noc při 4 stupních. Membrány byly promyty a následně inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou. Reaktivita protilátek byla poté detekována pomocí zesíleného chemiluminiscenčního činidla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a vizualizována pomocí Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracelulární detekce ROS

Intracelulární hladiny ROS byly detekovány pomocí 2′,7′‐dichlorofluorescein diacetátu celulárního ROS detekčního kitu (Abcam, Melbourne, Austrálie). BMM (5 × 103 buněk na jamku) byly kultivovány v 96-jamkových destičkách a ošetřeny RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) a CDP po dobu 72 hodin. Intracelulární hladiny ROS byly měřeny pomocí 2′,7′‐dichlorfluorescein diacetátu, který v přítomnosti ROS oxiduje na fluorescenční DCF. Buňky byly promyty v Hankově pufru a inkubovány ve tmě po dobu 30 minut s 10 uM DCFH-DA. Snímky byly získány pomocí konfokální mikroskopie.

2.11|Statistické analýzy

Všechna data jsou reprezentativní pro alespoň tři experimenty provedené trojmo, pokud není uvedeno jinak. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. K určení významnosti rozdílů mezi výsledky byla použita jednosměrná analýza rozptylu následovaná Student-Newman-Keulsovými post hoc testy, přičemž p < ​​0,05="" bylo="" považováno="" za="">

3|VÝSLEDEK

3,1|CDP inhibuje RANKL-indukovanou osteoklastogenezi a fúzi osteoklastů

Chcete-li zjistit, zda CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)mohou potlačit tvorbu osteoklastů indukovanou RANKL, nejprve jsme provedli test osteoklastogeneze pomocí myších BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM byly léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 5 dnů se zvyšujícími se koncentracemi CDP. CDP snížil počet TRAcP-pozitivních vícejaderných buněk při koncentraci CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)dosáhl 5 uM nebo vyšší (obrázek la,b). K vyhodnocení CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)toxicitu a potvrdili, že tyto výsledky nebyly odrazem buněčné smrti nebo počtu, provedli jsme test MTS. BMM byly léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 48 hodin s různými dávkami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). CDP neměl žádný účinek na proliferaci BMM při koncentraci 15 uM nebo méně (obrázek 1c).

Testovat účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)při fúzi osteoklastů byly osteoklasty indukovány léčbou RANKL a M‐CSF, s různými dávkami CDP nebo bez nich(Cistanchedeserticolapolysacharid). Osteoklasty byly barveny rhodamin-faloidinem a DAPI, aby se vyhodnotil počet jader na osteoklast (obrázek 2a). Po CDP se snížil jak počet osteoklastů, tak průměrný počet jader na osteoklast(Cistanchedeserticolapolysacharid)ošetření (5–10 uM; obrázek 2b,c). Proto CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)měly inhibiční účinky na osteoklastogenezi indukovanou RANKL a fúzi osteoklastů v závislosti na dávce.

3,2|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)tlumí RANKL-indukovanou osteoklastickou resorpční aktivitu hydroxyapatitu

Pro detekci účinku CDP byl proveden test resorpce hydroxyapatitu(Cistanchedeserticolapolysacharid)na funkci osteoklastů (obrázek 3a). Po 24hodinové inkubaci se počet osteoklastů na jamku nezměnil, zatímco plocha resorpce hydroxyapatitu byla významně snížena ošetřením 5 a 10 uM CDP ve srovnání s kontrolními skupinami (obrázek 3b,c). Tyto výsledky ukazují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má silné inhibiční účinky jak na tvorbu osteoklastů, tak na resorpční aktivitu osteoklastů bez jakýchkoli cytotoxických účinků.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje expresi genu osteoklastového markeru

Dále zkoumat inhibiční účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na osteoklastogenezi a osteoklastickou kostní resorpci byly BMM léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 5 dnů s různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Poté byla provedena RT‐PCR k detekci exprese genů osteoklastových markerů. Exprese Nfatc1, klíčového transkripčního faktoru během osteoklastogeneze, byla inhibována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)způsobem závislým na dávce (obrázek 4a). Kromě toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(5 a 10 µM) downreguloval expresi genů souvisejících s kostní resorpcí, včetně Mmp9, Ctsk a Acp5 (obrázek 4b–d).

3,4|CDP potlačuje aktivitu NFATc1 a downstream proteinovou expresi

Prozkoumat účinek CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na RANKL-indukovanou aktivitu NFATc1 byl proveden luciferázový reportérový test. Léčba pomocí CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)při koncentracích 5 µM a vyšších významně inhiboval RANKL‐ indukovanou aktivitu NFATc1 (obrázek 5a). Kromě toho analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)významně potlačila proteinovou expresi NFATc1 a c‐Fos u BMM léčených RANKL a M‐CSF po dobu 3 a 5 dnů (obrázek 5b). Navíc exprese proteinů souvisejících s funkcí osteoklastů, jako je V-ATPáza-d2 a CTSK, byla downregulována v přítomnosti CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)ve srovnání s kontrolními skupinami. CDP však neměl žádný vliv na expresi RANK (obrázek 5b).

3,5|CDP podporuje expresi antioxidačních enzymů k odstranění produkce ROS během osteoklastogeneze indukované RANKL

Aby se prozkoumal základní mechanismus inhibice osteoklastogeneze závislé na CDP, byly BMM léčeny RANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ml) spolu s PBS nebo CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)po dobu 72 hodin. Zkoumali jsme účinek CDP na intracelulární produkci ROS stimulovanou RANKL. Intracelulární hladiny ROS byly zvýšeny ošetřením RANKL, které bylo oslabeno CDP (5 a 10 uM; obrázek 6a). Jak počet ROS-pozitivních buněk, tak intenzita ROS barvení byly sníženy ošetřením CDP způsobem závislým na dávce (obrázek 6b,c). Analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)podporovaly expresi thioredoxinu (TRX1) a glutathionreduktázy (GSR), zatímco potlačovaly expresi indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (NOS2) u BMM, které byly léčeny RANKL a M-CSF po dobu 3 dnů (obrázek 6d).

Chcete-li dále prozkoumat, zda CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačili diferenciaci osteoklastů snížením produkce ROS, pak jsme BMM ošetřili peroxidem (10 uM), abychom napodobili vysoký stav ROS v buňkách. BMM byly indukovány RANKL a M‐CSF po dobu 3 dnů a výsledky analýzy western blot a RT‐PCR ukázaly, že peroxid podporoval expresi NFATc1 a c‐Fos ve srovnání s kontrolními skupinami. V souladu s výsledky na obrázku 5 byla exprese NFATc1 a c‐Fos potlačena pomocí CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zatímco peroxid zachránil inhibiční účinek CDP (obrázek 6e,f). Tato data naznačují, že CDP potlačuje expresi NFATc1 a c-Fos vychytáváním produkce ROS.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje dráhy MAPK během osteoklastogeneze indukované RANKL

Dále jsme zkoumali účinek CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)léčba na expresi TRAF6 zprostředkovanou RANKL a aktivaci dráhy MAPK. Po inkubaci v médiu bez séra po dobu 2 hodin byly BMM stimulovány pomocí RANKL, s nebo bez CDP, po dobu 60 minut. Stimulace pomocí CDP (10 uM) neměla žádný účinek na expresi TRAF6 a zeslabila fosforylaci JNK2 a ERK1/2 v 10 a 20 minutách (obrázek 7). Kromě toho byla fosforylace p38 významně inhibována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)léčba po dobu 60 minut ve srovnání s kontrolními skupinami (obrázek 7). Tyto údaje ukazují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje RANKL-indukované MAPK signální dráhy, což je v souladu s jeho inhibičním účinkem na tvorbu a aktivitu osteoklastů.

4|DISKUSE

Cistanche, známý jako „pouštní ženšen“, přitahuje v poslední době velkou pozornost pro svou schopnost modulovat imunitu a působit protektivně během stárnutí a oxidačního stresu (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Bylo prokázáno, že fenylpropanoidem substituované glykosidy, hlavní aktivní složky Cistanche, inhibují aktivitu NO v makrofázích (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Kromě toho aCistancheextrakt snižoval oxidační stres v reperfundovaném myokardu po ischemii a hrál významnou roli v inhibici apoptotických drah vedoucích ke kardioprotekci (Yu, Li, & Cao, 2016). Jako důležitá součást Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má různé farmakologické funkce. Naše současná studie zjistila, že CDP potlačila diferenciaci a aktivaci osteoklastů aktivovanou RANKL snížením produkce ROS a také aktivací NFAT a MAPK.

Jako kyselá fosfatáza existuje TRAcP v různých buňkách a je hojně zastoupen v osteoklastech a alveolárních makrofázích (Snipes, Lam, Dodd, Gray a Cohen, 1986). TRAcP je charakteristickým enzymem osteoklastů a jeho exprese úzce souvisí s funkcí osteoklastů, která je považována za indikátor aktivity osteoklastů a kostní resorpce (Minkin, 1982). V naší studii CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhiboval počet TRAcP-pozitivních buněk, což naznačuje, že RANKL-indukovaná osteoklastogeneze byla blokována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Degradace kostní matrix osteoklasty závisí na katepsinu K (CTSK) a MMP (Gruber, 2015). Zde CDP významně downreguloval expresi funkčních genů osteoklastů, jako jsou Mmp9, Ctsk a Acp5.

Diferenciace a funkce osteoklastů jsou regulovány více signálními cestami (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Po navázání na RANK RANKL rekrutuje adaptorový protein TRAF6 k aktivaci exprese NFATc1, což je důležitý transkripční faktor pro tvorbu osteoklastů, ovlivňující genovou expresi specifickou pro osteoklasty, včetně TRAcP a CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). V této studii jsme zjistili, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)neměl žádný vliv na expresi RANK a TRAF6 v osteoklastech. Nicméně CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibovala aktivaci NFATc1 indukovanou RANKL během osteoklastogeneze BMM. Kromě toho bylo prokázáno, že ROS, produkovaný mitochondriemi v procesu dodávání elektronů, podporuje proliferaci a diferenciaci osteoklastů a reguluje degradaci kostní matrix (Ha et al., 2004). Nedávná studie zjistila, že RANKL indukoval nukleární import Bach1 a zeslabil produkci antioxidačních enzymů zprostředkovanou Nrf2, čímž zvýšil intracelulární expresi ROS a osteoklastogenezi u myší (Kanzaki et al., 2017). Kromě toho zvýšená tvorba intracelulárních ROS homocysteinem zvýšila tvorbu a aktivitu osteoklastů (Koh et al., 2006). Naše studie zjistila, že CDP snižuje akumulaci ROS v osteoklastech inhibicí exprese NOS2 a podporou exprese antioxidačních enzymů, jako je TRX1 a glutathionreduktáza. Když jsme BMM ošetřili peroxidem, abychom zvýšili intracelulární akumulaci ROS, výsledky, že zvýšené ROS by mohly zlepšit expresi NFATc1, odhalily, že ROS byl před NFATc1. Také jsme zjistili, že peroxid zachránil inhibiční účinek CDP na expresi NFATc1. Naše data tedy naznačují, že CDP potlačuje akumulaci ROS k inhibici exprese NFATc1 a poté k potlačení tvorby a funkce osteoklastů.

ERK, JNK a p38 patří do rodiny MAPK, která se také podílí na regulaci diferenciace osteoklastů (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivuje MAPK dráhu zvýšením fosforylace ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). Ukázali jsme, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačil RANKL zprostředkovanou fosforylaci klíčových proteinů v dráze MAPK, čímž přispěl k inhibičnímu účinku CDP na expresi genů osteoklastových markerů. Pokud je nám známo, jedná se o první studii ukazující inhibiční účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na produkci ROS, aktivaci NFAT a MAPK, což představuje nové mechanismy účinku CDP in vitro.

V souhrnu jsme ukázali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zmírňuje osteoklastogenezi a resorpci hydroxyapatitu a expresi genů osteoklastových markerů včetně Ctsk, Mmp9 a Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)byl schopen potlačit produkci ROS zprostředkovanou RANKL, stejně jako aktivaci NFAT a MAPK (obrázek 8). Souhrnně naše výsledky naznačují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)může představovat kandidátní léčivo pro léčbu stavů souvisejících s osteoklasty doprovázených nadprodukcí ROS.

OBRÁZEK ​​8 Schematický diagram CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)funkce při diferenciaci osteoklastů. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje RANKL-indukovanou produkci ROS, stejně jako aktivaci NFATc1 a MAPK, a tím inhibuje osteoklastogenezi. CDP,Cistanchedeserticolapolysacharid; MAPK, mitogenem aktivovaná proteinkináza; NFATcl, jaderný faktor aktivované T buňky; RANKL, receptorový aktivátor ligandu jaderného faktoru κB; ROS, reaktivní formy kyslíku [Barevný obrázek si můžete prohlédnout na wileyonlinelibrary.com]

PODĚKOVÁNÍ

Tato studie byla podpořena nadací Nature Science Foundation of China (81572164), Národním programem pro výzkum a vývoj klíčových technologií v Číně (2017YFC1103300), Natural Science Foundation provincie Guangxi (2016GXNSFAA380295) a univerzitním projektem výzkumu vědy a technologie v Guangxi Provincie (KY2015YB054). Je také částečně podporován projektem Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards a Australská rada pro zdraví a lékařský výzkum (NHMRC, č. 1107828 a 1027932).

STŘET ZÁJMŮ

Autoři prohlašují, že nedochází ke střetu zájmů

Z: 'Cistanchedeserticolapolysacharidzmírňuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních forem kyslíku Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684