Identifikace a funkční analýza bifavonu jako nového inhibitoru přechodného receptorového potenciálu vaniloidních 4-dependentních aterogenních procesů
Feb 22, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comvědět víc
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman
Ateroskleróza, progresivní zánětlivé onemocnění velkých tepen, představuje hlavní přispěvatel k rostoucí zátěži úmrtností a morbiditou související s kardiovaskulárními chorobami v celosvětovém měřítku1. Hlavní iniciační událost, která vede k ateroskleróze, zahrnuje retenci modifikovaných částic lipoproteinu s nízkou hustotou (oxLDL) v subendoteliálních aortálních intimálních prostorech primárně v bodech arteriálních větví2. Během časné aterogeneze, po endoteliální dysfunkci, cirkulující krevní monocyty transmigrují do oblastí intimy a diferencují se na tkáňové makrofágy3. V intimálních prostorech aorty vytváří vazba a vychytávání oxLDL makrofágy za pomoci scavengerových receptorů, jako jsou SRA a CD36, dopřednou atero-zánětlivou smyčku, která vede k rozvoji pěnových buněk nasycených lipidy, což je kritický proces při ateroskleróze2–8. Kaskády zánětlivých jevů vyvolaných pěnovými buňkami vedou k vytvoření časného tukového pruhu a nakonec ke vzniku pokročilých lézí aterosklerózy charakterizovaných přítomností vazivového uzávěru, kalcifikované tkáně, imunitních buněk, matrixových proteinů a lipidů2–10. Potenciál přechodného receptoru Vanilloid 4 (TRPV4) podrodiny TRPV, neselektivní, polymodální kationtový kanál propustný pro Ca2 plus, je všudypřítomně exprimován v různých typech buněk včetně makrofágů11–24. TRPV4, dříve známý jako osmosensor, je nyní známý tím, že reaguje na různé biochemické a biomechanické stimuly včetně tepla, tuhosti matrice, osmolarity, růstových faktorů, pH a 4 forbolových esterů11–24. Uvádí se, že TRPV4 zprostředkovává několik fyziologických funkcí, jako je pocit bolesti při zánětu a neuropatiích18,22,23, diferenciace a migrace myofibroblastů17,25,26 a diferenciace osteoklastů v kosti27. Mutace TRPV4 byly spojeny s několika kanálopatiemi28–31. Nedávné studie naší skupiny a dalších ukázaly možnou roli tohoto kanálu v nesčetných patologických stavech, jako jsou poranění plic22,32, tvorba pěnových buněk14,16, tkáňová fbróza17,33, reakce na cizí těleso13 a rakovina34,35. Dříve byla ukázána ateroprotektivní role TRPV4, kdy se ukázalo, že funkce TRPV4 indukovaná chemickými agonisty v endoteliálních buňkách je spojena s aktivací eNOS a inhibicí adheze monocytů na endoteliální buňky36. Naproti tomu nedostatky ve funkcích TRPV4 byly spojeny s četnými ateroinfammativními reakcemi včetně endoteliální dysfunkce, snížené tvorby pěnových buněk makrofágů a vaskulárních onemocnění14,16,37–39. Naše laboratoř nedávno identifikovala proaterogenní roli TRPV4, přičemž reguluje tvorbu pěnových buněk makrofágů indukovanou oxLDL. Mechanicky jsme ukázali, že TRPV4 ovlivňuje vychytávání, ale nikoli vazbu oxLDL v makrofázích CD36-nezávislým způsobem14. V jiné studii jsme zaznamenali exacerbaci tvorby pěnových buněk indukovanou oxLDL v přítomnosti lipopolysacharidu a zvyšující se tuhost matrice závislou na TRPV, což poskytuje spojení mezi mechanosensingem a rizikem aterosklerózy16. Všechny tyto nálezy naznačují, že TRPV4 je atraktivním cílem při ateroskleróze a dalších onemocněních, čímž podněcuje objev inhibitorů TRPV4 s malou molekulou, které lze převést na klinicky účinná terapeutika. Použití přírodních sloučenin v terapeutikách získalo na důležitosti, primárně poháněné potřebou nákladově efektivních a biokompatibilních sloučenin ve srovnání se v současnosti existujícími syntetickými léčivy. Přírodní sloučeniny jako napřflavonoidy, alkaloidy,polyfenolya kurkuminoidy ovlivňují kardiovaskulární onemocnění prostřednictvím různých mechanismů, jako je inhibiceprozánětlivésignály, inzulinovou senzibilizaci a zlepšení krevních lipidových profilů cílením na dráhy AMPK, COX1/2, eNOS a Nrf240–45. Nedávné studie provedené mnoha skupinami identifikovaly dva flavonoidy, berberin a apigenin, jako potenciální modulátory aktivity TRPV446,47. Vyvinuli jsme a použili semi-vysokopropustnou screeningovou metodu k identifikaci potenciálních antagonistů TRPV4 z knihovny přírodních sloučenin pomocí Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) na bázi Ca2 plus influx testu. Zde uvádíme identifikaci a funkční analýzu Linkedinu, flavonu, jako nového inhibitoru TRPV4-závislých aterogenních procesů v makrofázích, čímž položíme základ pro další studie této přírodní sloučeniny jako přírodního antiaterosklerotického malého molekulová sloučenina. Bylo hlášeno, že Linkedin vykazuje neuroprotektivní,antikarcinogenní, aprotizánětlivérole48,49. Uvádíme mechanismus účinku Linkedinu proti TRPV4 v nastavení tvorby pěnových buněk makrofágů pomocí četných biochemických a buněčných testů.
Materiály a metody Živočišné a buněčné kultury
Zakoupili jsme kongenní myši C57BL/6 divokého typu (WT) od Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). U všech pokusů na zvířatech byly dodrženy pokyny Výboru pro péči a použití zvířat University of Maryland a autoři dodrželi pokyny ARRIVE. Pro izolaci thioglykolátem indukovaných myších rezidentních makrofágů (MRM) byl po 4 dnech intraperitoneální injekce thioglykolátu odebrán peritoneální výplach a buňky byly udržovány v 10% fetálním bovinním séru (FBS) obsahujícím DMEM7,14,16. Buněčná linie myších makrofágů (RAW264.7) a lidské dermální fibroblasty (HDF) byly zakoupeny od ATCC (Manassas, VA) a byly kultivovány s DMEM nebo MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofágy odvozené z myší kostní dřeně (BMDM) byly sklizeny od 6- do 7-týdenních myší, jak bylo popsáno dříve14,50,51. Stručně řečeno, byly odebrány stehenní kosti z myší WT a TRPV4 KO a kostní dřeň stehenních kostí byla propláchnuta kompletním médiem DMEM s 10 procenty FBS. Suspendované buňky kostní dřeně byly filtrovány přes 70 um sítko (BD bioscience), centrifugovány a udržovány v DMEM médiu doplněném M-CSF (25 ng/ml) po dobu 7–8 dnů při 37 stupních, aby se umožnila diferenciace na makrofágy.
Reagencie
Linkedin a GSK1016790A (GSK101) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a testovací souprava FLIPR Calcium 6 byla získána od Molecular Device (Sunnyvale, CA). Lidský nativní LDL (VLDL) byl zakoupen od Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). LDL jsme inkubovali s 5 uM CuSO4 po dobu 12 hodin při 37 stupních, abychom připravili mědí oxidovaný LDL (oxLDL)7,14,16. Fluorescenčním barvivem značený DiI-oxLDL byl zakoupen od Invitrogen (Carlsbad, CA) a MCSF od R&D (Minneapolis, MN). Protilátky pro analýzu FACS byly: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 a TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugované sekundární protilátky byly od R&D (Minneapolis, MN) a PE-konjugované izotypové kontroly byly od BD (Franklin Lake, NJ). Pro kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci (qRT-PCR) jsme použili soupravu RNeasy od QIAGEN (Redwood City, CA). Všechny primery byly zakoupeny od Bio-Rad (Hercules, CA). Média pro buněčnou kulturu, produkty související s buněčnými kulturami a činidla Western blot byly získány od Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche proti únavě
Polovysoká propustnost screeningu
Provedli jsme semi-vysokopropustný screening na antagonisty Trpv4 z knihovny 2000 přírodních sloučenin (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) pomocí fluorometrického imaging plate reader (FLIPR) na základě testu přítoku vápníku14,17. Identifikovali jsme ginkgetin (GGT) jako nového antagonistu TRPV4. Primární a sekundární screening byl proveden pomocí RAW264.7, HDF a BMDM, aby se vyhodnotila schopnost Linkedinu a dalších kandidátů inhibovat TRPV{10}}vyvolaný Ca2 plus infux14,17. Jako kontroly jsme použili A23187, kalciový ionofor, TRPV4 nulové BMDM a GSK219, selektivní antagonistu TRPV417. Po sekundárním screeningu jsme identifikovali šest sloučenin vykazujících více než trojnásobnou inhibici TRPV4-zprostředkovaného přílivu Ca2 plus ve srovnání s kontrolou vehikulem. Linkedin byl identifikován jako nejúčinnější inhibitor aktivity TRPV4. BMDM (5 x 104 buněk/jamku) byly nasazeny na kolagenem potažené (10 ug/ml) 96-jamkové černé destičky s průhledným dnem a inkubovány při 37 stupních, 5 procent CO2. V den experimentu byly buňky naplněny barvivem vápníkem 6 v HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecidu a inkubovány po dobu 45 minut při 37 stupních. Po inkubaci byly do každé jamky přidány sloučeniny knihovny do konečné koncentrace 2 uM. Destičky byly inkubovány dalších 45 minut při 37 stupních. Příliv Ca2 plus byl indukován přidáním 10 nM TRPV4 agonisty GSK1016790A do buněk předem ošetřených vehikulem nebo sloučeninou a zaznamenán měřením AF/F (Max-Min), jak bylo popsáno dříve17. Data jsou uvedena jako relativní fluorescenční jednotky (RFU).
Imunobloty
Thioglykolátem vyvolané peritoneální makrofágy byly nasazeny do 10% FBS obsahujícího DMEM a inkubovány přes noc. Nepřichycené buňky byly promyty a na destičku bylo přidáno 1 procento bovinního sérového albuminu (BSA) obsahující DMEM a inkubováno po dobu 3 hodin před ošetřením Linkedinem. Pro stanovení exprese CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 a GAPDH proteiny byly připraveny lyzáty celých buněk z buněk ošetřených přes noc Linkedinem (1 a 5 uM) nebo vehikulem v přítomnosti nebo nepřítomnosti oxLDL (25 ug/ml ). Pro stanovení hladin exprese LPS-spouštěných p-JNK a JNK byly buňky předem ošetřeny Linkedinem (5 a 10 uM) po dobu 3 hodin a poté stimulovány E. coli LPS po dobu 30 minut. Celobuněčné lyzáty byly připraveny z dvakrát promytých buněk (ledově chladný PBS) za použití RIPA pufru s přidaným koktejlem inhibitoru proteázy (Thermo Scientific, MA). Bloty byly sondovány králičí anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Izrael), anti-myší CD36 (R&D, Minneapolis, MN), králičí anti-TLR4, králičí anti-TLR6, králičí anti-JNK a králičí anti-p- Primární protilátky JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) následované anti-králičími a anti-myšími HRP-konjugovanými sekundárními protilátkami (R&D, Minneapolis, MN). Bloty byly stripovány a znovu sondovány anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) pro kontrolu nanášení.
Tvorba pěnových buněk.Thioglykolátem spouštěné MRM byly naočkovány na skleněná krycí sklíčka v 12jamkové destičce s DMEM, 10% FBS a inkubovány při 37 stupních, 5% CO2 po dobu 2 hodin. K buňkám byl přidán GGT (1 nebo 10 uM) a po 3 hodinách inkubace byl přidán oxLDL (50 ug/ml) a kultury byly inkubovány přes noc při 37 stupních. Nativní LDL (50 ug/ml) byl přidán do jamek kontrolní skupiny a inkubován přes noc. Buňky byly fixovány ve 4% paraformaldehydu s následným barvením Oil Red O pro kvantifikaci tvorby pěnových buněk.
Adenovirová vektorová transdukce.Shromáždili jsme adenovirové konstrukty pro expresi Ad(RGD)-myší TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) a adenovirový prázdný vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), z Vector Biolabs, Malvern, PA. Pro všechny experimenty jsme použili 1× 108 pfu/ml. Pro studie tvorby pěnových buněk byly myší peritoneální makrofágy inkubovány s Ade-TRPV4 nebo Ade-Vec v médiu DMEM po dobu 72 hodin před přidáním oxLDL, aby se vytvořily makrofágové pěnové buňky.
Vazba a příjem ox-LDL.Pro posouzení vazby byly peritoneální makrofágy ošetřeny dvěma dávkami (1 nebo 10 uM) Linkedinu nebo vehikula po dobu 3 hodin a inkubovány s DiI-oxLDL při 4 stupních po dobu jedné hodiny. Po předběžném ošetření Linkedinem nebo vehikulem byly buňky inkubovány s DiI-oxLDL při 37 stupních po dobu 30 minut, aby se vyhodnotil příjem. Snímky byly zachyceny fluorescenční mikroskopií (63x) a Snímek J byl použit ke kvantifikaci výsledků.
Analýza průtokovou cytometrií.Thioglykolátem vyvolané peritoneální makrofágy byly kultivovány v DMEM, 10% FBS po dobu 24 hodin. Nepřichycené buňky byly odmyty, bylo přidáno médium bez séra a buňky byly inkubovány po dobu 2 hodin, následovalo přidání 5 uM GGT nebo vehikula a inkubace pokračovala po dobu 3 hodin. Ošetřené buňky byly seškrábnuty z destičky a resuspendovány v PBS, 2% BSA. Buňky byly inkubovány s primárními protilátkami po dobu 45 minut a následně 30 minut inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s PE. K získání dat byl použit průtokový cytometr FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Kanada). Všechna data byla zpracována pomocí softwaru FlowJo.
qRT-PCR.Thioglykolátem indukované makrofágy byly ošetřeny 5 uM Linkedinem nebo vehikulem po dobu 3 hodin; K buňkám ošetřeným vehikulem nebo Linkedinem bylo přidáno 25 ug/ml oxLDL a inkubace pokračovala přes noc. K extrakci celkové RNA byla použita sada RNeasy Micro Kit (#74 004) od QIAGEN a k reverzní transkripci RNA byla použita sada Universal SYBR Green One-Step Kit od Bio-Rad. K získání dat byl použit C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Exprese genu byla stanovena jako množství genově specifické mRNA vzhledem k mRNA GAPDH pomocí srovnávací CT metody popsané v uživatelském bulletinu systému Bio-Rad qRT-PCR.
Statistická analýza.Data jsou prezentována jako průměr ± SEM biologických triplikátů. Byl použit software GraphPad Prism 7.{1}} a výpočty byly provedeny pomocí Studentova t-testu pro dvě skupiny nebo jednosměrné ANOVA pro více skupin.
Etické schválení.Všechny experimenty na myších byly prováděny v souladu s pokyny Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) a byly schváleny Revizním výborem University of Maryland‐College Park.
Výsledek in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>trojnásobný; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Obrázek 1. Identifikace Linkedinu jako nového inhibitoru TRPV4 z knihovny přírodních sloučenin založená na polovysokovýkonném screeningu. (A) Vývojový diagram ukazující pracovní postup vedoucí k identifikaci ginkgetinu jako potenciálního inhibitoru TRPV4 z knihovny 2000 přírodních sloučenin. (B) Reprezentativní záznam FlexStation 3 ukazující inhibiční účinek 6 přírodních sloučenin na agonistou TRPV4 (GSK1016790A) indukovaný Ca2 plus influx v BMDM s obsahem vápníku 6 během sekundárního screeningu. Předběžné ošetření všemi 6 sloučeninami vykazovalo inhibiční účinky na TRPV4-závislý přítok Ca2 plus ve srovnání s buňkami předem ošetřenými vehikulem (negativní kontrola; vehikulum plus GSK1016790A (10 nM)) nebo ionoforem vápníku (A23187, 2 μM). Použili jsme selektivního antagonistu TRPV4, GSK2193874 (10 nM), jako negativní kontrolu. Všechny experimenty byly opakovány třikrát ve čtyřech opakováních. RFU: jednotka relativní fluorescence.
Inhibice TRPV4 pomocí GGT ruší tvorbu pěnových buněk makrofágů indukovanou oxLDL.Naše předchozí studie ukázaly, že TRPV4-vyvolaný přítok Ca2 plus se podílí na tvorbě pěnových buněk zprostředkovaných oxLDL 14,16. Proto jsme hodnotili možnost, že tvorba pěnových buněk byla inhibována antagonizací aktivity TRPV4 zprostředkovanou GGT. Myší peritoneální makrofágy divokého typu byly inkubovány s oxLDL pro indukci tvorby pěnových buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti GGT a analyzovány barvením Oil Red O. Jak se očekávalo, zjistili jsme, že tvorba pěnových buněk se u makrofágů ošetřených oxLDL zvýšila pětinásobně ve srovnání s nativním LDL (obr. 2A, B). Nicméně ošetření makrofágů GGT (1 nebo 10 uM) před stimulací oxLDL významně snížilo procento pěnových buněk (obr. 2A, B). Souhrnně tato zjištění naznačují inhibiční účinek GGT na tvorbu pěnových buněk makrofágů, které pravděpodobně cílí na TRPV4-vyvolaný příliv Ca2 plus. Dále jsme nadměrně exprimovali TRPV4 v makrofázích bez TRPV4 pomocí adenovirového konstruktu a poté jsme indukovali tvorbu pěnových buněk pomocí oxLDL v přítomnosti GGT. Zjistili jsme, že nadměrná exprese TRPV4 zvýšila tvorbu pěnových buněk, která byla blokována, když jsme buňku předem ošetřili GGT, což naznačuje, že inhibice tvorby proaterogenních pěnových buněk pomocí GGT je závislá na TRPV4 (obr. 2C, D).
GGT neblokuje bazální hladinu exprese TRPV4 a zánětlivých receptorů.Scavenger receptor CD36 hraje hlavní roli při vychytávání a vazbě oxLDL a tvorbě pěnových buněk, kritických procesech při ateroskleróze4–7,54,55. V poslední době narůstající množství důkazů naznačuje účast receptorů podobných toll v ateroskleróze2,4,56. Abychom zjistili, zda GGT blokuje tvorbu pěnových buněk prostřednictvím ovlivnění exprese CD36, TLR4, TLR6 a TRPV4, provedli jsme imunoblotovou analýzu při dvou koncentracích GGT (1 nebo 5 uM). Našli jsme podobné úrovně exprese CD36, TRPV4, TLR6 a TLR4 ve srovnání s neošetřenou kontrolou (obr. 3A–D). Analýza průtokovou cytometrií také neodhalila žádný významný rozdíl v expresi proteinů na buněčném povrchu s nebo bez ošetření GGT (obr. 3E–H, I–L). Když vezmeme v úvahu všechny dohromady, tyto výsledky naznačují, že GGT blokuje tvorbu pěnových buněk makrofágů bez inhibice bazálních hladin povrchové exprese TRPV4, CD36, TLR4 a TLR6.
Obrázek 2. Inhibice TRPV4 pomocí Linkedinu ruší tvorbu pěnových buněk makrofágů indukovanou oxLDL. (A) Thioglykolátem indukované myší peritoneální makrofágy byly ošetřeny přes noc 50 ug/ml oxLDL, následovala 3 h preinkubace s vehikulem nebo 1 nebo 10 uM Linkedinem. Buňky byly ošetřeny 50 ug/ml nativního LDL (VLDL) jako kontrola. Původní zvětšení: 40x. (B) Kvantifikace výsledků je uvedena v (A). n =500 buněk/podmínka. Studentův t-test; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Vychytávání oxLDL, ale nevázající se makrofágy je potlačeno GGT. Protože se již dříve ukázalo, že TRPV4 hraje roli při vychytávání oxLDL a tvorbě pěnových buněk14,16, hodnotili jsme, zda léčba GGT způsobila zhoršení vazby oxLDL na povrch makrofágů. Peritoneální makrofágy WT byly ošetřeny GGT před inkubací s DiI-oxLDL při 4 stupních a byla hodnocena vazba. Výsledky naznačují, že vazba oxLDL na povrch makrofágů nebyla významně ovlivněna ošetřením GGT (1 nebo 10 µM) ve srovnání s kontrolou s vehikulem (obr. 5A–C). Poté, co jsme zjistili, že GGT neinhibuje vazbu oxLDL, jsme se dále zaměřili na určení, zda vychytávání oxLDL v makrofázích bylo narušeno léčbou GGT. Je zajímavé, že naše výsledky ukázaly, že došlo k významné inhibici vychytávání oxLDL v makrofázích v buňkách předem ošetřených GGT ve srovnání se skupinou ošetřenou vehikulem (obr. 6A, B). Když vezmeme v úvahu všechny dohromady, tyto výsledky naznačují, že GGT blokuje vychytávání oxLDL, ale neváže se v makrofázích.
GGT blokuje expresi TRPV4 v makrofázích indukovanou oxLDL.
Protože naše dříve publikované studie ukázaly, že TRPV4-vyvolaný Ca2 plus hraje roli při tvorbě pěnových buněk makrofágů zprostředkovaných oxLDL14,16, snažili jsme se zjistit, zda GGT blokuje tvorbu pěnových buněk prostřednictvím suprese oxLDL-indukované exprese CD36, TLR2, TLR4, TLR6 nebo TRPV4. Zjistili jsme, že noční stimulace makrofágů pomocí oxLDL vedla k významné upregulaci exprese proteinů TRPV4 ve srovnání s LDL, zatímco exprese ostatních receptorů (CD36, TLR2, TLR4 a TLR6) zůstala nezměněna (obr. 4A–F). Předběžné ošetření buněk GGT před stimulací oxLDL selektivně snížilo hladinu exprese proteinů TRPV4 ve srovnání s ošetřením vehikulem (obr. 4A–F). Souhrnně tato zjištění naznačují inhibiční účinek GGT na expresi proteinu TRPV4, který se může částečně podílet na potlačení tvorby pěnových buněk pomocí GGT.
Obrázek 3. Ošetření linkedinem nemění celkovou proteinovou nebo povrchovou expresi TRPV4, CD36 a TLR v makrofázích. (A–D) Imunobloty lyzátů celých buněk makrofágů po ošetření přes noc 1 nebo 5 uM Linkedinu nebo vehikula. Reprezentativní imunobloty ukazují celkovou proteinovou expresi CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) a TLR4 (D) v buňkách ošetřených Linkedinem a neošetřených buňkách. Pro každou sadu experimentů byly provedeny tři nezávislé biologické replikáty a 3 experimentální opakování. (E–H) Průtoková cytometrická analýza makrofágů ošetřených přes noc 5 µM Linkedinem nebo neošetřených ukazující povrchovou expresi TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) a TLR6 (G) v neošetřených a Linkedinem ošetřených buňkách. Byly analyzovány tři nezávislé biologické replikáty a 30000 buněk na stav. (I–L) Kvantitativní analýza výsledků z (E–H). Analyzováno dvoustranným t-testem s 99procentním intervalem spolehlivosti. Počet buněk za experiment, 30,000; dvě experimentální opakování.
GGT blokuje proaterogenní aktivaci JNK2 a zánět v makrofázích. Publikované zprávy z naší laboratoře a dalších ukázaly, že aktivace JNK2 hraje kritickou roli při tvorbě pěnových buněk a ateroskleróze7,57. Aby se určilo, zda GGT může inhibovat aktivaci JNK1/2, byly makrofágy ošetřeny GGT následovanou stimulací LPS nebo oxLDL. Výsledky z imunoblotové analýzy ukázaly, že léčba GGT významně potlačila fosforylaci JNK1/2 indukovanou oxLDL nebo LPS ve srovnání s neošetřenou nebo nativní kontrolou ošetřenou LDL (obr. 7A–D). Bylo prokázáno, že aktivace JNK v makrofázích indukuje transkripci prozánětlivých mediátorů spojených s aterosklerózou58–60. Aby se určilo, zda by GGT mohla potenciálně blokovat expresi těchto prozánětlivých regulátorů v makrofázích, byly buňky předem ošetřené GGT stimulovány oxLDL a hladiny exprese mRNA TNF, IL6, IL12, IL1 a MCP1 byly kvantifikovány analýzou qRT-PCR. Zjistili jsme signifcant downregulation v oxLDL-indukované úrovně exprese TNF, IL12, IL1, a MCP1 mRNA v GGT-ošetřených buněk ve srovnání s vehikulem ošetřené kontroly (obr. 7E-I). Dohromady tyto výsledky naznačují, že GGT blokuje proaterogenní aktivaci JNK2 a expresi zánětlivého genu v reakci na stimulaci oxLDL v makrofázích. Diskuse O přírodních sloučeninách, jako jsou flavonoidy a polyfenoly, je známo, že modulují kardiovaskulární reakce prostřednictvím různých mechanismů, jako je inhibice prozánětlivých signálů, senzibilizace na inzulín, oxidační stav a zlepšení profilů krevních lipidů40–45. Zde popisujeme semi-vysokopropustnou identifikaci a funkční charakterizaci Linkedinu, flavonu, jako nového inhibitoru proterogenních/zánětlivých procesů závislých na TRPV4- v makrofázích. Konkrétně jsme ukázali, že i) ginkgetin blokuje TRPV4-zprostředkovaný přítok Ca2 plus do makrofágů, ii) ginkgetinová blokáda funkce TRPV4 výrazně snížila tvorbu pěnových buněk indukovanou oxLDL potlačením vychytávání oxLDL v makrofázích a iii) ginkgetin blokuje LPS- a oxLDL-indukovaná fosforylace JNK1/2, exprese proteinů TRPV4 a exprese zánětlivých genů. Výsledky naší studie v souhrnu ukázaly, že ginkgetin inhibuje proaterogenní/zánětlivou funkci makrofágů v závislosti na TRPV4-. Ateroskleróza, onemocnění aorty, je zpočátku podporována zánětem a překrvením makrofágů oxLDL, což vyvolává tvorbu pěnových buněk makrofágů, které následně progredují do ateromu2–10. Protože tvorba pěnových buněk je kritickým procesem v aterogenezi, pochopení a manipulace s tvorbou pěnových buněk může mít terapeutický potenciál. Je známo, že makrofágy exprimují řadu membránou penetrujících iontových kanálů a pump, včetně TRPV4, mechanosenzitivního polymodálního Ca2 plus permeabilního iontového kanálu, který je aktivován jak fyzikálními, tak biochemickými stimuly11–24. Publikované studie naší laboratoře a dalších identifikovaly roli TRPV4 při zánětu makrofágů a tvorbě pěnových buněk vyvolaných oxLDL14–16,26. TRPV4 tak může sloužit jako životaschopný cíl pro útlum proaterogenních procesů.
Obrázek 5. Linkedin nepotlačuje vazbu DiI-oxLDL na makrofágy. Makrofágy byly předem ošetřeny vehikulem nebo Linkedinem (1 nebo 10 uM) po dobu 3 hodin, poté následovala inkubace s DiI-značeným oxLDL (2,5 ug/ml) po dobu 1 hodiny při 4 stupních. (A) Reprezentativní fluorescenční mikroskopické snímky (původní zvětšení, 63×) vazby DiI-oxLDL na povrch membrány makrofágů (n=20 buněk/stav). (B) Výsledky z experimentu A zobrazené jako profil grafu pomocí softwaru NIH ImageJ. (C) Kvantitativní analýza výsledků z A. n=20 buněk/stav. při zlepšování aterosklerózy snížením MMP-2 a MMP-9 a zvýšením hladin NO a NOS v hrudních aortách potkana52. V této studii jsme ukázali, že ginkgetin blokuje TRPV4-vyvolaný příliv Ca2 plus v makrofázích. Mechanicky jsme ukázali, že ginkgetin blokuje vychytávání oxLDL, ale neváže se v makrofázích. Studie provedené in vivo a in vitro naznačily kritickou roli CD36 jako hlavního scavengerového receptoru při vychytávání oxLDL a tvorbě pěnových buněk makrofágů2–7. Ukázalo se, že myši s nulovým CD36, které postrádají ApoE nebo LDLR, jsou méně náchylné k rozvoji aterosklerotických lézí5,6. Předchozí studie naší skupiny identifikovaly zásadní roli signální kaskády CD36-JNK při tvorbě pěnových buněk makrofágů7. Toll-like receptory TLR2, TLR4 a TLR6 působí jako koreceptory interakcí s CD36 a bylo prokázáno, že se podílejí na aterogenezi2,56,63. Zkoumali jsme možnost, že nedostatek tvorby pěnových buněk pozorovaný u makrofágů ošetřených Linkedinem byl způsoben sníženou expresí proteinů CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 nebo TLR6. Je zajímavé, že léčba Linkedinem významně nesnížila expresi CD36, TLR2, TLR4 nebo TLR6 proteinů na bazálních hladinách nebo za podmínek stimulovaných oxLDL. Linkedin však specificky blokoval oxLDL-indukovanou upregulaci exprese TRPV4 proteinů, zatímco jeho exprese na bazálních hladinách zůstala nezměněna. Všechny tyto výsledky naznačují, že ginkgetin blokuje tvorbu pěnových buněk indukovanou oxLDL mechanismem nezávislým na expresi CD36 a TLR, ale závislým na TRPV4. Předchozí studie z naší skupiny a dalších ukázaly, že aktivace JNK2 se podílí na tvorbě pěnových buněk a rozvoji aterosklerotických lézí7,57. Bylo také uvedeno, že JNK se podílí na modulaci MMP-9 a MMP-13, které jsou nadměrně exprimovány v aterosklerotických lézích64–68. Vzhledem k uznávané vazbě JNK v aterogenních procesech jsme chtěli zjistit, zda by ginkgetin mohl inhibovat aktivaci JNK. V souladu s předchozími zprávami naše výsledky také ukázaly, že ginkgetin blokuje fosforylaci JNK2 v makrofázích indukovanou zánětlivými stimuly. Tento výsledek naznačuje možný mechanismus, kterým Linkedin blokuje tvorbu pěnových buněk. Dále jsme zjistili významnou downregulaci v oxLDL-indukované expresi TNF, IL12, IL1 a MCP1 mRNA v buňkách ošetřených ginkgetinem ve srovnání s kontrolou vehikulem, což zdůrazňuje potenciální protizánětlivé role ginkgetinu v reakci na oxLDL. V souhrnu naše výsledky ukázaly, že ginkgetin inhibuje proaterogenní a zánětlivou funkci makrofágů v závislosti na TRPV4-. Tato zjištění tak posilují zdůvodnění pro použití přírodních sloučenin při vývoji potenciálních léčiv a/nebo chemopreventivních činidel.
Reference
1. Barquera, S. a kol. Globální přehled epidemiologie aterosklerotických kardiovaskulárních onemocnění. Oblouk. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Buněčná biologie makrofágů u aterosklerózy. Cell 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Zánět při ateroskleróze. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokiny, metabolismus lipidů makrofágů a pěnové buňky: důsledky pro terapii kardiovaskulárních onemocnění. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. a kol. Cílené narušení scavengerového receptoru třídy B CD36 chrání před rozvojem aterosklerotických lézí u myší. J. Clin. Investovat. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV a kol. Scavenger receptory třídy AI/II a CD36 jsou hlavními receptory odpovědnými za příjem modifikovaného lipoproteinu s nízkou hustotou vedoucí k lipidové zátěži v makrofázích. J. Biol. Chem. 277, 49982-49988 (2002).
7. Rahaman, SO a kol. Pro tvorbu pěnových buněk makrofágů je nezbytná CD36-závislá signální kaskáda. Cell Metab. 4, 211-221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleróza-zánětlivé onemocnění. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te molekulární mechanismy trombotických komplikací aterosklerózy. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleróza. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD a kol. Ultra rychlá aktivace iontových kanálů TRPV4 mechanickými silami aplikovanými na buněčný povrch beta1 integrinů. Celé číslo. Biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mechanotransdukční signalizační osa v tuhosti matrice a TGF 1-indukovaném epiteliálně-mezenchymálním přechodu. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Přechodný receptorový potenciál vaniloid 4 je nutný pro reakci na cizí těleso a tvorbu obrovských buněk. Dopoledne. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. a kol. Vápník propustný kanál TRPV4 je novým regulátorem tvorby pěnových buněk makrofágů indukovaných oxidovaným LDL. Volný Radic. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).
