Imunostimulační aktivita vodou extrahovatelných polysacharidů z Cistanche Deserticola jako rostlinného adjuvans in vitro

Pro více informací:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, Čína,

2 Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Šanghaj, Čína,

3 College of LifeScience and Technology, Univerzita Xi'an Jiaotong, Xian, Shanxi, Čína

Abstraktní

V moderních vakcínách je důležité bezpečné a účinné adjuvans vakcíny. Různí Číňanérostlinné polysacharidydokáže aktivovat imunitní systém.Cistanche deserticola(CD) je tradiční čínská bylina a kandidát na adjuvans. Tady jsme to potvrdilivodou extrahovatelné polysacharidyCD (WPCD) by mohlo modulovat imunitní reakce in vitro a in vivo. V závislosti na dávce WPCD významně podporovalo zrání a funkci dendritických buněk odvozených z myší dřeně (BM-DC) prostřednictvím up-regulace hladin exprese MHC -II, CD86, CD80 a CD40, alogenní proliferace T buněk a výtěžky IL-12a TNF- prostřednictvím Toll-like receptor4 (TLR4), jak ukazují experimenty in vitro. Kromě toho byla jeho imunomodulační aktivita pozorována také u myší. WPCD účinně zlepšil titry IgG, IgG1 a IgG2a a výrazně zvýšil proliferaci T a B buněk, produkci IFN- a IL-4 v CD4 plus T buňkách a hladinu exprese IFN- v CD8 plus T buňky lepší než Alum. Kromě toho by WPCD mohl výrazně zvýšit hladinu exprese CD40 a CD80 na DC ve slezině a snížit frekvenci Treg. Studie naznačuje, že polysacharidy z Cistanche deserticola jsou bezpečným a účinným adjuvans vakcíny pro vyvolání jak humorální imunity, tak buněčné imunity aktivací DC prostřednictvím signální dráhy TLR4.

Kliknutím zobrazíte kmenové produkty Cistanche

Úvod

Vakcíny jsou důležité pro kontrolu nebo prevenci nemocí. Nově generované a aktuálně vyvíjené vakcíny jsou vysoce purifikované rekombinantníantigenys vyšší bezpečností, ale purifikované antigeny nemohou stimulovat uspokojivéimunitní odpověďve srovnání s atenuovanými nebo inaktivovanými patogenními přípravky. S pomocí adjuvans mohou vakcíny vyvolat perzistenciimunitní reakce[1,2]. Nová účinná adjuvans jsou široce zainteresovaná jak na vývoji vakcín, tak na lidském zdraví. Dosud byla identifikována a rozsáhle studována různá adjuvans. Tyto adjuvans poskytují vakcínám několik výhod, včetně snížení požadovaného množství antigenů, minimalizace počtu imunizací potřebných pro normální imunitní reakce a navození rychlejší, širší a silnějšíimunitní reakce[3–5]. Ačkoli bylo vyvinuto mnoho účinných adjuvans, jako je lipopolysacharid (LPS) a Freundovo kompletní adjuvans (FCA), nejsou široce používány kvůli své toxicitě. Proto je pro klinické použití licencováno pouze několik adjuvans, jako je Alum [6]. Celkově by měla být vyvinuta účinnější a bezpečnější adjuvancia, která by podporovala lepší profylaktické a terapeutické vakcíny proti infekčním a neinfekčním onemocněním.

Bezpečnost je důležitým faktorem při vývoji adjuvans. Čínské bylinné složky zahrnují živiny a důležité aktivní kompozity, jako jsou fenolické sloučeniny a polysacharidy, které mohou působit jako silné imunostimulanty [7–9]. Mezi nimi byly široce prozkoumány polysacharidy z tradičních čínských bylin kvůli jejich imunostimulačním aktivitám a nízké toxicitě. Například inulin je imunitní adjuvans bez toxicity jiných adjuvans, jako je FCA. AdvaxTM delta inulinové adjuvans také úspěšně zvýšilo imunogenicitu vakcín [10,11]. Astragalus, také známý jako Huangqi v čínštině a Radix Astragali v latině, je široce rozšířen po celém světě. Polysacharid je jednou z jeho hlavních účinných látek odpovědných za imunomodulační aktivitu. Experimentální studie prokázaly, že polysacharid Astragalus má silné imunomodulační účinky in vitro i in vivo [12, 13]. Polysacharidy Lycium barbarum jako adjuvans vakcíny také vykazovaly dobré zlepšení a stimulační účinky [14, 15]. Tyto studie naznačují, že čínské rostlinné polysacharidy jsou ideálními kandidáty pro vývoj adjuvans.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, v čínštině "Rou Cong Rong") je cenná tradiční čínská bylina, která je běžně považována za "ženšen pouští" pro své vynikající tonizující účinky. Je distribuován v suchých nebo polosuchých oblastech v Xinjiang. V Číně se jeho sušená dužinatá nať používá jako posilující potravina po stovky let [16, 17]. Po mnoho let se vařené CD používá jako tonikum k léčbě poškození způsobeného přepětím, což naznačuje, že je bezpečné pro orální podávání. Tato rostlina je široce znepokojena díky svým širokým léčivým funkcím. Nedávné fytochemické a farmakologické studie prokázaly, že polysacharidy jsou hlavními biologicky aktivními složkami a mají různé biologické účinky, včetně imunomodulační aktivity, antioxidačního účinku a protizánětlivých účinků [18–21]. Nicméně aktivita na posílení imunity vodou extrahovatelných polysacharidů z C. deserticola v Xinjiang byla hlášena jen zřídka.

Je dobře známo, že DC jsou důležité buňky prezentující antigen (APC) poskytující signály potřebné pro iniciaci imunitních reakcí a modulaci vrozených a adaptivních buněk. Některá adjuvans zlepšující vychytávání antigenu DC mohou zvýšit kostimulační nebo MHC molekuly a posílit imunitu. Když začne maturace DC, produkuje se více kostimulačních molekul a cytokinů a DC vykazují odlišné fenotypy [22, 23].

V této studii jsme nejprve využili, zda WPCD může podporovat aktivaci DC prostřednictvím signální dráhy TLR4 in vivo. Protože DC byly spojením mezi vrozenými a adaptivními imunitními reakcemi, předpokládali jsme, že aktivace DC stimulovaná WPCD by ovlivnila výsledek adaptivní imunity. Zkoumali jsme specifickou imunitní odpověď na ovalbumin (OVA) u myší léčených WPCD, včetně titrů IgG, IgG1 a IgG2a podtříd, T- a B- proliferace a produkce cytokinů. Zkoumali jsme, zda léčba WPCD zvýší aktivitu DC a Treg buněk ve slezině těchto myší. Naše poznatky prokázaly potenciální imunomodulační aktivitu přírodních polysacharidů z C. deserticola a rozšířily rozsah jejich aplikace

Materiály a metody

Zvířata

Osmi až deset týdnů staré samice myší C57BL/6, BALB/c nebo ICR byly zakoupeny od First Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Čína). Myši byly umístěny v podmínkách bez patogenů podle pokynů Výboru pro péči o zvířata a použití (ACUC) univerzity Xinjiang pro zdraví a pohodu zvířat. Postupy pokusů na zvířatech byly schváleny AUCC univerzity Xinjiang.

Extrakce vodných extraktů

C. deserticola je rostlina v provincii Xinjiang v Číně. Surový polysacharid byl získán extrakcí vodou a srážením ethanolem. Stručně řečeno, 10}0 g sušené C. deserticola bylo rozemleto na prášek a poté přefiltrováno. Prášek se opakovaně refluxoval s petroletherem při teplotě místnosti a potom se refluxoval s bezvodým ethanolem po dobu 1 hodiny, aby se odstranily barevné složky a lipidy. Zbytky byly třikrát extrahovány vroucí vodou a extrakty byly spojeny dohromady, odstřeďovány při 4000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a refluxovány při 60 °C po dobu 4 hodin. Do roztoku byly přidány čtyřnásobné objemy 95% ethanolu, aby se vysrážely surové polysacharidy. Surové polysacharidy byly znovu rozpuštěny v destilované vodě a ošetřeny činidlem Savage, aby se odstranily proteiny. Extrakty byly rozpuštěny v PBS a sterilizovány přes 0,{9}}μm filtr. Konečně, celkový obsah cukru ve WPCD byl 59,58 procenta, jak ukazuje analýza fenol-kyselina sírová [24].

Generování DC

BM-DC byly vytvořeny podle dříve popsané metody s mírnými úpravami [25]. DC kostní dřeně z myší C57BL/6 byly propláchnuty kompletním médiem RPMI-1640 (Gibco) doplněným 10 procenty fetálního telecího séra (Hyclone). Odebrané buňky byly resuspendovány v RPMI-1640 médiu s 50 μM merkaptoethanolu (Sigma, St Louis, MO) a 20 ng/ml myšího GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) a inkubovány při 37˚ C v atmosféře 5 procent CO2. Polovina kultivačního média byla nahrazena čerstvým médiem obsahujícím GM-CSF každé 1–2 dny. Buňky byly shromážděny v den 6, ošetřeny různými dávkami WPCD, LPS (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) po dobu 24 hodin a poté hodnoceny průtokovou cytometrií.

Detekce zrání DC a aktivace T buněk in vitro

Účinek in vitro zrání WPCD na BM-DC byl hodnocen na základě výsledků fenotypové analýzy FAC. V den 7 byly BM-DC z C57BL/6 indukovány v přítomnosti GM-CSF a poté ošetřeny různými koncentracemi WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0,05, 0,1 a 0,2 mg/ml) po dobu 12 hodin v triplikátech. LPS (100 ng/ml) byl použit jako pozitivní kontrola. Poté, co byly BM-DC promyty v PBS a Fc Block (BD Biosciences, CA) byl použit k zabránění nespecifické vazbě protilátek, byly buňky obarveny v PBS pomocí vhodného FITC-, PE- nebo APC-konjugovaného CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 a MHC-II protilátky (BD) po dobu 20 minut při 37 °C. Obarvené buňky byly detekovány pomocí FACs Calibur (BD). Analýza dat byla provedena pomocí softwaru FlowJo (Tree Star).

V experimentu zrání DCS in vitro byly supernatanty buněčných kultur také shromážděny k analýze IL-12 a TNF- pomocí souprav pro stanovení cytokinů (Boster, Wuhan, Čína) podle pokynů výrobce. Absorbance při 450 nm byla měřena pomocí čtečky destiček ELISA (Bio-Rad, USA). Množství cytokinů ve vzorcích bylo vypočteno pomocí standardních křivek rekombinantních cytokinů podle regresní lineární metody.

Pro testování jejich alogenní stimulační aktivity byl proveden experiment smíšené lymfocytární reakce (MLR) podle předchozí metody [26] pomocí testu MTT (Sigma, St Louis, MO). Stručně, BM-DC z myší C57BL/6 použité jako stimulační buňky byly získány 7. den v RPMI-1640 médiu plus GM-CSF a ošetřeny různými koncentracemi WPCD po dobu 12 hodin při 37 °C. Buňky byly promyty a resuspendovány v médiu RPMI{10}} před nanesením do 24-jamkové destičky. Suspenze singleplenocytů jako respondérových buněk byla izolována z BALB/c myší. BM-DC byly smíchány se splenocyty v poměrech 1:5 a 1:10. Buňky byly kultivovány při 37 °C v atmosféře 5 procent CO2 po dobu tří dnů v triplikátech. Léčba LPS byla použita jako pozitivní kontrola. Ke kulturám bylo následně přidáno 20 μl MTT pro poslední 4-hodinovou kultivaci. Absorbance při měřicí vlnové délce (490 nm) a referenční vlnové délce (650 nm) byly měřeny pro analýzu proliferace T buněk. Všechny vzorky byly měřeny proti kontrole pozadí.

Léčba inhibitorem TLR4 in vitro

BM-DC byly předem ošetřeny 5 μM TAK-242 (inhibitor TLR4, Medchemexpress Inc.USA) po dobu 1 hodiny a poté kokultivovány s různými koncentracemi WPCD (100 a 200 ug/ml) po dobu 12 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti Golgiho Stop v triplikátech. V pozitivní kontrole byl přidán LPS. Buňky a supernatanty byly detekovány pomocí FAC pro analýzu povrchových markerů CD86a CD40 a pomocí ELISA pro analýzu cytokinů TNF-a a IL-12, v daném pořadí.

Imunizační protokol

Test akutní toxicity. Při orálním testu akutní toxicity v této studii byly použity 4 0 zdravé dospělé ICR myši. ICR myši byly před podáním dávky nalačno (potrava, ale ne voda přes noc). WPCD byl podáván orálně v dávkách 0, 50, 500 nebo 5000 mg/kg tělesné hmotnosti každému zvířeti po dobu 7 dnů. Do kontrolní skupiny byly zahrnuty myši ošetřené fyziologickým roztokem a alumem. Zvířata byla pozorována denně během 14 po sobě jdoucích dnů. Myši byly jednotlivě pozorovány, aby se zaznamenala mortalita a klinické příznaky. Kromě toho byly během experimentu měřeny tělesné hmotnosti a jejich spotřeba potravy a vody. V den 14 se vypočítal index sleziny nebo brzlíku jako (hmotnost sleziny nebo brzlíku/tělesná hmotnost) × 10.

Detekce imunomodulační aktivity WPCD in vivo. Pro zjištění, zda WPCD má imunomodulační aktivitu, byl jako modelový antigen použit ovalbumin (OVA) (Sigma) a samice myší ICR byly náhodně rozděleny do 7 skupin (negativní kontrolní skupina (0,9 procenta NaCl a WPCD 400 ug) a pozitivní kontrola (Alum 200 ug s OVA)). Myším bylo dvakrát subkutánně podáváno 10 ug samotného OVA nebo WPCD s OVA podle dávky 20, 100 nebo 400 ug s 2-týdenním intervalem. Vzorky krve a sleziny byly získány po posilovací vakcinaci, aby bylo možné detekovat titry IgG, podtřídy IgG, proliferaci splenocytů a cytokiny, povrchové markery DC a frekvenci Treg

Detekce OVA-specifických protilátek

Titry a podtřídy IgG specifické pro OVA byly vyšetřeny metodou ELISA podle předchozí metody [27]. Destičky ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) byly potaženy přes noc a poté blokovány. Vzorky séra byly sériově zředěny pro analýzu titru IgG nebo detekci IgG1 a IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Destičky byly poté inkubovány s PBST obsahujícím HRP-konjugovaný anti-myší IgG, IgGl a IgG2a po dobu 1 hodiny při 37 °C. Kolorimetrická reakce byla vyvolána tetramethylbenzidinem (TMB) a poté byly měřeny absorbance při 450 nm/655 nm a vyjádřeny jako jednotky optické hustoty (OD).

Detekce proliferace splenocytů a cytokinů

Proliferace splenocytů byla stanovena testem MTT. V den 21 po první vakcinaci byla získána suspenze jednoho splenocytu. Buňky byly kultivovány v RPMI-1640 médiu v96-jamkových destičkách podle koncentrace 1×106 buněk/jamku v triplikátech. Kultury byly stimulovány pomocí OVA (konečná koncentrace 10 ug/ml), ConA (konečná koncentrace 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) a LPS (konečná koncentrace 100 ng/ml) po dobu 48 hodin při 37 °C. . Buňky byly kultivovány po dobu 48 hodin a do každé jamky bylo přidáno 20 ul (5 mg/ml) MTT (Sigma, St Louis, MO) a inkubováno další 4 hodiny. Po přidání 50 ul DMSO do každé jamky, aby se zastavil vývoj barvy (Sigma), byly destičky odečteny při 570 nm čtečkou mikrotitračních destiček (Bio-Rad, CA, USA). Proliferace splenocytů byla vyjádřena jako stimulační index (SI), což byl poměr OD570 nm stimulované jamky k nestimulované jamce.

Výtěžky IL-4 a IFN- v T buňkách byly měřeny intracelulárním cytokinovým barvením podle publikovaného protokolu s menšími úpravami [27, 28]. Suspenze jednotlivých splenocytů byla připravena 21. den po první vakcinaci. Po lýze červených krvinek byly splenocyty (2x106 buněk/ml) inkubovány s OVA (10 ug/ml) po dobu 4-h stimulace a byla přidána Golgiho stop (BD) na 12 hodin inkubace, PMA jako pozitivní kontrola. Buňky byly shromážděny, promyty PBS, obarveny CD4-FITC/CD8-FITC a fixovány a permeabilizovány pomocí sady Cyto fix/Cytoperm (BD) podle pokynů výrobce. Intracelulární cytokinové barvení bylo provedeno s vhodnou koncentrací IL-4-PE nebo IFN- -APC protilátek při 4˚C po dobu 20 minut. Obarvené buňky byly detekovány pomocí FAC. Analýza dat byla provedena ve FlowJo.

Hodnocení zrání DC a Treg buněk ve slezině

Pro analýzu zrání DC ze splenocytů u myší bylo barvení buněčného povrchu provedeno protilátkami CD11c-PE, CD40-FITC a CD80-APC. V den 3 po první vakcinaci byla získána suspenze jednotlivých splenocytů (1 x 106 buněk/ml) a buňky byly podrobeny dvojitému barvení. Intenzity fluorescence byly měřeny pomocí FACs Calibur a naměřená data byla analyzována pomocí FlowJo.

Aby bylo možné pozorovat, zda WPCD může snížit frekvenci buněk CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg. Suspenze jednotlivých splenocytů byla připravena 7. den po druhé vakcinaci. Splenocyt (2×106 buněk/ml) byl podroben barvení buněčného povrchu protilátkou CD4-APC, následované barvením jaderného cytokinu vhodnými protilátkami CD25-FITC a Foxp3-PE s myší regulační soupravu pro barvení T-buněk (eBios ciences) podle pokynů výrobce. Frekvence buněk CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg byla testována na FAC. Analýza dat byla provedena ve FlowJo.

Statistická analýza

Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) testy (Tukey's Multiple-Comparison Test) byla provedena pro analýzu rozdílů mezi více experimentálními skupinami. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Výsledek

WPCD podporoval zrání a funkci BM-DCs in vitro

Adaptivní imunita je určena aktivací DC, včetně typů kostimulačních molekul a cytokinů [29, 30]. Zpočátku jsme zkoumali, zda WPCD může podporovat expresi kostimulačních molekul. Podle různých dávek WPCD byly podávány BM-DC z C57BL/6. Byly analyzovány hladiny exprese CD11c, CD86, CD80, CD40 a MHC-II v buňkách (obr. 1). Buňky hradlované pomocí SSC a FSC ukázaly, že ošetření různými dávkami WPCD nezměnilo morfologii BM-DC (data nejsou uvedena). Hladiny exprese CD86, CD80 a CD40 byly významně upregulovány způsobem závislým na dávce ve srovnání s neléčenou skupinou a dosáhly plató při dávce 20 ug/ml WPCD, ale rozdíl byl není signifikantní ve srovnání se skupinou LPS (obr. 1A–1C). Hladina exprese MHC-II byla významně zvýšena na svou maximální hodnotu pod dávkou 50 ug/ml (obr. 1D). Výsledky analýzy buněčných povrchových markerů ukázaly, že DC ošetřené LPS nebo WPCD vykazovaly významně zvýšené hladiny exprese CD86, CD80, CD40 a MHC-II a podporovaly fenotypové zrání.

Některá adjuvans by mohla zvýšit kostimulační molekuly na DC nebo přímo indukovat sekreci cytokinů. IL-12 a TNF- jsou hlavní cytokiny pro aktivaci imunitní odpovědi Th1. Analyzovali jsme výtěžky cytokinů v BM-DC po ošetření WPCD. Poté, co byly BM– DC ošetřeny různými obsahy WPCD po dobu 12 hodin, byl odebrán supernatant k detekci obsahu IL-12 a TNF- pomocí soupravy ELISA. WPCD by mohl v závislosti na dávce zvýšit produkci IL-12 (obr. 2A) a TNF- (obr. 2B). Výsledky ukázaly, že WPCD může vyvolat funkční zrání DC

V imunitní odpovědi je nutné funkčně aktivovat DC. Poté byla vyšší úroveň alogenní proliferace T buněk indukována plně zralými DC. Proto byla funkční odpověď DC na WPCD zkoumána pomocí MLR. Alostimulační schopnost DC indukovaných WPCD, podobná LPS, byla dramaticky zvýšena způsobem závislým na dávce v uvedeném poměru (obr. 2C a 2D). Výsledky ukázaly, že WPCD zlepšila prezentaci antigenu a optimalizovala odpověď T-buněk pomocí MLR in vitro.

WPCD podporoval zrání DC prostřednictvím dráhy TLR4

Z výše uvedených výsledků lze odvodit, že BM-DC aktivované pomocí WPCD indikovaly podobné exprese povrchových molekul DC jako LPS (ligand TLR4). Předpokládali jsme tedy, že BM-DC jsou aktivovány WPCD prostřednictvím dráhy TLR4. Poté, co byly BM-DC předem ošetřeny TAK-242 (inhibitor TLR4) a kokultivovány s WPCD a LPS po dobu 12 hodin, exprese CD40, CD86, TNF-a nebo IL{{12 }} byly detekovány pomocí FAC nebo ELISA. Jak je znázorněno na obr. 3A a 3B, léčba TAK-242 vedla k významně snížené expresi CD40 a CD86 indukované LPS nebo WPCD a produkci cytokinů IL-12 nebo TNF-a byly také významně sníženy (obr. 3C a 3D). Výsledky ukázaly, že WPCD může aktivovat zrání DC prostřednictvím dráhy TLR4.

WPCD zvýšila humorální a buněčnou imunitu

Pro účely srovnání jsme hodnotili účinky WPCD na vyvolání humorální imunitní odpovědi u myší imunizovaných OVA. Před vakcinací a ve dnech 14, 21, 35 a 49 po první vakcinaci byla odebrána krev pro detekci titru IgG a séra podtříd IgG pomocí ELISA. IgG protilátková odpověď na OVA se zvyšovala se zvýšením dávky podávané WPCD (100 a 400 ug) v závislosti na dávce (obr. 4). Optimální koncentrace byla 100 ug/ml WPCD a zvýšila odpovědi IgG dvakrát ve srovnání se samotným OVA ve dnech 21, 35 a 49 (obr. 4A). Značné zvýšení hladin OVA-specifických IgG1 a IgG2a protilátek pod 20 a 100 ug podání WPCD bylo získáno ve srovnání se skupinou OVA v séru v den 35 (obr. 4B). Mezitím Alum podporoval pouze úrovně exprese OVA-specifických IgG a IgG1 protilátek u imunizovaných myší. Samotný WPCD nespustil OVA-specifické protilátky. Výše uvedené výsledky zjevně naznačovaly, že WPCD generoval vyšší titry protilátek a vyváženější Th1/Th2 odpovědi než Alum.

Dalším indikátorem buněčné imunity je proliferace splenocytů. ConA stimuluje T-buňky a LPS stimuluje proliferaci B-buněk. V den 21 po první vakcinaci byla získána suspenze jednotlivých splenocytů, která byla stimulována OVA (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml) peptidem, ConA (5 ug/ml) a LPS (5 ug/ml) po dobu 48 hodin. Poté byla měřena proliferace T buněk metodou MTT. WPCD mohl významně podporovat OVA-antigen, Con A-mitogen a LPS mitogenem stimulovanou proliferaci splenocytů u myší imunizovaných OVA a WPCD (obr. 5) a optimální koncentrace WPCD byla 100 ug/ml. Tato data ukázala, že WPCD jako adjuvans vakcíny u myší imunizovaných OVA by mohl účinněji indukovat aktivaci T-buněk a B-buněk než Alum.

Všechna testovaná adjuvans WCPD formulovaná s OVA vakcínami vytvářela stejně silnou humorální a buněčnou imunitu (obr. 4 a 5). Na základě těchto dat, abychom dále vyhodnotili vlivy WPCD na OVA-specifickou odpověď T pomocných (Th) buněk, jsme dále analyzovali exprese cytokinů v CD8 plus a CD4 plus T buňkách průtokovou cytometrií (obr. 6). V den 21 po první vakcinaci byl izolován jeden splenocyt myší a poté kokultivován s OVA (10 ug/ml). Výtěžek IL-4 v CD4 plus T buňkách ve skupině, které bylo podáváno 100 ug OVA/WPCD, byl významně vyšší než ve skupině OVA/Alum a skupině OVA a podobný jako u PMA (obr. 6A). Kromě toho byl výtěžek IFN- v CD8 plus a CD4 plus T buňkách také významně zvýšen u myší, kterým byl podáván OVA/WPCD (20, 100 a 400 ug) (obr. 6B a 6C). Ve srovnání s adjuvans Alum vykazoval WPCD lepší schopnost indukovat sekreci IL-4 a IFN- z T buněk.

WPCD stimuloval zrání DC a snižuje frekvenci Treg in vivo

DCS je uznáván jako nejúčinnější APC zapojené do iniciace primární imunitní odpovědi. V den 3 po první vakcinaci jsme tedy také zkoumali účinky WPCD na CD40 a CD80 na DC ve slezině u myší (obr. 7A a 7B). Myši ve skupině 100-ug OVA/WPCD produkovaly významně vyšší hladiny CD40 a CD80 na DC než myši ve skupině OVA/Alum. Tato data ukázala, že WPCD může aktivovat DC a indukovat dozrávání DC u myší. Buňky Treg mohou vyvážit toleranci a imunitní reakce. Pro další zkoumání toho, jak WPCD moduluje imunitní odpověď, byly Treg buňky ve slezině u myší obarveny soupravou pro barvení myších regulačních T buněk. V den 21 po první vakcinaci byla pozorována snížená frekvence CD25 plus Foxp3 plus Treg buněk v celkových CD4 plus T buňkách (obr. 7C). Ve srovnání se skupinami OVA a OVA/Alum skupina WPCD vykazovala významně sníženou frekvenci Treg.

Hodnocení bezpečnosti WPCD u myší

Abychom odhadli orální akutní toxicitu, provedli jsme test akutní toxicity. Myši, kterým bylo orálně podáváno 5000 mg/kg tělesné hmotnosti, nevykazovaly žádné abnormální chování nebo vedlejší účinky a při testu hodnocení toxicity nebyla zjištěna žádná úmrtnost. Nebyl zaznamenán žádný významný rozdíl v přírůstku tělesné hmotnosti, indexu brzlíku a indexu sleziny mezi různými skupinami myší, kterým byly podávány různé dávky WPCD, a neměly žádný významný rozdíl (tabulka 1). Po 14 dnech nebyla pozorována žádná mortalita. Proto hodnota LD50 WPCD byla více než 5000 mg na kg tělesné hmotnosti.

Aby se otestovalo, zda má WPCD negativní účinky na růst myší, před a po subkutánní vakcinaci, byla pro každou myš stanovena tělesná hmotnost (tabulka 2). Při následném pozorování myší nebyly pozorovány vedlejší účinky nebo abnormální chování. Kromě toho tělesná hmotnost myší, kterým byl podáván WPCD, a myší, kterým byl podáván fyziologický roztok nebo OVA/Alum, nevykazovala žádný významný rozdíl. Tyto výsledky pozorování ukázaly, že podávání WPCD bylo bezpečné.

Diskuse

Adjuvancia jsou klíčovými složkami vakcín [31]. Díky pokroku v genomice a proteomice je identifikováno stále více rekombinantů a syntetických vakcinačních molekul. Proto je zapotřebí více adjuvans a formulací. Některá účinná adjuvancia obecně souvisí se zvýšenou toxicitou, například FCA. Proto je nutné najít bezpečnou formulaci obsahující různé synergické složky, které nakonec povedou k požadované imunitní reakci. Polysacharidy z čínských bylin jsou netoxické a nevykazují žádné významné vedlejší účinky [32,28]. Pro určitou vakcínu je vyžadován bezpečný adjuvans.

Cistanche deserticola je důležitá tonická bylina a široce se vyskytuje ve vyprahlých zemích a teplých pouštích na severozápadě Číny. Cistanche deserticola je široce znepokojen kvůli svým biologickým aktivitám včetně imunomodulačních, antioxidačních, antibakteriálních a protinádorových účinků [20,21]. Určitého pokroku bylo dosaženo ve strukturní charakterizaci a imunologické aktivitě Cistanche deserticola, která je dobrým kandidátem pro vývoj adjuvans. Experimentálně jsme hodnotili adjuvantní účinky a mechanismus WPCD in vitro a in vivo. Subkutánní podávání WPCD významně podpořilo humorální a buněčné imunitní reakce zvýšením sérových protilátek a proliferace lymfocytů, zvýšením exprese cytokinů, up-regulací zrání DC a snížením frekvence CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg buněk.

DCS jsou klíčové APC pro aktivaci naivních T buněk. Pro adjuvans je důležitá aktivace DC. DCS, zejména DC derivované z myší dřeně, se často používají k hodnocení adjuvans a vakcín. Průtoková cytometrie dokáže odlišit buňky, které byly aktivovány po zachycení antigenu z okolních buněk. V analýze FCM je stupeň agregace stimulovaných buněk nepřímým ukazatelem hodnocení bezpečnosti imunomodulátorů [3]. Data adjuvantní aktivity WPCD v DC in vitro tedy mohou poskytnout cenné informace pro zvířecí modely. Na základě modelu BM-DC byly hladiny exprese MHC-II, CD86, CD80 a CD40, produkce cytokinů a proliferace alogenních T buněk detekovány v optimálním rozmezí koncentrací WPCD. Hladiny exprese MHC-II, CD86, CD80 a CD40 byly up-regulovány v BM-DC a výtěžky TNF-a a IL-12 byly zvýšeny v závislosti na dávce. Byla pozorována alogenní proliferace T buněk. Morfologie BM-DC se nezměnila. Indukcí aktivace BM-DC a sekrece zánětlivých cytokinů in vitro může adjuvans WPCD významně zvýšit množství antigenu a množství APC a stimulovat T buňky k sekreci IFN-, což přispívá ke zvýšení imunomodulační aktivity.

Různé čínské bylinné polysacharidy jsou schopny aktivovat imunitní systém a mají vynikající adjuvantní schopnosti prostřednictvím stimulace zrání DC cestou TLR4 [33,28]. Předpokládáme tedy, že TLR4 se účastní signální dráhy zrání DC indukované WPCD. Jak se očekávalo, léčba inhibitory TLR4 vedla k významnému poklesu TNF-a a IL-12. Kromě toho inhibice dráhy TLR4 také bránila expresi CD 40 a CD80 na DC, což ukazuje, že zrání DC bylo závislé na TLR4. Proto je zřejmé, že TLR4 se účastní zrání DC indukované WPCD.

Optimální dávka adjuvans a formulace vakcíny je empiricky stanovena v mnoha experimentech. Abychom prozkoumali vztah mezi dávkou a odezvou adjuvans WPCD a antigenů OVA u myší, vybrali jsme různé dávky WPCD na základě dříve hlášených údajů z BM-DCs in vitro pro subkutánní podání myší ICR dvakrát. Zjistili jsme, že WPCD významně zvýšil výtěžek OVA-specifických protilátek a vyvolal vyváženou Th1/Th2 imunitní odpověď se zvýšením hladin IgG1 a IgG2a. Zejména hladina IgG2a byla vyšší než hladina ošetřená kamencem v optimální dávce. Proto WPCD vedla k vyšším hladinám specifických protilátek a vyšší účinnosti s nižšími injekcemi.

Nové vakcíny vyžadují indukci silných buněčných odpovědí, které zahrnují protilátky, T pomocné (Th) buňky a cytotoxické T lymfocyty (CTL). Terapeutická vakcína má za cíl vyvolat silnější reakce T-buněk. Ideální adjuvans zvyšuje účinnost vakcíny a podporuje buněčně zprostředkovanou imunitu bez toxických účinků [34]. Mezi pozorováními na modelech imunizovaných myší vedl WPCD ke zvýšení OVA-specifické a nespecifické proliferace splenocytů ve srovnání s Alum. Některá adjuvans up-regulují cytokiny a imunitní systém. Saponiny mohou například stimulovat buňkami zprostředkované imunitní reakce na antigen, který normálně indukuje pouze protilátky. Vybrali jsme IL-4 a IFN- jako indikátory pro nepřímé hodnocení úrovní imunity u myší. WPCD by mohl indukovat více sekrecí IL-4 a IFN- než kamenec. V důsledku očkování WPCD byly tedy pozorovány silné odpovědi pomocných T-buněk a sekrece cytokinů, což naznačuje, že WPCD by mohla účinněji stimulovat lymfocyty k sekreci cytokinu typu Th1- a cytokinu typu Th{13}} než Kamenec.

Adjuvancia ovlivňující prezentaci antigenu mohou ovlivnit komplexní imunitní procesy. Buňky Treg mohou modulovat odpovědi Th1 a Th2 [35]. Vhodná dávka WPCD může podporovat zrání DC u myší prostřednictvím zvýšení hladin exprese CD80 a CD40 a zesílení schopnosti prezentace antigenu OVA v časné imunitní odpovědi. Experimentální výsledky aktivace DCS a frekvence Treg ukázaly, že WPCD indukoval dozrávání DC a snížil frekvenci Treg ve slezině u myší. Tyto výsledky prokázaly, že WPCD zvýšilo účinnost OVA vakcín zvýšením cílení na buňky prezentující antigen a podporou specifické aktivace T-buněk.

Při vývoji adjuvans je obtížné selektivně vyvolat vhodnou imunitní odpověď proti odpovídající infekci. Vhodné adjuvans by mělo mít nízké vedlejší účinky a toxicitu pro lidi nebo zvířata. Proto by měla být zvážena bezpečnost WPCD, včetně okamžitých a dlouhodobých vedlejších účinků. V této studii jsme zkoumali akutní toxicitu WPCD a negativní účinek WPCD na růstovou výkonnost myší po dobu 110 dnů. Výsledky akutní toxicity WPCD ukázaly, že tělesná hmotnost, index brzlíku nebo index sleziny neměly žádný významný rozdíl. Hodnota LD50 WPCD byla více než 5000 mg na kg tělesné hmotnosti. Během experimentálního následného pozorování myší nebyly zjištěny žádné vedlejší účinky nebo abnormální chování u myší. Tyto výsledky ukázaly, že WPCD je bezpečný.

Závěrem lze říci, že v této studii WPCD, surový polysacharid extrahovaný z C. deserticola ze Xinjiangu, vykazoval některé vlastnosti adjuvans. Například WPCD zesílil Th1 i Th2 reakce aktivací DC, zvýšením protilátkových reakcí, zlepšením produkce cytokinů. Kromě toho jsme zkoumali mechanismus účinnosti WPCD analýzou zrání a funkce DCs prostřednictvím dráhy TLR4 in vitro. U myší léčených pouze WPCD nebyl pozorován žádný zjevný vedlejší účinek. WPCD tedy měla vyšší imunostimulační aktivitu v buněčných a humorálních imunitních odpovědích. Adjuvancia jsou směsí několika sloučenin. Směs několika surových extraktů může mít větší příznivé účinky než jeden rostlinný extrakt. Je nutné systematicky zkoumat WPCD extrakty, testovat jejich účinnost a bezpečnost a objasňovat mechanismy jejich účinků.

Podpůrné informace

Soubor S1. PŘÍSTUP Kontrolní seznam. (DOCX)

Poděkování

Se zvláštním poděkováním Bing Wangovi a Daocheng Wu za poskytnutí dobrých nápadů při experimentech.

Autorské příspěvky

Konceptualizace: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Kurátor dat: Xiumei Yang, Yu Yang. Formální analýza: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Akvizice financování: Ailian Zhang. Administrace projektu: Ailian Zhang.

Zdroje: Ailian Zhang, Gan Zhao. Psaní – původní návrh: Ailian Zhang.

Psaní – recenze a úpravy: Ailian Zhang, Daocheng Wu.