Hyperglykémie indukuje trénovanou imunitu u makrofágů a jejich prekurzorů a podporuje aterosklerózu

POZADÍ:

Kardiovaskulární riziko u diabetu zůstává zvýšené navzdory terapiím snižujícím hladinu glukózy. Předpokládali jsme, že hyperglykémie indukuje trénovanou imunitu v makrofázích a podporuje přetrvávající proaterogenní vlastnosti.

Kromě toho jsme se v různých druzích literatury také dozvěděli, že rostlina jménem Cistanche má skvělý vliv na zlepšení imunity. Cistanche je tradiční čínská medicína se širokou škálou imunitních regulačních funkcí. Uvolnění faktorů, zlepšení funkce imunitních orgánů a další způsoby posílení obranyschopnosti lidského těla. Proto v každodenním životě mohou lidé posílit svou imunitu tím, že jedí Cistanche deserticola s mírou, k prevenci a léčbě různých onemocnění.

Klikněte na doplňkový produkt cistanche deserticola

METODY:

Makrofágy pocházející z kostní dřeně od kontrolních myší a myší s diabetem byly pěstovány ve fyziologické glukóze (5 mmol/l) a podrobeny sekvenování RNA (n=6), testu na sekvenování chromatinu dostupného transpozázou (n=6 ) a chromatinové imunoprecipitační sekvenování (n=6) pro stanovení trénované imunity vyvolané hyperglykémií. Transplantace kostní dřeně z myší s (n=9) nebo bez (n=6) diabetem do (normoglykemických) Ldlr −/− myší byla použita k posouzení jeho funkčního významu in vivo. Důkazy trénované imunity vyvolané hyperglykémií byly hledány v lidských mononukleárních buňkách periferní krve pacientů s diabetem (n=8) ​​ve srovnání s kontrolními subjekty (n=16) a v makrofázích lidského aterosklerotického plátu vyříznutých mikrodisekcí laserového záchytu .

VÝSLEDEK:

V makrofázích vysoká extracelulární glukóza podporovala expresi prozánětlivých genů a proaterogenní funkční charakteristiky prostřednictvím mechanismů závislých na glykolýze. Makrofágy pocházející z kostní dřeně z diabetických myší si zachovaly tyto vlastnosti, i když byly kultivovány ve fyziologické glukóze, což ukazuje na trénovanou imunitu vyvolanou hyperglykémií. Transplantace kostní dřeně z diabetických myší do (normoglykemických) Ldlr −/− myší zvýšila aterosklerózu kořenů aorty, což potvrzuje pro nemoc relevantní a přetrvávající formu trénované vrozené imunity. Integrovaný test chromatinu přístupného transpozáze, imunoprecipitace chromatinu a analýzy sekvenování RNA hematopoetických kmenových buněk a makrofágů odvozených z kostní dřeně odhalily prozánětlivý primární účinek u diabetu. Vzor otevřeného chromatinu implikoval transkripční faktor Runt-příbuzný transkripční faktor 1 (Runx1). Podobně byly transkriptomy makrofágů aterosklerotického plaku a periferních leukocytů u pacientů s diabetem 2. typu obohaceny o cíle Runx1, což je v souladu s potenciální úlohou v lidském onemocnění. Farmakologická inhibice Runx1 in vitro inhibovala trénovaný fenotyp.

ZÁVĚRY:

Trénovaná imunita vyvolaná hyperglykémií může vysvětlit, proč cílení na zvýšenou hladinu glukózy je neúčinné při snižování makrovaskulárního rizika u diabetu, a navrhuje nové cíle pro prevenci a terapii onemocnění.

klíčová slova:

diabetes mellitus ◼ epigenetika ◼ glukóza ◼ zánět ◼ makrofágy

Diabetes je spojen s vysokým rizikem aterosklerózy a jejích komplikací, včetně infarktu myokardu.1 Hyperglykémie je zásadním rysem u diabetu 1. i 2. typu a léčba se zaměřuje převážně na snižování hladiny glukózy v krvi. Intenzivní terapie snižující hladinu glukózy je účinná při snižování vaskulárního rizika u pacientů s diabetem 1. typu, ale účinek je odložen o několik let2 a dočasně odpojen od kontroly hladiny glukózy v krvi.3 U diabetu 2. typu se snížení glukózy neprokázalo buď žádným, nebo mírný účinek na vaskulární výsledky související s aterosklerózou, jako je akutní infarkt myokardu.4–6 Přetrvávající riziko kardiovaskulárních komplikací, dokonce i po snížení glukózy, bylo nazýváno efektem dědictví nebo metabolickou pamětí4,7, ale základní mechanismy zůstávají nejasné.

Ateroskleróza je chronické zánětlivé onemocnění charakterizované ukládáním a zadržováním modifikovaných lipoproteinů a akumulací imunitních buněk ve stěnách velkých tepen. Makrofágy jsou klíčové ve všech stadiích aterosklerózy a jsou široce považovány za terapeutické cíle.8 Jsou heterogenní a funkčně reagují na mikroprostředí. Makrofágy byly rozděleny do protichůdných fenotypů, jmenovitě prozánětlivé (M1), v reakci na Toll-like receptorový ligand lipopolysacharid (LPS) a interferon- (IFN), nebo tkáňové reparativní (M2), například v reakci na interleukin (IL )-4, i když in vivo je jejich funkční rozsah nepochybně složitější.9

Hyperglykémie zhoršuje progresi aterosklerózy a zpomaluje regresi plaku,10 se zvýšenou expresí prozánětlivých genů a odolností vůči indukci exprese M2-asociovaných genů.10,11 V monocytech a makrofázích jsou buněčné energetické dráhy řízeny souhrou mezi buňkami vnitřní a environmentální stimuly, které zase výrazně ovlivňují imunitní funkce a genovou expresi.12 V reakci na IL-4 makrofágy M2 primárně metabolizují mastné kyseliny a spoléhají na oxidativní fosforylaci.13 Naproti tomu makrofágy M1 vyžadují glukózu a posun k aerobní glykolýze, podobně jako Warburgův efekt u rakoviny.14,15 Tyto metabolické změny se vyskytují jako důsledek stimulace cytokinů, ale mohou také určovat funkci makrofágů.16 Nedávné zprávy navíc naznačují, že změny v metabolismu monocytů a makrofágů , včetně aerobní glykolýzy nebo aktivace mevalonátové dráhy,17,18 indukují dlouhodobou vrozenou paměť imunitních buněk (nazývanou trénovaná imunita) prostřednictvím epigenetických modifikací a změn struktury chromatinu.19 Dlouhodobá perzistence cirkulujících trénovaných monocytů je řízena přeprogramováním jejich progenitorů kostní dřeně (BM).20

Předpokládali jsme, že trénovaná imunita v reakci na zvýšenou hladinu glukózy odpovídá za diabetickou hyperglykemickou paměť na aterosklerózu. V souladu s tím jsme se snažili zjistit, zda hyperglykémií vyvolané změny ve funkci monocytů a makrofágů jsou relevantní pro onemocnění a zda tyto změny přetrvávají po obnovení normální glukózy, což znamená zásadní přeprogramování. Kombinovali jsme studie buněčné funkce, metabolomiky, transkriptomiky a epigenomiky, abychom definovali, jak hyperglykémie mění metabolismus, aby modulovala dlouhodobou aktivaci prostřednictvím epigenetických modifikací. Zkoumali jsme, jak se tyto změny mohou objevit na úrovni hematopoetických kmenových buněk (HSC) a v diferencovaných makrofázích. Funkční význam je testován pomocí transplantace BM na myším modelu aterosklerózy a nálezy jsou potvrzeny dotazováním makrofágů extrahovaných z lidské periferní krve a aterosklerotických plaků pomocí laserové záchytné mikrodisekce (LCM). Naše zjištění mohou vysvětlit rezistenci makrovaskulárních komplikací diabetu na konvenční léčbu snižující hladinu glukózy.

METODY

Zdroje dat

Údaje generované v této studii byly uloženy v Národním centru pro biotechnologické informace Gene Expression Omnibus a jsou přístupné pod přístupovým číslem GSE176068.

Zvířata

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/l bylo usmrceno a byla odebrána tkáň.

Buněčné linie

Všechny buněčné linie byly pěstovány při 37 stupních a 5 procentech CO2. Buňky L929 byly pěstovány v médiu Roswell Park Memorial Institute doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 2 procenty penicilin-streptomycinu a 2 mmol/l glutaminu. Buňky L929 byly pěstovány do úplného konfluence po dobu 7 až 8 dnů a kondicionované médium bylo odstraněno, rozděleno na alikvoty a skladováno při -20 stupních, dokud nebylo potřeba. Myší endoteliální buňky získané z kůže byly kultivovány v 25 mmol/1 glukózovém DMEM s 10 procenty FBS, 2 procenty penicilin-streptomycinu a 2 mmol/l glutaminu.

Makrofágy odvozené od BM

Makrofágy odvozené od BM (BMDM) použité v této studii byly vytvořeny propláchnutím BM z myších stehenních a holenních kostí a nanesením na Petriho misky neošetřené tkáňovými kulturami v kompletním 5 mmol/l glukózy DMEM (doplněném 10 procenty FBS, 2 procenty penicilinu -streptomycin a 2 mmol/l glutaminu) plus 20 procent L929 buněčného kondicionovaného média pro diferenciaci. Po diferenciaci po dobu 7 dnů byly BMDM pozitivně selektovány, naneseny na plotny v hustotě 2 x 105 buněk/ml a stimulovány v kompletním 5 mmol/l glukózovém DMEM (pokud není uvedeno jinak) buď 10 ng/ml rekombinantním myším interferonem- (IFN - ; R&D Systems, Spojené království) plus 100 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich, Spojené království), 10 ng/ml rekombinantního myšího IL-4 (R&D Systems, Spojené království) nebo kontrola pouze s médiem po dobu 16 hodin před použitím . BMDM byly také simultánně kultivovány za různých glykemických podmínek (5 mmol/l glukózy DMEM s přidáním glukózy, aby se dosáhlo konečné koncentrace buď 11 nebo 20 mmol/l glukózy) nebo za podmínek osmotické kontroly (mannitol; 5 mmol/l glukózy DMEM plus 15 mmol/l manitolu). Metabolické studie byly provedeny v nepřítomnosti nebo přítomnosti 10 mmol/l dichloracetátů (Sigma-Aldrich, UK) nebo 1 mmol/l 2-deoxy-d-glukózy (Sigma-Aldrich, UK).

HSC izolace

HSC byly izolovány pomocí soupravy MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit (ThermoFisher Scientific, UK) propláchnutím BM z myších stehenních kostí a holenních kostí a inkubací s markery, aby se odstranily buňky oddané linií (CD3, CD4, B220, Ter119 a Gr1) a obohatily se o HSC. HSC byly kultivovány v 5ml fluorescenčně aktivovaných zkumavkách pro třídění buněk v kompletním 5 mmol/l DMEM (nebo 20 mmol/l glukózy nebo mannitolu pro indikované stimulace divokého typu) s přídavkem 100 ng/ml LPS plus 10 ng/ml IFN - nebo 10 ng/ml rekombinantního myšího IL-1 (R&D Systems, UK) po dobu 16 hodin pro analýzu Western blot nebo 2 hodiny pro analýzu pro analýzu sekvenování chromatinu dostupného transpozázou (ATAC-seq).

Model paměti BMDM In Vitro

Myší BM byla diferencována na BMDM, jak je popsáno výše, v 5 nebo 20 mmol/l glukózy po dobu 1, 2, 4 nebo 7 dnů. BMDM byly pozitivně selektovány adhezí, přemístěny na kompletní 5 mmol/l DMEM a ponechány inkubovat po dobu 48 hodin, aby se umožnilo období normalizace glukózy. BMDM byly poté stimulovány pro použití s ​​10 ng/ml IFN- plus 100 ng/ml LPS nebo kontrolním médiem po dobu 16 hodin v nepřítomnosti nebo přítomnosti 0,25, 0,5, 1, 5 nebo 10 umol/l Ro 5-3335 (Merck Millipore, UK) před použitím pro analýzu genové exprese.

Izolace myších monocytů

Myší monocyty byly izolovány z periferní krve pomocí EasySep Mouse Monocyte Isolation Kit (Stemcell Technologies, Kanada) podle protokolu výrobce. Buňky byly okamžitě použity pro test statické adheze.

Seahorse XFe 96 ATP Rate Assay Kit v reálném čase

Analýza extracelulárního toku byla provedena pomocí sady XFp RealTime ATP Rate Assay na BMDM (8x104 buňky na jamku; 5 replikačních jamek na zvíře a podmínky) podle pokynů výrobce. Byly provedeny tři základní měření rychlosti spotřeby kyslíku a rychlosti extracelulárního okyselení před injikováním různých koncentrací glukózy (5 nebo 20 mmol/l) nebo kontrolního (mannitol; injekční port A) testovacího média. Po dalších 7 měřeních byly sloučeniny oligomycin (2 µmol/l; injekční port B) a kombinovaný antimycin A (0,5 µmol/l) a rotenon (0,5 µmol/l; injekční port C) z testu XFp Real-Time ATP Rate Assay soupravy, byly postupně injikovány 3 následnými měřeními. Množství ATP produkovaného glykolýzou a index rychlosti ATP (rychlost produkce mitoATP/rychlost produkce glykolytického ATP) byly automaticky vypočteny pomocí Wave (verze 2.6, Agilent).

Zkouška statické adheze

Myší endoteliální buňky získané z kůže byly pěstovány do konfluence na skleněných krycích sklíčkách v 12-jamkových destičkách a aktivovány 10 ng/ml rekombinantním myším tumor nekrotizujícím faktorem (R&D Systems, UK) po dobu 16 hodin. Nestimulované nebo IFN-plus LPS-stimulované monocyty periferní krve (nebo BMDM od streptozotocinových diabetických myší kultivovaných v 5 mmol/l glukózy) byly fluorescenčně označeny zeleně pomocí soupravy linkeru fluorescenčních buněk PKH67 (Sigma-Aldrich, UK) podle pokynů výrobce. Značené buňky byly přidány k endoteliálním buňkám v hustotě 5 x 104 buněk na krycí sklíčko po dobu 1 hodiny, než bylo médium a nepřichycené buňky odstraněny, promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a fixovány ve 4% paraformaldehydu. Byly získány čtyři snímky na krycí sklíčko; byl spočítán počet adherovaných, značených buněk; a obrázky na krycí sklíčko byly zprůměrovány. Jas zobrazovaných obrázků byl rovnoměrně upraven na ImageJ.

Foam Cell Assay

Nestimulované nebo stimulované (LPS plus IFN-) BMDM byly pěstovány na skleněných krycích sklíčkách v 12-jamkových destičkách a inkubovány s 25 ug/ml DiI-acetylovaného lipoproteinu s nízkou hustotou (LDL; Bioquote, USA) po dobu 48 hodin. Médium a zbývající DiI-acetylovaný LDL byly odstraněny a buňky byly 3krát promyty PBS a fixovány ve 4% paraformaldehydu. Lipid byl obarven olejovou červení O a krycí sklíčka byla připevněna DAPI. Byly pořízeny snímky s fázovým kontrastem barvení Oil Red O a fluorescenční snímky jader (4 snímky na krycí sklíčko) a použity ke kvantifikaci množství lipidu nebo počtu buněk pomocí softwaru ImageJ. Plocha lipidů na snímek byla poté normalizována na počet buněk na snímek a výsledky jsou vyjádřeny jako násobek změny oproti 5 mmol/l kontrolních vzorků glukózy (pro experimenty s BMDM glukózy) a kontrolních vzorků (pro experimenty s diabetickým BMDM). Jas zobrazovaných obrázků byl rovnoměrně upraven.

Diabetický experiment s transplantací BM

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/l a kontrolní CD68-GFP myši stejného věku byly použity jako dárci BM. BM byla odebrána dárcovským myším a 5×106 životaschopných buněk bylo intravenózně injikováno smrtelně ozářeným (2×500 rad) LdLr−/− příjemcům B6.129S7- Ldlr-tm1Her/J myší (JAX skladové č. 002207 ). Po přihojení byla všechna přijímající zvířata umístěna na západní dietu (diety s otevřeným zdrojem D12079B; 1 procento tuku, 40 procent kcal) po dobu 12 týdnů. Plná krev byla odebrána 4, 8 a 12 týdnů po přihojení pro průtokovou cytometrickou analýzu mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) a pro monitorování úrovní přihojení a hodnocení počtu populace leukocytů. Přihojení štěpu, hodnocené každé 4 týdny po přihojení, bylo monitorováno barvením buněk antiCD45 a hodnocením relativního podílu CD45 plus GFP plus buněk mezi celkovou populací CD45 plus. Po 12 týdnech byly myši usmrceny, byla odebrána plná krev a séra byla zpracována na měření triglyceridů, neesterifikovaných mastných kyselin, LDL a lipoproteinů s vysokou hustotou. Myši byly perfundovány PBS, následovala perfuze a fixace 4% paraformaldehydem přes noc. Srdce a aorta byly vypreparovány a umístěny do 70% ethanolu až do zpracování.

Analýza a imunofluorescence aortálního kořenového plaku

Pro kvantifikaci plakové zátěže byly aortální kořeny fixované paraformaldehydem umístěny do optimálního řezného média a rozřezány v rovině rovnoběžné se síněmi. Pro kvantifikaci objemu plaku, obsahu lipidů v plaku21 a obsahu kolagenu bylo 5 řezů rovnoměrně rozmístěných v kořeni aorty obarveno trichromem Masson-Goldner (Merck, UK). Stručně řečeno, řezy byly refixovány v Bouinově roztoku při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, promyty pod tekoucí vodou po dobu 5 minut a poté podrobeny protokolu Masson-Goldner barvicí soupravy z druhé inkubace 70 procent ethanolu podle výrobce časování protokolů. Sklíčka vlhká xylenem byla poté upevněna pomocí Neo-Mount a utěsněna krycím sklem. Charakteristiky plaku byly kvantifikovány na softwaru Image Pro Plus verze 6.0 (Media Cybernetics, Silverspring, MD) a data byla zobrazena jako průměr ze všech řezů.

Imunofluorescence pak byla provedena na 6 sousedních řezech. Řezy byly obarveny na obsah makrofágů pomocí GFP (králičí anti-GFP, A6455, Invitrogen) nebo makrofágového markeru galektinu-3 (kozí anti-galektin 3, AF1197, R&D Systems), pro obsah buněk hladkého svalstva pomocí -aktinu ( králičí aktin proti hladkému svalstvu, ab32575, Abcam PLC), a pro epigenetické značky H3K4me3 (králičí polyklonální k histonu H3 [trimethyl K4], Ab8580, Abcam PLC) a H3K27ac (králičí polyklonální k histonu H3 [acetyl K29, Ab47] Abcam PLC). Pro imunofluorescenční barvení byly řezy rehydratovány PBS po dobu 5 minut při teplotě místnosti a blokovány po dobu 1 hodiny blokovacím pufrem DAKO (Agilent, UK). Primární protilátka byla zředěna na 1 ug/ml v DAKO a přidána k řezům přes noc při 4 stupních. Sekundární protilátky byly zředěny 1:200 v DAKO a přidány na 1 hodinu při pokojové teplotě (oslí anti-králičí [A488], A21206, Life Technologies; oslí antikozí [A594], A11058, ThermoFisher Scientific). Řezy byly nakonec upevněny DAPI (glycerolové upevňovací médium s DAPI a DABCO, Abcam, UK). Fluorescenční obrazy byly analyzovány softwarem Image J.

Genová exprese

Celková RNA byla izolována pomocí soupravy RNeasy Plus Mini kit (Qiagen, UK) a kvantifikována pomocí UV-viditelného spektrofotometru Nanodrop 20}00. Syntéza cDNA byla prováděna s 0,2 až 2 ug RNA v polymerázové řetězové reakci (PCR) pomocí sady pro reverzní transkripci QuantiTect (Qiagen, UK), podle pokynů výrobce. Kvantitativní PCR v reálném čase byla provedena na 5 ng/µL cDNA se sondami Taqman specifickými pro B2m (Mm00437762), Il{9}} (Mm00446190), Il{11}} (Mm00462531_ m1), iNos (Mm00440502), Yml (Mm00657009) a Fizz1 (Mm00556208). Kvantitativní PCR byla provedena s univerzálním master mixem TaqMan II s UNG na systému QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher). Všechna data PCR byla normalizována na vnitřní expresi genu housekeepera (B2m) a analyzována metodou 2−ACT pro výpočet relativní exprese mRNA.

Analýza Western Blot

Buňky byly promyty v ledově chladném PBS a lyžovány v lyzačním pufru pro radioimunoprecipitační test (150 mmol/l NaCl, 1,0 procent IGEPAL CA-630, 0,5 procenta deoxycholátu sodného, ​​0,1 procenta SDS, 50 mmol/l Tris, pH 8,0) doplněného inhibitory proteázy a fosfatázy. Koncentrace proteinu byla stanovena testem na kyselinu bicinchonovou (Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific, UK) podle instrukcí testu. Stejné koncentrace proteinu byly naneseny a podrobeny separaci na SDS-PAGE gelu (4 až 12 procent Bis-Tris Gel, Life Technologies, UK). Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad, UK) a sondovány pomocí specifických protilátek, jak je uvedeno u -actinu (myší anti{18}}aktin [15G5A11/E2], Invitrogen) jako hospodyně a kontrola nanášení. Membrány byly vyvinuty (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific, UK) a detekovány chemiluminiscencí na Biorad Image Station.

Lidské vzorky a LCM izolace plakových makrofágů

Všechna klinická vyšetření byla provedena Helsinskou deklarací a vzorky byly skladovány podle britského zákona o lidských tkáních (2004). Studie byla schválena příslušnou komisí pro etické hodnocení a všechny subjekty poskytly písemný informovaný souhlas. Byli přijati pacienti čekající na karotickou endarterektomii a karotické plaky byly odebrány čerstvě v době operace (charakteristiky pacientů shrnuty v souboru Excel I v dodatku Data). Explantované karotidové plaky byly promyty v ledově chladném sterilním PBS, bleskově zmraženy v optimálním řezném médiu a skladovány při -80 stupních až do zpracování.

LCM se provádělo pomocí systému PALM Microbeam LCM (Carl Zeiss GmbH, Německo) za použití přizpůsobeného přístupu "vodící sklíčko".22,23 Vzorky karotidového plaku byly čerstvě nařezány na 15 um. Vodící sklíčka se skládala ze 3 po sobě jdoucích řezů: První řez byl obarven protokolem barvicí soupravy Masson-Goldner, aby se usnadnilo určení mikroanatomických lokalizací, a další 2 byly imunobarveny na oba makrofágy (myší antihumánní CD68 [klon KP{7} }], Dako, Cambridge UK) nebo buňky hladkého svalstva (myší antihumánní -aktin [klon 1A4], Dako, Cambridge UK). Následné řezy (až 15) byly nařezány na membránová sklíčka LCM (ThermoFisher Scientific, UK) a obarveny kresylovou violeťou připravené k okamžitému zpracování. Shluky makrofágových buněk byly identifikovány ručně na základě barvení vodícího sklíčka pomocí PALM RoboSoftware (verze 4.5, Carl Zeiss GmbH, Německo). Celková kombinovaná oblast zájmu mezi 3 a 5 x 106 um2 byla zachycena laserem na Zeiss PALM AdhesiveCap (Carl Zeiss GmbH, Německo). Buňky byly okamžitě lyžovány, rychle zmraženy na suchém ledu a skladovány při -80 stupních, dokud nebyla RNA extrahována pomocí mikro soupravy RNEasy (Qiagen, UK), podle protokolu výrobce.

Human Plaque Macrophage Microarray

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5 byly předány k amplifikaci RNA, biotinylaci a mikročipové analýze genové exprese. Tyto vzorky byly předloženy Cambridge Genomic Services (Department of Pathology, University of Cambridge, UK) k dalšímu zpracování. Amplifikace a biotinylace byly provedeny pomocí sady Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc, USA) a poté byla hybridizace změněna v náhodném pořadí na 2 Illumina Human HT12 v4.0 BeadChips (Illumina, USA), aby se minimalizovala dávka / variace čipu. Illumina BeadArrays byly zpracovány balíčkem korálků Bioconductor (verze 2.24.0)24,25 s použitím normální exponenciální normalizace. Soubory sond byly rozděleny na gen na základě maximálního mezikvartilového rozsahu, aby se zabránilo extrémním hodnotám, ale zachytila ​​se variabilita napříč všemi vzorky. Neanotované a kontrolní sady sond byly z další analýzy vyloučeny. Diferenciální exprese (DE) konečného seznamu 21036 genů byla hodnocena pomocí balíčku Bioconductor limma (verze 3.30.13)26 za účelem srovnání diabetika s kontrolou, s úpravou na symptomatický/asymptomatický stav. Vzhledem k dostupnosti ortogonálních datových sad a 8 vzorků na skupinu jsme použili relativně mírnou upravenou hodnotu P<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

Izolace lidských monocytů

Periferní žilní krev (15–20 ml) byla získána od zdravých dárců ve zkumavkách potažených K2-EDTA (BD Vacutainer, New Jersey) a zpracována do 1 hodiny. Plazma a frakce obohacená o mononukleární buňky byly získány odstředěním plné krve na kolonách Accuspin Histopaque{4}} (Sigma-Aldrich, USA) podle pokynů výrobce. Frakce obohacená o mononukleární buňky byla odebrána k izolaci monocytů pomocí sady pro izolaci kuliček pro negativní selekci (sada pro obohacení lidských monocytů EasySep bez deplece CD16, StemCell Technologies, Kanada), podle protokolu popsaného výrobcem.

Izolace a stimulace mononukleárních buněk lidské periferní krve

Pacienti s diabetem a kontrolní pacienti byli přijati do klinických studií po místním a regionálním etickém schválení v Karolinska Institute, Stockholm (2011/1002-31/1 a 2009/1881-31/1). PBMC byly izolovány ze vzorků periferní krve odebraných po nočním hladovění pomocí SepMate (StemCell Technologies) a Lymphoprep (StemCell Technologies) podle pokynů výrobce. Izolované PBMC byly zmraženy a skladovány v 90 procentech FBS a 10 procentech dimethylsulfoxidu.

Uskladněné PBMC byly rozmraženy a promyty v PBS centrifugací (500 g po dobu 10 minut), životaschopné buňky byly spočítány a naneseny do jednotlivých jamek 12-jamkové destičky pro tkáňové kultury ve fyziologickém (nízkém) glukózovém DMEM, 10% FBS, 2 mmol/l l-glutaminu a 1 procento penicilinu a streptomycinu. PBMC byly ponechány přes noc a ošetřeny PBS-vehikulem nebo 100 ng/ml LPS a 10 ng/ml rekombinantního IFN- (R&D Systems) po dobu 6 hodin. Po stimulaci byly PBMC lyžovány v RLT (QIAGEN), rychle zmraženy a skladovány při -80 stupních. RNA byla izolována a podrobena sekvenování RNA (RNAseq), jak je popsáno.

Metabolomika a měření metabolitů

Izolované lidské monocyty byly kultivovány v hustotě 3,5×105 buněk na vzorek v kompletním 5 mmol/l glukózovém DMEM, médiu doplněném glukózou, aby se dosáhlo konečné koncentrace 20 mmol/l glukózy nebo média s 15 mmol/l mannitolu v 5ml fluorescenčně aktivovaných zkumavkách pro třídění buněk po dobu 12 hodin. Buněčné lyzáty byly připraveny extrakcí ledově chladným methanolem po dobu 20 minut na suchém ledu a bleskově zmraženy v kapalném dusíku. V den analýzy byly vzorky vortexovány a poté centrifugovány při 10,{13}}g po dobu 10 minut při 4 stupních. Sdružený vzorek kontroly kvality byl připraven smícháním 60 ul každého extraktu vzorku a periodicky analyzován během celého analytického běhu, aby se potvrdila účinnost metody. Vzorky byly přefiltrovány pomocí 0,{18}}µm odstředivého filtru Ultrafree-MC (5000 g, 3 minuty) a poté přeneseny do lahviček kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Necílené metabolomické analýzy byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve.27 Stručně řečeno, vzorky byly analyzovány na kapalinové chromatografii Thermo Ultimate 3000 s ultravysokou účinností spojenou s Q-Exactive Orbitrap s použitím akvizice s přepínáním polarity (pozitivní-negativní) pracující s hmotnostní rozlišovací schopností 70 000 plné šířky maximálně na polovinu. Hydrofilní sloučeniny byly chromatograficky separovány na koloně Merck Sequant ZIC-HILIC (150×4,6 mm, velikost částic 5-µm) a hydrofobní sloučeniny pomocí kolony Thermo Accucore aQ RP C18 (150×2,1 mm, 2).{38 }} µm velikost částic). Metabolity byly identifikovány pomocí interní databáze.27 Analýza obohacení souboru metabolitů a analýza metabolické dráhy byla provedena u všech měření metabolitů pomocí MetaboAnalyst (verze 4.0).

Pro měření BMDM a HSC metabolitů byly buňky kultivovány, jak bylo popsáno dříve, v hustotě 5 x 105 na jamku a kultivační supernatanty byly spuštěny na ABX Pentra 400 (Horiba) pro měření glukózy (ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, UK) a hladiny laktátu (ABX Pentra Lactic Acid). Měření byla normalizována na koncentrace glukózy a laktátu přítomné v kontrolním kompletním buněčném kultivačním médiu, které bylo inkubováno za stejných podmínek, ale ne v přítomnosti buněk. BMDM buněčné lyzáty byly použity k měření hladin sukcinátu (Succinate Assay Kit, Abcam, UK) podle pokynů výrobce.

Analýza ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 bp. Koncentrace DNA byly měřeny fluorometrem Qubit (Life Technologies) a distribuce velikosti knihovny byla hodnocena pomocí Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip (Agilent, UK). Amplifikace knihovny byla provedena pomocí vlastních primerů Nextera.28 Knihovny byly sekvenovány pomocí Biomedical Sequencing Facility v CeMM s použitím platformy Illumina HiSeq 3000/4000 a konfigurace 50-bp single-read.

Čtení byla kontrolována na kvalitu a oříznuta ze všech zbývajících adaptérů. Čtení byla poté porovnána s myším genomem (Mm10) pomocí Bowtie (verze 2.2.6) v "citlivém místním" režimu. Zarovnaná čtení byla filtrována, aby se odstranily shody nízké kvality (kvalita mapování menší nebo rovna 10) nebo čtení mapování na mitochondriální sekvence. Počáteční pozice zarovnání byly posunuty způsobem s vědomím řetězce (4 bp, -5 bp, 28) před voláním vrcholu s MACS2 (verze 2.1.129). Diferenciálně vázané oblasti byly identifikovány pomocí DiffBind (verze 2.4.830) s centrováním píku (summits=100) a edgeR.31

Analýza dráhy byla poté provedena na pících obohacených v diabetických vzorcích (míra falešného objevu [FDR] menší nebo rovna {{0}}.1) zadáním umístění píku chromozomu do nástroje Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool ( verze 3.0).32 Oblasti diferenciálních píku byly poté analyzovány pomocí MEME–chromatinové imunoprecipitace (ChIP; verze 4.12.0),33 která provádí komplexní analýzu motivů k identifikaci jakýchkoli známých nebo neznámých vazebných motivů, které jsou obohacené (obohacené motivy E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

Transkripční faktor 1 související s Runtem Identifikace cíle

MEME-ChIP oblastí ATAC-seq identifikoval Runt-related transkripční faktor 1 (RUNX1) jako potenciální regulátor jak u IL-1, tak u nestimulovaných diabetických HSC. MEME GOMo (verze 4.12.0)33 byl použit ke skenování myších a lidských promotorů (-1000, plus 200) pro konsensus RUNX1 motiv (MA002.2). Kromě analýzy obohacení genové ontologie vrací GOMo seznam genů identifikovaných jako cíle. Tyto zásahy byly omezeny na konzervované promotory vázané jak u myší, tak u lidí s empirickými hodnotami P<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

Analýza RNA-seq

Kontrolní nebo diabetické BMDM (n{0}}), kultivované v 5 mmol/l a stimulované LPS plus IFN- po dobu 6 hodin nebo nestimulované kontrolní buňky, byly použity pro analýzu RNA-seq. Stručně, RNA byla izolována pomocí mirVana mRNA/miRNA Isolation Kit (ThermoFisher Scientific, UK), podle instrukcí výrobce. Množství celkové RNA bylo kvantifikováno systémem Qubit Fluorometric Quantitation System (Life Technologies) a číslo integrity RNA bylo stanoveno systémem Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad). Knihovny RNA-seq byly připraveny pomocí soupravy pro přípravu vzorků TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, Spojené království) s použitím robotů pro manipulaci s kapalinami Sciclone a Zephyr (PerkinElmer, Spojené království). Koncentrace knihovny byly kvantifikovány systémem Qubit Fluorometric Quantitation System (Life Technologies, UK) a distribuce velikosti byla hodnocena systémem Experion Automated Electrophoresis System (Bio-Rad, USA).

Pro sekvenování byly vzorky zředěny a spojeny v ekvimolárních množstvích a sekvenovány na přístrojích Illumina HiSeq 3000/4000 v konfiguraci 50-bp s jedním čtením pomocí Biomedical Sequencing Facility na CeMM. Základní volání poskytovaná softwarem Illumina Real-Time Analysis byla následně převedena do formátu binární mapy zarovnání (Illumina2bam) před demultiplexováním (BamIndexDecoder) do jednotlivých souborů binárních map specifického pro vzorky pomocí nástrojů Illumina2bam (1.17.3). Knihovny byly připraveny a sekvenovány Biomedical Sequencing Facility v CeMM.

Čtení byla porovnána s myším genomem (GRCm38/mm10) pomocí STAR (verze 2.5.3a34) v režimu počítání genů (quantMode GeneCounts) s poznámkami Gencode (verze M16) (ze kterých byl odstraněn mega transkript Gm20388, aby se zabránilo překrývání intervenujících genů). Počty byly načteny do R (verze 3.3.3) a analyzovány pomocí edgeR (verze 3.16.535) po odstranění přepisů pomocí<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 byly považovány za DE. Tabulky DE a seznamy genů jsou zahrnuty jako soubor Excel II v doplňku dat (nestimulované) a soubor Excel III v doplňku dat (stimulované LPS plus IFN). Funkce edgeR cpm byla použita k logaritmické normalizaci počtů (Excel File IV v dodatku Data) pro tepelné mapy a další grafy. Teplotní mapy byly generovány pomocí heatmap balíčku R (verze 1.0.836). Nadměrná reprezentace analýzy cílových genů RUNX1 mezi DE geny u diabetiků ve srovnání s kontrolními vzorky LPS plus IFN- byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve pro data z lidského pole.

ChIP sekvenování

Celkem 1 x 106 buněk/ml bylo fixováno 1% formaldehydem při teplotě místnosti po dobu 10 minut, promyto PBS a skladováno při -80 °C. Buňky byly stříhány pomocí Chromatin EasyShear Kit–Low SDS (Diagenode, Belgie) a sonikovány pomocí sonikačního zařízení Bioruptor Pico (katalogové č. B01080010, Diagenode, Belgie) podle doporučení výrobce. Systém MAGnify Chromatin Immunoprecipitation System (Thermo Scientific) byl použit k selekci fragmentů chromatinu pomocí anti-histonu H3 (trimethyl K4; ab8580) nebo antihistonu H3 (acetyl K27; ab4729). Sekvenační knihovny byly připraveny pomocí NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, purifikovaný ChIP nebo vstupní DNA byla opravena na konci a zakončena A a následovala ligace adaptéru. DNA navázaná na adaptér byla vybrána podle velikosti pomocí kuliček SPRI Ampure XP (Agencourt) a obohacena o sekvenační primery kompatibilní s Illumina. Finální knihovny byly purifikovány pomocí kuliček SPRI Ampure XP, aby se odstranily dimery adaptéru, a sekvenovány pomocí Biomedical Sequencing Facility v CeMM s použitím platformy Illumina HiSeq 3000/4000 a konfigurace 50-bp s jedním čtením.

Bioinformatika

Pro zkoumání vztahu mezi otevřeností chromatinu a genovou expresí u nestimulovaných BMDM byly porovnány vrcholy diabetu versus kontrolní ATAC-seq (log2násobné změny) a hladina mRNA proximálních genů (log2násobné změny) pomocí Pearsonovy lineární korelace.

Čtení z experimentů ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-sekvenování (ChIPseq) a H3K27ac ChIP-seq byla vizualizována v reprezentativních vzorcích pomocí Integrative Genome Browser, s výškami stop upravenými podle experimentu a typu buňky, aby se zohlednily systematické rozdíly v hloubce čtení.

Statistická analýza

Všechna statistická analýza nesekvenačních dat byla provedena v softwaru GraphPad Prism. Data byla analyzována na normální distribuci Shapiro-Wilkovým testem normality. Srovnání mezi 2 skupinami byla vypočtena pomocí 2-sledovaných Studentových t-testů nebo Mann-Whitneyho U testů pro normálně nebo nenormálně distribuovaná data. Srovnání mezi více skupinami byla vypočtena 1-způsobem nebo 2-způsobem analýzy ANOVA s Bonferroniho post hoc korekcí. Data jsou uváděna jako průměr ± SD pro data s normálním rozložením nebo medián ± mezikvartilové rozmezí pro data s nenormálním rozložením. Několik replikátů a další statistické podrobnosti lze nalézt v legendách obrázků. Pro experimenty in vivo i in vitro je n počet jednotlivých zvířat nebo jednotlivých zdravých dobrovolníků nebo pacientů. Záhybové změny se vypočítají jako průměrná hodnota testovacích podmínek dělená průměrnou kontrolní hodnotou.

VÝSLEDEK

Diabetická hyperglykémie mění buněčný metabolismus, podporuje expresi a funkci prozánětlivých genů

Aerobní glykolýza zvyšuje expresi prozánětlivého (M1) genu37 a hyperglykémie také podporuje expresi genu související s M1-.10,11 Proto jsme předpokládali, že vysoká extracelulární glukóza řídí zvýšenou glykolýzu, což vede ke zvýšené polarizaci makrofágů směrem k fenotypu M1 .

Metabolomová analýza primárních lidských monocytů ukázala, že vysoká extracelulární glukóza (20 mmol/l) posunula metabolický profil ve srovnání s osmoticky odpovídajícími podmínkami fyziologické glukózy (5 mmol/l). Analýza dráhy (obrázek 1A) odhalila, že vysoká hladina glukózy způsobila významné změny v cyklu trikarboxylových kyselin (FDR, 0.002) a metabolismu pyruvátu (FDR, 0,005), označované jako zvýšený sukcinát, malát ( Obrázek 1B), hladiny laktátu a pyruvátu (obrázek 1C), v tomto pořadí, s analýzou obohacení sady metabolitů (obrázek 1D) zdůrazňující Warburgův efekt (FDR, 0,04).

Obrázek 1. Vysoká hladina glukózy mění buněčný metabolismus. Analýza metabolické dráhy. Individuální měření pro (B) sukcinát, malát, (C) laktát a pyruvát a (D) analýzu obohacení sady metabolitů (Metaboanalyst) pro vzorky metabolomických lyzátů lidských monocytárních buněk (n=5). Analýza extracelulárního toku na makrofázích odvozených z kostní dřeně myší (bioanalyzátor Seahorse; n=6 jednotlivých zvířat) měřila (E) rychlost extracelulární acidifikace (ECAR) a (F) rychlost spotřeby kyslíku (OCR) v reakci na různé extracelulární glukózy, osmotická kontrola (mannitol) a injekce metabolických inhibitorů. Vysoká hladina glukózy (G) zvýšila produkci glykolytického ATP (glykoATP) a (H) snížila index rychlosti ATP (rychlost produkce mitochondriálního ATP/rychlost produkce glykoATP), což ukazuje na posun k více glykolytickému fenotypu. Data byla analyzována (B a C) 2-způsobem ANOVA nebo (E–H) 1-způsobem ANOVA plus Bonferroniho post hoc testem. Všechna uvedená data jsou průměr ± SD. AU označuje libovolné jednotky; FDR, míra falešných objevů; a TCA, trikarboxylová kyselina. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Více glykolytický (a méně oxidativní) fenotyp v reakci na vysokou hladinu glukózy (20 mmol/l) byl potvrzen u myší BMDM, které vykazovaly zvýšení rychlosti extracelulárního okyselení, zvýšenou produkci glykolytického ATP (2-krát; P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

Tomuto zvýšení rychlosti glykolýzy bylo zabráněno inhibitorem glykolýzy dichloracetátem (obrázek la a Ib v dodatku dat).

U BMDM vysoká hladina glukózy podpořila prozánětlivou M1-asociovanou Il-6 expresi (2.7-násobek; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

Obrázek 2. Vysoká hladina glukózy mění expresi a funkci makrofágového genu. M1 (lipopolysacharidem [LPS] plus interferonem [IFN-] stimulovaný) makrofág odvozený z kostní dřeně (BMDM) (A) Il{4}} a (B) je genová exprese v přítomnosti nebo nepřítomnosti dichloracetátu (DCA). M2 (stimulovaná interleukinem{6}}) BMDM (C) Ym1 a (D) Fizz1 genová exprese. A až D, data kvantitativní polymerázové řetězové reakce jsou normalizována na expresi B2m; n=7 až 10. E, Obrazová kvantifikace adheze myších monocytů na endoteliální buňky (n=5). F, Obrazová kvantifikace absorpce acetylovaného lipoproteinu o nízké hustotě pomocí BMDM, normalizovaná počtem buněk na obrázek. Reprezentativní (G) snímky statické adheze fluorescenčně PKH67-značených myších monocytů k endoteliálním buňkám a snímky pěnových buněk obarvené (H) Oil Red O (ORO) a DAPI. Všechny údaje (A–H) jsou uvedeny jako průměr ± SD; (A–D) 1-způsob ANOVA nebo (E a ​​F) 2-způsob ANOVA s Bonferroniho post hoc analýzou. Každý bod představuje jednotlivé zvíře (průměr 4 snímků pro statickou adhezi a tvorbu pěnových buněk). AU označuje libovolné jednotky; NS je nevýznamný. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Vzhledem k jeho účinkům na podporu zánětu jsme pak testovali, zda vysoká extracelulární glukóza změnila monocytové a makrofágové funkce relevantní pro aterogenezi.38,39 Vysoká hladina glukózy zvýšila adhezi myších monocytů k aktivovaným endoteliálním buňkám (2.6-krát; P<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

Buňky odvozené od BM od diabetických myší vykazují trénovanou imunitu vyvolanou hyperglykémií

Dále jsme použili myší model diabetu, abychom otestovali, zda hyperglykémií indukované trvalé prozánětlivé změny v makrofázích, a to i po normalizaci glukózy. Získali jsme BM od nediabetických, věkově odpovídajících kontrolních myší a od syngenních diabetických myší, u kterých byla hyperglykémie indukována streptozotocinem a udržována po dobu 6 týdnů in vivo (obrázek IIIa–IIId v dodatku k datům). Buňky byly diferencovány na BMDM pod fyziologickou glukózou (5 mmol/l; obrázek 3A). Po stimulaci vykazovaly BMDM původem z diabetických myší zvýšenou expresi genu M1-spojeného s Il-6 (4.1-krát; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

Obrázek 3. Makrofágy odvozené z kostní dřeně (BMDM) z diabetických myší vykazují hyperglykemickou paměť v genové expresi. A, Schéma diabetického a kontrolního protokolu BMDM (n=10–12). Analýza genové exprese M1 (B) Il-6 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

Kromě toho došlo ke zvýšení adheze k aktivovanému endotelu (6{1}}násobně; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

Obrázek 4. Makrofágy odvozené z kostní dřeně (BMDM) z diabetických myší vykazují změněné funkce navzdory normalizaci glukózy. BMDM z diabetických myší byly diferencovány v 5 mmol/l (n=5–8). A, Obrazová kvantifikace adheze BMDM na endoteliální buňky (n=8). B, Obrazová kvantifikace absorpce acetylovaného lipoproteinu o nízké hustotě pomocí BMDM, normalizovaná počtem buněk na snímek. Reprezentativní (C) snímky statické adheze fluorescenčně (PKH67) značených BMDM k endoteliálním buňkám a (D) snímky pěnových buněk obarvené olejovou červení O (ORO) a DAPI. Všechna data jsou uvedena jako průměr ± SD a každý bod představuje jednotlivé zvíře (průměr ze 4 snímků pro statickou adhezi a tvorbu pěnových buněk). Data byla analyzována 2-způsobem ANOVA s Bonferroniho post hoc testem. IFN- označuje interferon-; a LPS, lipopolysacharid. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Trénovaná imunita navozená hyperglykémií pohání aterosklerózu

Proto, abychom otestovali funkční význam trénované imunity vyvolané hyperglykémií u aterosklerózy, transplantovali jsme BM od myší s normoglykemickou kontrolou nebo diabetických dárců indukovaných streptozotocinem (glukóza v krvi, 33,9 ± 6,9 mmol/l) do Ldlr-/ se sklonem k ateroskleróze (normoglykemický). - recipientní myši (obrázek 5A). V každém případě byly dárcovské myši transgenní pro GFP pod kontrolou lidského promotoru CD68.40 Účinné a ekvivalentní přihojení bylo prokázáno průtokovou cytometrickou analýzou PBMC, která potvrdila přítomnost CD45 plus GFP plus buněk pozitivních buď na CD11b nebo Ly6C ( Obrázek IVa a IVb v dodatku k datům). Po 12 týdnech na dietě západního typu nebyly zjištěny žádné rozdíly v měření krevních lipidů (obrázek IVc a IVd v dodatku Data) nebo podskupinách leukocytů, jak bylo hodnoceno průtokovou cytometrií (obrázek IVe v dodatku Data).

Myši, které dostaly diabetickou BM, vykazovaly výrazně zvýšenou aterosklerózu, přičemž většina měla více než největší zátěž aterosklerózou u nediabetických příjemců (střední plochy plaku, 44461 µm2 [interkvartilní rozsah, 18368–59597 µm2] oproti 79809 µm2]–174745 [474745] ; Mann-Whitney, P=0.036). Tyto myši také vykazovaly zvýšení obsahu makrofágů v plakech (P=0.052; obrázek V v dodatku Data), oblast nekrotického jádra bohatého na lipidy (2.8-násobek, P{{18} }}.0076; obrázek VIa v dodatku Data) a podíl nekrotického jádra bohatého na lipidy (2.4-násobek, P=0.046; obrázek VIb v dodatku k datům), ale bez rozdíly v obsahu kolagenu (procento plaku; obrázek VIc a VId v datovém dodatku) nebo buněk hladkého svalstva (procento plaku; obrázek VIe a VIf v datovém dodatku).

Trénovaná imunita vyvolaná hyperglykémií u HSC je řízena změnami v metabolismu vedoucími k epigenetickému přeprogramování

Vzhledem k demonstraci, že BM z hyperglykemických myší podporuje aterosklerózu, spolu s trvalou prozánětlivou genovou expresí a funkčními odpověďmi nalezenými v BMDM in vitro, jsme usoudili, že tato paměť byla projevem trénované imunity v buňkách odvozených z BM. Trénovaná imunita byla spojena se změnami v buněčném metabolismu, které indukují dlouhotrvající epigenetické znaky měnící chromatin, jako jsou H3K4me3 a H3K27ac.17,18,41 V souladu s tím jsme zjistili, že HSC (negativní linie: odstranění zralých T buněk , B buňky, přirozené zabíječské buňky, dendritické buňky, monocyty, granulocyty, erytroidní buňky: CD3−, CD4−, B220−, Ter119, Gr1− kultivované v podmínkách vysoké extracelulární glukózy také vykazovaly zvýšené vychytávání glukózy a produkci laktátu, což ukazuje na dysregulovanou glykolýzu (P<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

V aortálních kořenových plakech byl podíl jader asociovaných s makrofágy obarvených pozitivně na H3K4me3 vyšší u myší, které dostaly BM od diabetických dárců (1.8-krát, P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

Obrázek 5. Diabetická kostní dřeň (BM) řídí aterosklerózu navzdory prodloužené normalizaci glukózy. A, Schéma experimentu transplantace BM. B, Průtoková cytometrická analýza populací periferních leukocytů u myší po 12 týdnech transplantace kostní dřeně. C, Reprezentativní snímky kořene aorty od myší Ldlr−/−, které obdržely buď diabetického dárce nebo kontrolního dárce CD68- GFP BM. Makrofágy pocházející z transplantátu BM obarvené Massonem Trichromem (vlevo) a imunofluorescenční barvení (zelená označuje zeleně fluorescenční protein [GFP]) nebo všechny makrofágy (červená označuje galektin-3 [GAL3]). Kvantifikace obrazu (D) objemu plaku (P=0.036). Data uvedená jako průměr ± SD, analyzovaná 1-cestou ANOVA s Bonferroniho post hoc testem (B), nebo medián ± interkvartilní rozmezí, analyzovaná Mann-Whitney U testem (D); kontrola n=6, diabetická n=9. E, Reprezentativní snímky aortálního kořene od Ldlr-/- myší, které dostaly buď diabetickou nebo kontrolní transplantaci BM. F, Kvantifikace procenta jader obarvených pozitivně na H3K4me3 nebo H3K27ac v oblasti pozitivní na makrofágy GAL3. Každý datový bod představuje jednotlivé zvíře (průměr, 6 sekcí; n= 7 až 10). Zobrazeno jako průměr ± SD. Jednosměrná analýza ANOVA. BMDM označuje makrofágy odvozené od BM; HSC, hematopoetická kmenová buňka; IFN-, interferon-; a LPS, lipopolysacharid. *P<0.05.

Abychom prozkoumali biologickou relevanci této sady nekódujících genomických oblastí (s důrazem na domnělou cis-regulační funkci), byly oblasti chromatinu se zvýšenou dostupností v diabetických buňkách přiřazeny ke 2 nejbližším genům (v rámci 10{{ 11}}0 kb) a analyzovány pomocí nástroje Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool.33 Tato analýza dráhy odhalila augmentaci několika drah souvisejících se zánětem, včetně aktivace leukocytů (3{6}}násobně; FDR, 0,0005 ) a geny spojené s tolerizací LPS v makrofázích (2.{10}}násobek; FDR, 0,0009). Abychom pochopili, zda vysoká glukóza v izolaci může také indukovat modifikaci chromatinu, použili jsme ATAC-seq, abychom se podívali na HSC z kontrolních a diabetických myší v nepřítomnosti stimulace IL-1. Nestimulované HSC vykazovaly 357 diferenciálních píku (FDR menší nebo rovno 0,2), z nichž 51 procent mělo zvýšenou dostupnost v buňkách diabetického původu ve srovnání s kontrolou, s většinou v intronických (48 procent) nebo intergenních (21 procent) oblastech.

Vzhledem k těmto zjištěním v HSC jsme dále zkoumali dostupnost chromatinu a genovou expresi v jejich derivátech BMDM. Provedli jsme ATAC-seq a RNA-seq na BMDM z kontrolních a diabetických myší za nestimulovaných nebo prozánětlivých stimulovaných (LPS plus IFN-) podmínek. BMDM z diabetických myší vykazovaly rozdílnou dostupnost chromatinu za nestimulovaných podmínek s 1047 rozdílnými oblastmi (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). Celkově vzato data ATAC-seq a RNAseq naznačují, že diabetes vyvolal u makrofágů přehnanou odpověď na prozánětlivý stimul.

Obrázek 6. Diabetes mění hladiny H3K4me3 a H3K27ac a dostupnost chromatinu. MA graf všech testů pro sekvenování chromatinu dostupného pro transpozázu chromatin čte v (A) nestimulovaných nebo (B) stimulovaných makrofázích odvozených z kostní dřeně (BMDM), kde vrcholy s rozdílnou dostupností (míra falešných objevů<0.05, fold change >1.5) jsou zvýrazněny růžově (1047 nestimulovaných, 40 stimulovaných, n=6). C, Variabilní oblasti H3K4me3 a H3K27ac kvantifikované chromatinovým imunoprecipitačním sekvenováním v hematopoetických kmenových buňkách (HSC) a BMDM z kontroly versus diabetické myši (n=6 na skupinu). D, Histogram průměrného pokrytí H3K27ac a K3K4me3 v HSC, nestimulovaných BMDM a prozánětlivě stimulovaných BMDM (lipopolysacharid [LPS] plus interferon- [IFN]) v místech začátku transkripce ± 1 kb genů kódujících protein v blízkosti oblastí zvýšené dostupnost v nestimulovaných BMDM (vs. kontroly; n=405) a srovnání s úrovněmi pozadí v nevybraných oblastech.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 pro každou), porovnali jsme násobek změny pro rozdílový vrchol ATAC-seq oproti násobku změny pro DE. Při zkoumání jako spojité proměnné existovala silná korelace mezi změnami v chromatinu a expresí proximálních genů (R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 kb od anotovaných míst začátku transkripce. Zaměřili jsme se na geny v blízkosti těchto zesilovačů, protože jejich genové promotorové oblasti (místa počátku transkripce ± 1 kb) představují nejpravděpodobnější regulační cíle. ATAC-seq identifikoval 405 oblastí odlišně otevřeného chromatinu (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

Obrázek 6. Diabetes mění hladiny H3K4me3 a H3K27ac a dostupnost chromatinu. MA graf všech testů pro sekvenování chromatinu dostupného pro transpozázu chromatin čte v (A) nestimulovaných nebo (B) stimulovaných makrofázích odvozených z kostní dřeně (BMDM), kde vrcholy s rozdílnou dostupností (míra falešných objevů<0.05, fold change >1.5) jsou zvýrazněny růžově (1047 nestimulovaných, 40 stimulovaných, n=6). C, Variabilní oblasti H3K4me3 a H3K27ac kvantifikované chromatinovým imunoprecipitačním sekvenováním v hematopoetických kmenových buňkách (HSC) a BMDM z kontroly versus diabetické myši (n=6 na skupinu). D, Histogram průměrného pokrytí H3K27ac a K3K4me3 v HSC, nestimulovaných BMDM a prozánětlivě stimulovaných BMDM (lipopolysacharid [LPS] plus interferon- [IFN]) v místech začátku transkripce ± 1 kb genů kódujících protein v blízkosti oblastí zvýšené dostupnost v nestimulovaných BMDM (vs. kontroly; n=405) a srovnání s úrovněmi pozadí v nevybraných oblastech.

Tyto rozdíly se u BMDM zmenšily (obrázek 6D), částečně kvůli zvýšenému H3K27ac v buňkách nediabetického původu po diferenciaci. Značka H3K4me3 se však u těchto promotorů v HSC zvýšila, přičemž identifikovatelné rozdíly přetrvávají v diferencovaných makrofázích, včetně po stimulaci cytokiny (obrázek 6D). Tento vzor přechodných značek H3K27ac a přetrvávajících značek H3K4me3 je v souladu s našimi zjištěními v tkáňové kultuře (obrázek VIII v dodatku Data) a imunohistochemii v makrofázích myších plaků (obrázek 5E a 5F).

Oblasti odlišně otevřeného chromatinu identifikované pomocí ATAC-seq byly vysoce významně spojeny se změnami v transkripci proximálních genů. Dále, kvantifikace rozdílu v dostupnosti chromatinu (diabetes versus kontrola) a přímé srovnání se změnou hladin exprese mRNA proximálního genu vysoce korelovaly (R=0.5; P=6.2e -15, obrázek 7A). Abychom prozkoumali tyto účinky na relevantních genomových lokusech, zkombinovali jsme data ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-seq a H3K27ac ChIP-seq u promotorů 2 genů, které se dříve podílely na trénované imunitě vyvolané glykolýzou a s produkty zapojenými do řízení zánětu (II. -6) a metabolismus glukózy (Hk1). Tyto geny vykazovaly oblasti dostupného chromatinu v místech počátku transkripce s asociovanými píky H3K4me3 a H3K27ac v těchto genomových lokusech (obrázek 7B).

Abychom získali přehled o tom, které transkripční faktory by mohly být implikovány jako mediátory tohoto modelu trénované imunity vyvolané hyperglykémií, byla provedena analýza motivového obohacení33 na oblastech chromatinu se zvýšenou dostupností za diabetických podmínek. Významně obohacené motivy transkripčního faktoru zahrnovaly zejména RUNX1 (FDR, 0.0001), který byl dříve spojován s imunologickou pamětí,46 a také PU.1 (FDR, 0,04) a vazbu CCCTC faktor (FDR, 1,8x10-7; obrázek 8A). Po implikaci transkripčního faktoru RUNX147 na základě dostupnosti vazebných motivů jsme zkoumali, zda cílové geny RUNX1 byly významně nadměrně zastoupeny mezi geny DE v LPS plus IFN-stimulované BMDM. Tato analýza identifikovala 95 z 1348 DE genů jako cíle RUNX1 (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

Abychom zjistili, zda funkční profil makrofágů lidského plaku odpovídá profilu myších makrofágů, porovnali jsme jej se sadou 39 genů M1 a M2 s expresí, která byla měřena u stimulovaných BMDM od diabetických versus kontrolních myší (obrázek 3G). Ty byly shrnuty pozitivní nebo negativní log násobnou změnou (diabetik versus kontrola) a porovnány s ekvivalentními změnami v makrofázích lidských plaků pacientů s diabetem 2. typu (oproti kontrole). Fisherův exaktní test ukázal významný vztah mezi soubory dat myšího BMDM a lidských plakových makrofágů pro geny upregulované nebo downregulované u diabetických versus kontrolních subjektů (P=00,0155; poměr pravděpodobnosti, 6,83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 genů ve srovnání s odpovídajícími nediabetickými kontrolami. Analýza obohacení genové sady změněných genů ukázala pozitivní obohacení ve stimulovaných diabetických PBMC (oproti kontrolám) na Hallmarkovy dráhy, včetně zánětlivé reakce (P=1.70×10−5) a signalizace IL-6 JAK STAT3 ( P=0.0221) a reaktomové dráhy, včetně produkce reaktivních forem kyslíku a reaktivních forem dusíku (P=0.0049), signalizace IL-/IL- (P=0.0110) a Toll-like receptor 1/2 kaskáda (P=0.0033). Tyto dráhy demonstrují, že tyto periferní buňky také vykazovaly vlastnosti primární percepce podobné těm, které uvádíme v BMDM od diabetických myší (obrázek 3G).

Konečně, aby se dále prozkoumala možnou kauzální roli RUNX1 v trénovaných imunitních reakcích vyvolaných hyperglykémií, BMDM, které byly dříve diferencované na fyziologickou nebo vysokou hladinu glukózy, byly obnoveny na 5 mmol/l glukózy a poté stimulovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti farmakologického RUNX. 1-specifický inhibitor Ro5-333551 (obrázek 8D). Buňky diferencované s vysokou hladinou glukózy vykazovaly zvýšenou expresi Il-6 (2-násobek, P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

Obrázek 8. Role trénované imunity vyvolané hyperglykémií RUNX1. Nejlepší 3 motivy transkripčního faktoru identifikované v testu pro transpozázou přístupné chromatinové sekvenování (ATAC-seq) dosahují vrcholů odlišně obohacených (A) nestimulovaných diabetických HSC (n=3) ve srovnání s nestimulovanými kontrolními hematopoetickými kmenovými buňkami (HSC); n{6 }}). Neřízené hierarchické shlukování odlišně exprimovaných genů z analýzy sekvenování RNA (RNA-seq) (B) diabetických (n=6) ​​nebo kontrolních (n=6) makrofágů odvozených z kostní dřeně (BM) (BMDM) stimulována lipopolysacharidem (LPS) plus interferonem- (IFN-). Bez dozoru hierarchické shlukování odlišně exprimovaných genů z (C) diabetických (n=8) nebo kontrolních (n=16) laserem zachycených mikrodisekovaných vzorků makrofágů lidských karotidových plaků. B a C, cílové geny transkripčního faktoru 1 souvisejícího s Runtem (Runx1) (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

DISKUSE

Vysoká míra kardiovaskulárních komplikací u pacientů s diabetem přetrvává i přes intenzivní kontrolu glukózy.52 Zde poskytujeme důkazy, že hyperglykémie indukuje trénovanou imunitu u HSC a makrofágů a že výrazně zhoršuje aterosklerózu. Ukazujeme, že hyperglykémie indukuje přetrvávající modifikace v BM HSC tím, že řídí aerobní glykolýzu, což vede ke konkrétním vzorům dostupnosti chromatinu, s důkazem prozánětlivého primárního stavu, který přetrvává do diferencovaných makrofágů. Naše zjištění implikují transkripční faktory, zejména RUNX1, jako mediátory trénované imunity. Farmakologická inhibice RUNX1 odstranila tyto projevy trénované imunity indukované hyperglykémií in vitro.

Změny v buněčném metabolismu mohou vyvolat trénovanou imunitu, termín, který označuje vrozenou imunitní paměť, která se může vyvinout po krátké stimulaci mikrobiálními produkty nebo endogenními aterogenními látkami, včetně oxidovaného LDL a lipoproteinu(a).53 Například trénovaná imunita indukovaná -glukanem , složka buněčné stěny Candida albicans, je zprostředkována aktivací dektinové-1–Akt–mTOR–HIF-1 dráhy, která způsobuje přechod z oxidativní fosforylace na aerobní glykolýzu (Warburgův efekt). 18 Několik metabolitů z glykolýzy a cyklu trikarboxylových kyselin působí jako kofaktory pro enzymy modifikující histony, které zase určují dostupnost chromatinu; například histonacetyltransferáza a deacetylázy vyžadují acetyl-CoA a NAD plus, zatímco demethylázy jako Tet a JmjC používají jako kofaktor -ketoglutarát.19,54 V poslední době je metabolická regulace exprese zánětlivého genu makrofágů přímo spojena s modifikací histonů acetylace odvozená ze zvýšené hladiny laktátu.55

Přímé vazby mezi metabolismem glukózy a epigenetickými modifikacemi, spolu s pozorováními naznačujícími hyperglykemickou paměť u pacientů s diabetem, nás vedly k hypotéze, že samotná hyperglykémie může řídit změny v buněčném metabolismu, což vede k vrozené imunitní paměti u diabetu. V případě -glukanu vedla zvýšená aerobní glykolýza v makrofázích ke zvýšené trimethylaci histonu 3 Lys4 (H3K4me3) a acetylaci histonu 3 Lys27 (H3K27ac). Oba tyto markery modifikace chromatinu byly zvýšeny v souvislosti s glykolýzou řízenou vysokým obsahem glukózy. Jak bylo prokázáno zde a v předchozích studiích, došlo k obohacení H3K4me3 na promotorech genů souvisejících se zánětem (např. Il-6) a metabolismem glukózy (např. Hk1).16,17 Meziprodukty cyklu trikarboxylových kyselin sukcinát a uvádí se, že fumarát působí jako antagonisté histonových a DNA demethyláz,54 a v souladu s tím jsme také zjistili, že metabolity cyklu trikarboxylových kyselin sukcinát a malát jsou v hyperglykemických buňkách zvýšené.

Metropolis et al20 ukázali, že v kontextu vrozené imunity indukované glukanem u progenitorů myeloidních buněk mohou cytokiny zprostředkovat trénovanou imunitu. Konkrétně inhibice IL-1 antagonistou receptoru anakinra inhibovala -glukanem indukovanou trénovanou imunitu. Ukázalo se také, že západní strava vyvolává epigenetické přeprogramování v progenitorových buňkách BM, což vede k trénované imunitě zprostředkované zánětem, což implikuje signální dráhy IL-1 do trénované imunity.56 Vzhledem k tomu, že IL-1 zprostředkovává mnoho patologických procesů u diabetu44 jsme zkoumali, zda IL-1 zesílí účinky vysoké glukózy při rozvoji trénované imunity. Ačkoli samotný diabetes vykazoval účinky na dostupnost chromatinu (s analýzou motivů implikujícími PU.1, RUNX1 a faktor vázající CCCTC), účinky IL-1 v kontextu buněk, které byly primovány diabetem, byly ještě výraznější ( a implikované ERG, ZNF263 [protein zinkového prstu 263] a RUNX1). To naznačuje hierarchický vztah, ve kterém byly makrofágy aktivovány hyperglykémií, ale projevovaly více floridních změn v reakci na druhý stimul.43 Je dobře známo, že změny stavů chromatinu na promotorech mohou být základem komplexních funkčních interakcí mezi různými stimuly aktivujícími makrofágy. Například, ačkoli IFN- není schopen aktivovat mnoho genů indukovatelných LPS, může indukovat acetylaci histonů a remodelaci chromatinu na jejich promotorech, a tím připravit buňku pro budoucí aktivaci v reakci na LPS.57

Analýza motivu v místech otevřeného chromatinu detekovala obohacení vazebných míst RUNX1. Z funkčního hlediska je RUNX1 nezbytný pro tvorbu a udržování HSC a diferenciaci různých linií.58 V monocytech a makrofázích spolupracuje RUNX1 s PU.1 (zde se také podílí) na regulaci faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (faktor stimulující kolonie -1), který je nezbytný pro přežití, diferenciaci a expanzi makrofágů.59 Relevantní pro efekty funkční paměti, které jsme pozorovali při adhezi monocytů, je RUNX1 také důležitým regulátorem interakcí monocytů a endotelu prostřednictvím regulace antigenu 1/CD11a spojeného s funkcí lymfocytů.31 Nakonec zánět zprostředkovaný Toll-like receptorem 4 a nadměrná exprese RUNX1 zvyšují produkci Toll-like receptor 4-indukovaného IL-6 a IL-1 prostřednictvím Vazba RUNX1 na jaderný faktor-κB podjednotku p50, synergizující jako transkripční koaktivátor.60 Celkově vzato existují důkazy o silné konvergenci funkce RUNX1 v makrofázích směrem k regulačním procesům, které jsou důležité v aterogenezi.

Proto jsme provedli křížové odkazy na geny pod domnělou kontrolou RUNX1 s transkripčními profily buněk odvozených z myších BMDM a v makrofázích z relevantního lidského in vivo nastavení. Makrofágy lidského aterosklerotického plátu a BMDM v přítomnosti diabetu vykazovaly DE genů regulovaných RUNX1-, včetně několika dříve spojených se zánětem a aterosklerózou.49,50 Naše práce rozšiřuje práci Alrdahe a kolegů,61 kteří nedávno prokázali že lidské makrofágy odvozené od diabetu kultivované po dobu 6 dnů in vitro udržují prozánětlivé priming a hyperpolarizují na prozánětlivý fenotyp, když jsou stimulovány LPS a IFN- nebo faktorem nekrózy nádorů-.

Je zajímavé, že některé z těchto cílových genů RUNX1 vykazují zvýšenou expresi v makrofázích plaků od pacientů s diabetem, jmenovitě CRNKL1 a PLA2G5, zatímco jiné, jako ZNF32 (protein zinkových prstů 32) a NUP214 (nukleoporin 214), vykazovaly nižší expresi u diabetiků oproti nediabetikům. plakové makrofágy. Ačkoli se to může zdát nekonzistentní, bylo prokázáno, že RUNX1 jak podporuje genovou expresi, tak působí jako transkripční represor.62 K tomu dochází primárně prostřednictvím náboru histonových deacetyláz, jako jsou HDAC1 a HDAC663, a histon methyltransferáz.62 Navíc fyzické interakce RUNX1 s chromatinem může přispět k identitě buněčného potomstva. Například narušení interakce RUNX1 během mitózy vede k přechodu z epitelu na mezenchym.64 Farmakologická inhibice RUNX1 pomocí Ro5-3335 normalizovala změněnou expresi zánětlivých genů související s trénovanou imunitou vyvolanou hyperglykémií in vitro. Cílený zásah proti RUNX1 poskytuje další důkaz o zapojení RUNX1 do následných účinků trénované imunity v makrofázích vyvolané hyperglykémií.

Indukce trénované imunity vyvolané hyperglykémií v periferních makrofázích sama o sobě mohla řídit progresi onemocnění, ale vzhledem k dlouhodobým účinkům trénované imunity a relativně krátké době života periferních myeloidních buněk jsme usoudili, že trénovaná imunita byla pravděpodobně také indukována na úrovni HSC, jak bylo nedávno prokázáno pro -glukan a dietu západního typu.20 Přestože předchozí studie typicky spojovaly epigenetické změny v trénované imunitě s fenotypem in vitro (např. produkce cytokinů), ukazujeme, jak trénovaná imunita přímo řídí progresi aterosklerózy, důležité patologie s integrální zánětlivou složkou. Transplantace BM z diabetických myší na normoglykemické myši náchylné k ateroskleróze měla výrazné účinky na progresi lézí a byla spojena se zvýšeným nekrotickým jádrem bohatým na lipidy, což je v souladu s agresivní formou aterosklerózy pozorovanou u diabetu u lidí.65

Tato studie je postavena na zkoumání účinků vysoké glukózy/hyperglykémie. Abychom mohli charakterizovat dlouhodobé účinky hyperglykémie, hlavní rysy diabetu, použili jsme streptozotocinový myší model diabetu spíše než myší model diabetu 2. studie o účincích glukózy. Mezi diabetem 1. a 2. typu jsou věcně důležité rozdíly. Hyperglykémie je však pro jejich diagnózu společná, u každé z nich zvyšuje kardiovaskulární riziko a po mnoho let je hlavním cílem léčby a sledování obou typů diabetu. Očekáváme, že nově identifikovaná trénovaná imunita vyvolaná hyperglykémií zde popsaná bude v budoucnu rozpracována tak, aby zohlednila specifičtější modulaci mnoha dalších potenciálních vlivů (např. dietní cukr,66 vzorce zvýšení glukózy,67 průvodní hyperlipidémie57).

Naše zjištění mají důležité důsledky pro léčbu aterosklerotických komplikací diabetu. Nejdůležitější je, že proaterogenní vlastnosti myeloidních buněk a prekurzorů BM přetrvávají i po normalizaci hladiny glukózy v krvi. To může pomoci vysvětlit nedostatečnou účinnost konvenční léčby a zásadním způsobem zpochybňovat přístup k řízení vaskulárního rizika a komplikací diabetu. Identifikace metabolických ovladačů a konkrétních epigenetických modifikací také doporučuje potenciální nové terapeutické cíle.

INFORMACE K ČLÁNKU

Přijato 27. února 2020; přijato 23. června 2021.

Afiliace

Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, UK (LE, NA, ATB, JB, JTC, MA, KZ, RA, TJC, MJC, KMC, RC, RPC). Výzkumné centrum CeMM pro molekulární medicínu Rakouské akademie věd, Vídeň, Rakousko (TK, AFR, CB). Divize fyziologické chemie II, Oddělení lékařské biochemie a biofyziky, Karolinska Institutet, Stockholm, Švédsko (HG-A., CEW). Klinika respirační medicíny a alergií (HG-A., CEW) a klinika medicíny (H7) (JL, MR), Karolinska University Hospital, Stockholm, Švédsko. The Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK (ALC, TEK, IAU). Institut umělé inteligence a podpory rozhodování, Centrum pro lékařskou statistiku, informatiku a inteligentní systémy, Lékařská univerzita ve Vídni, Rakousko (CB). Bioinfo, Plantagenet, ON, Kanada (MEL). Interní klinika, Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Nizozemsko (NPR., MGN). Oddělení pro genomiku a imunoregulaci, Ústav biologických a lékařských věd (LIMES), Univerzita v Bonnu, Německo (MGN).

Poděkování

Autoři děkují Lise Heather, Marii da Luz Sousa Fiahlo a Thomasi Milneovi za pomoc. RPC, NA a LE koncipovali studii. LE provedla všechny popsané in vitro experimenty, analýzy genové exprese a imunobloting. MA přispěl ke studiím na lidských vzorcích. CEW a HG-A. provedli metabolomiku založenou na hmotnostní spektrometrii. JTC provedla práci LCM s lidským plakovým makrofágem a přípravu čipu. LE provedl experimenty s bioanalyzátorem Seahorse pod vedením JB a pod dohledem MJCALC a provedl analýzu třídění buněk. LE připravil vzorky RNA-seq. LE připravil vzorky ATAC-seq pod vedením TEK a pod dohledem IAU. NA provedla všechny preparáty buněk sekvenujících ChIP. Sekvenování bylo provedeno TK a AFR pod dohledem CB. MEL a ATB provedly sekvenční srovnání dat, normalizaci a kontrolu kvality, přičemž LE provedla následnou analýzu. MEL a ATB provedly analýzu dat pomocí pole a sekvenování. KZ, RA a RC vedl vyšetřování zvířat. LE, NA, TJC, NPR a MGN se podílely na experimentálním návrhu a realizaci. RPC, LE, NA a MEL připravily rukopis. Všichni autoři si přečetli a schválili konečné odeslání rukopisu.

Zdroje financování

Tato práce byla podpořena British Heart Foundation Center of Research Excellence Oxford (RE/13/1/30181), British Heart Foundation Project Grant (Drs Akbar a Choudhury: PG/18/53/33895), National Institute for Health Research Oxford Biomedical Research Center, Tripartite Immunometabolism Consortium–Novo Nordisk Foundation (grant NNF15CC0018486; Drs Choudhury, Udalova, Rydén, Channon a Wheelock), Metabolite-Related Inflammation in Diabetes-Spectrum Diseases (Bey-Menovase Grounds Foundation: New Nordisk Targets , grant 0064142; Drs Choudhury, Udalova, Rydén a Channon) a 4-roční titul British Heart Foundation Ph.D. studentské studium a Doris Field Trust (Dr. Edgar). Skupina High-Throughput Genomics Group ve Wellcome Trust Center for Human Genetics byla financována grantem Wellcome Trust s referenčním číslem 090532/Z/09/Z a grantem MRC Hub G0900747 91070. Zařízení biomedicínského sekvenování ve Výzkumném centru CeMM pro molekulární medicínu Rakouské akademie věd ve Vídni Rakousko. Drs Riksen a Netea obdrželi finanční prostředky z programu Evropské unie pro výzkum a inovace Horizont 2020 na základě grantové dohody 667837. Dr. Netea byl podpořen grantem ERC Consolidator Grant (č. 310372) a Nizozemskou organizací pro vědecký výzkum.

Zveřejnění

Žádný.

Doplňkové materiály

Doplňkové obrázky I–XI

Datová příloha Soubory Excel I–VII

REFERENCE

1. Americká diabetická asociace. Kardiovaskulární onemocnění a řízení rizik. Péče o diabetes. 2015;38:S49–S57. doi: 10,2337/dc15-S011

2. Nathan DM, Cleary PA, Backlund JY, Genuth SM, Lachin JM, Orchard TJ, Raskin P, Zinman B; Studie výzkumné skupiny pro kontrolu a komplikace diabetu/epidemiologie intervencí a komplikací diabetu (DCCT/EDIC). Intenzivní léčba diabetu a kardiovaskulárních onemocnění u pacientů s diabetem 1. typu. N Engl J Med. 2005;353:2643–2653. doi: 10.1056/NEJMoa052187

3. Nathan DM, Genuth S, Lachin J, Cleary P, Crofford O, Davis M, Rand L, Siebert C, Diabetes Control and Complications Trial Research Group. Vliv intenzivní léčby diabetu na rozvoj a progresi dlouhodobých komplikací u inzulin-dependentního diabetes mellitus. N Engl J Med. 1993;329:977–986. doi: 10.1056/NEJM199309303291401

4. ACCORD, Gerstein HC, Miller ME, Genuth S, Ismail-Beigi F, Buse JB, Goff DC Jr, Probstfield JL, Cushman WC, Ginsberg HN, Bigger JT, et al. Dlouhodobé účinky intenzivního snižování glukózy na kardiovaskulární výsledky. N Engl J Med. 2011;364:818–828. doi: 10.1056/NEJMoa1006524

5. Zinman B, Wanner C, Lachin JM, Fitchett D, Bluhmki E, Hantel S, Mattheus M, Devins T, Johansen OE, Woerle HJ a kol; VÝSLEDEK EMPA-REG Vyšetřovatelé. Empagliflozin, kardiovaskulární výsledky a mortalita u diabetu 2. typu. N Engl J Med. 2015;373:2117–2128. doi: 10.1056/NEJMoa1504720

6. Newman JD, Vani AK, Aleman JO, Weintraub HS, Berger JS, Schwartzbard AZ. Měnící se krajina léčby diabetu pro snížení kardiovaskulárního rizika: JACC aktuální přehled. J Am Coll Cardiol. 2018;72:1856– 1869. doi: 10.1016/j.jacc.2018.07.071

7. Chalmers J, Cooper ME. UKPDS a efekt dědictví. N Engl J Med. 2008;359:1618–1620. doi: 10.1056/NEJMe0807625

8. Moore KJ, Sheedy FJ, Fisher EA. Makrofágy v ateroskleróze: dynamická rovnováha. Nat Rev Immunol. 2013;13:709–721. doi: 10.1038/nri3520

9. Martinez FO, Gordon S. Paradigma M1 a M2 aktivace makrofágů: čas na přehodnocení. F1000Prime Rep. 2014;6:13. doi: 10.12703/P6-13

10. Parathath S, Grauer L, Huang LS, Sanson M, Distel E, Goldberg IJ, Fisher EA. Diabetes nepříznivě ovlivňuje makrofágy během regrese aterosklerotického plátu u myší. Diabetes. 2011;60:1759–1769. doi: 10,2337/db10-0778

11. Shanmugam N, Reddy MA, Guha M, Natarajan R. Vysoká glukózou indukovaná exprese prozánětlivých cytokinových a chemokinových genů v monocytárních buňkách. Diabetes. 2003;52:1256–1264. doi: 10.2337/diabetes.52.5.1256

12. O'Neill LA, Pearce EJ. Imunometabolismus řídí funkci dendritických buněk a makrofágů. J Exp Med. 2016;213:15–23. doi: 10.1084/jem.20151570

13. Vats D, Mukundan L, Odegaard JI, Zhang L, Smith KL, Morel ČR, Wagner RA, Greaves DR, Murray PJ, Chawla A. Oxidativní metabolismus a PGC-1beta zmírňují zánět zprostředkovaný makrofágy. Cell Metab. 2006;4:13– 24. doi: 10.1016/j.cmet.2006.05.011

14. Tannahill GM, Curtis AM, Adamik J, Palsson-McDermott EM, McGettrick AF, Goel G, Frezza C, Bernard NJ, Kelly B, Foley NH a kol. Sukcinát je zánětlivý signál, který indukuje IL-1 prostřednictvím HIF-1. Příroda. 2013;496:238–242. doi: 10.1038/příroda11986

15. Renner K, Singer K, Koehl GE, Geissler EK, Peter K, Siska PJ, Kreutz M. Metabolické znaky nádorových a imunitních buněk v nádorovém mikroprostředí. Front Immunol. 2017;8:248. doi: 10.3389/fimmu.2017.00248

16. Stienstra R, Netea-Maier RT, Riksen NP, Joosten LAB, Netea MG. Specifické a komplexní přeprogramování buněčného metabolismu v myeloidních buňkách během vrozených imunitních reakcí. Cell Metab. 2017;26:142–156. doi: 10.1016/j.cmet.2017.06.001

17. Bekkering S, Arts RJW, Novakovic B, Kourtzelis I, van der Heijden CDCC, Li Y, Popa CD, Ter Horst R, van Tuijl J, Netea-Maier RT a kol. Metabolické navození trénované imunity prostřednictvím mevalonátové dráhy. Buňka. 2018;172:135–146.e9. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.025

18. Cheng SC, Quintin J, Cramer RA, Shepardson KM, Saeed S, Kumar V, Giamarellos-Bourboulis EJ, Martens JH, Rao NA, Aghajanirefah A, et al. mTOR- a HIF-1 -zprostředkovaná aerobní glykolýza jako metabolický základ pro trénovanou imunitu. Věda. 2014;345:1250684. doi: 10.1126/ science.1250684

19. Donohoe DR, Bultman SJ. Metaboloepigenetika: vzájemné vztahy mezi energetickým metabolismem a epigenetickou kontrolou genové exprese. J Cell Physiol. 2012;227:3169–3177. doi: 10.1002/jcp.24054

20. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzybek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, et al. Modulace progenitorů myelopoézy je nedílnou součástí trénované imunity. Buňka. 2018;172:147– 161.e12. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.03421. Choudhury RP, Rong JX, Trogan E, Elmalem VI, Dansky HM, Breslow JL, Witztum JL, Fallon JT, Fisher EA. Lipoproteiny s vysokou hustotou zpomalují progresi aterosklerózy a příznivě remodelují léze bez potlačení projevů zánětu nebo oxidace. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:1904–1909. doi: 10.1161/01.ATV.0000142808.34602.25

22. Feig JE, Vengrenyuk Y, Reiser V, Wu C, Statnikov A, Aliferis CF, Garabedian MJ, Fisher EA, Puig O. Regrese aterosklerózy je charakterizována širokými změnami v transkriptomu makrofágů plaku. PLoS One. 2012;7:e39790. doi: 10.1371/journal.pone.0039790

23. Trogan E, Choudhury RP, Dansky HM, Rong JX, Breslow JL, Fisher EA. Laserová záchytná mikrodisekční analýza genové exprese v makrofázích z aterosklerotických lézí myší s deficitem apolipoproteinu E. Proč Natl Acad Sci USA. 2002;99:2234–2239. doi: 10.1073/pnas.042683999

24. Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, Bravo HC, Davis S, Gatto L, Girke T a kol. Uspořádání vysoce výkonné genomické analýzy pomocí Bioconductor. Metody Nat. 2015;12:115–121. doi: 10.1038/nmeth.3252

25. Dunning MJ, Smith ML, Ritchie ME, Tavaré S. Beadarray: R třídy a metody pro data založená na perličkách Illumina. Bioinformatika. 2007;23:2183– 2184. doi: 10.1093/bioinformatics/btm311

26. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. Limma pohání diferenciální expresní analýzy pro sekvenování RNA a mikročipové studie. Nucleic Acids Res. 2015;43:e47. doi: 10.1093/nar/gkv007

27. Kamleh MA, Snowden SG, Grapov D, Blackburn GJ, Watson DG, Xu N, Ståhle M, Wheelock CE. Metabolomika LC-MS u pacientů s psoriázou odhaluje zvýšení cirkulujících aminokyselin v závislosti na závažnosti onemocnění, které se zlepšuje léčbou anti-TNF. J Proteome Res. 2015;14:557–566. doi: 10.1021/pr500782g

28. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: metoda pro testování dostupnosti chromatinu v celém genomu. Curr Protoc Mol Biol. 2015;109:21.29.1–21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109

29. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W a kol. Modelová analýza ChIPSeq (MACS). Genome Biol. 2008;9:R137. doi: 10,1186/gb-2008-9-9-r137

30. Ross-Innes CS, Stark R, Teschendorff AE, Holmes KA, Ali HR, Dunning MJ, Brown GD, Gojis O, Ellis IO, Green AR a kol. Diferenciální vazba na estrogenový receptor je spojena s klinickými výsledky u rakoviny prsu. Příroda. 2012;481:389–393. doi: 10.1038/příroda10730

31. Puig-Kröger A, Sanchez-Elsner T, Ruiz N, Andreu EJ, Prosper F, Jensen UB, Gil J, Erickson P, Drabkin H, Groner Y a kol. Faktory RUNX/AML a C/EBP regulují expresi CD11a integrinu v myeloidních buňkách prostřednictvím překrývajících se regulačních prvků. Krev. 2003;102:3252–3261. doi: 10,1182/ krev-2003-02-0618

32. McLean CY, Bristor D, Hiller M, Clarke SL, Schaar BT, Lowe CB, Wenger AM, Bejerano G. GREAT zlepšuje funkční interpretaci cis-regulačních oblastí. Nat Biotechnol. 2010;28:495–501. doi: 10.1038/not.1630

33. Machanick P, Bailey TL. MEME-ChIP: analýza motivů velkých souborů dat DNA. Bioinformatika. 2011;27:1696–1697. doi: 10.1093/bioinformatics/btr189

34. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, ​​Chaisson M, Gingeras TR. STAR: ultrarychlý univerzální zarovnávač RNA-seq. Bioinformatika. 2013;29:15–21. doi: 10.1093/bioinformatics/bts635

35. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Diferenciální expresní analýza multifaktorových RNA-Seq experimentů týkajících se biologické variace. Nucleic Acids Res. 2012;40:4288–4297. doi: 10.1093/nar/gks042

36. Kolde R. Pretty Heatmap. 2015. Zpřístupněno 24. června 2021. https://rdrr.io/ can/heatmap/

37. Freemerman AJ, Johnson AR, Sacks GN, Milner JJ, Kirk EL, Troester MA, Macintyre AN, Goraksha-Hicks P, Rathmell JC, Makowski L. Metabolické přeprogramování makrofágů: metabolismus glukózy zprostředkovaný transportérem glukózy 1 (GLUT1) prozánětlivý fenotyp. J Biol Chem. 2014;289:7884–7896. doi: 10.1074/jbc.M113.522037

38. Herbin O, Regelmann AG, Ramkhelavon B, Weinstein EG, Moore KJ, Alexandropoulos K. Adheze monocytů a nábor plaků během rozvoje aterosklerózy jsou regulovány adaptorovým proteinem ChatH/SHEP1. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016;36:1791–1801. doi: 10.1161/ATVBAHA.116.308014

39. Luo Y, Duan H, Qian Y, Feng L, Wu Z, Wang F, Feng J, Yang D, Qin Z, Yan X. Makrofagický CD146 podporuje tvorbu a retenci pěnových buněk během aterosklerózy. Cell Res. 2017;27:352–372. doi: 10.1038/cr.2017.8

40. Iqbal AJ, McNeill E, Kapellos TS, Regan-Komito D, Norman S, Burd S, Smart N, Machemer DE, Stylianou E, McShane H, et al. Lidské CD68 promotorové GFP transgenní myši umožňují analýzu diferenciace monocytů na makrofágy in vivo. Krev. 2014;124:e33–e44. doi: 10,1182/krev-2014-04-568691

41. Arts RJW, Carvalho A, La Rocca C, Palma C, Rodrigues F, Silvestre R, Kleinnijenhuis J, Lachmandas E, Gonçalves LG, Belinha A a kol. Imunometabolické dráhy v BCG-indukované trénované imunitě. Cell Rep. 2016;17:2562–2571. doi: 10.1016/j.celrep.2016.11.011

42. Moorlag SJCFM, Röring RJ, Joosten LAB, Netea MG. Role interleukin-1 rodiny v trénované imunitě. Immunol Rev. 2018;281:28–39. doi: 10.1111/nebo.12617

43. Herder C, Dalmas E, Böni-Schnetzler M, Donath MY. Dráha IL-1 u diabetu 2. typu a kardiovaskulárních komplikací. Trendy Endocrinol Metab. 2015;26:551–563. doi: 10.1016/j.tem.2015.08.001

44. Engelbertsen D, Rattik S, Wigren M, Vallejo J, Marinkovic G, Schiopu A, Björkbacka H, ​​Nilsson J, Bengtsson E. IL-1R a signalizace MyD88 v CD4 plus T buňkách podporují imunitu Th17 a aterosklerózu . Cardiovasc Res. 2018;114:180–187. doi: 10.1093/cvr/cvx196

45. Nagareddy PR, Kraakman M, Masters SL, Stirzaker RA, Gorman DJ, Grant RW, Dragoljevic D, Hong ES, Abdel-Latif A, Smyth SS a kol. Makrofágy tukové tkáně podporují myelopoézu a monocytózu u obezity. Cell Metab. 2014;19:821–835. doi: 10.1016/j.cmet.2014.03.029

46. ​​Bevington SL, Cauchy P, Piper J, Bertrand E, Lalli N, Jarvis RC, Gilding LN, Ott S, Bonifer C, Cockerill PN. Inducibilní aktivace chromatinu je spojena s vytvořením imunologické paměti v T buňkách. EMBO J. 2016;35:515–535. doi: 10.15252/bj.201592534

47. Buske FA, Bodén M, Bauer DC, Bailey TL. Přiřazení rolí regulačním motivům DNA pomocí komparativní genomiky. Bioinformatika. 2010;26:860–866. doi: 10.1093/bioinformatics/btq049

48. Puig O, Yuan J, Stepaniants S, Zieba R, Zycband E, Morris M, Coulter S, Yu X, Menke J, Woods J a kol. Signatura genové exprese, která klasifikuje lidský aterosklerotický plak podle stavu relativního zánětu. Circ Cardiovasc Genet. 2011;4:595–604. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.111.960773

49. Turner RJ, Bushnell CD, Register TC, Sharp FR. Pohlavně závislé korelace tloušťky karotidové intimy-media s genovou expresí v krvi. Transl Stroke Res. 2011;2:171–178. doi: 10.1007/s12975-011-0066-4

50. Webb NR, Bostrom MA, Szilvassy SJ, van der Westhuyzen DR, Daugherty A, de Beer FC. Sekreční fosfolipáza A2 skupiny IIA exprimovaná makrofágy zvyšuje tvorbu aterosklerotických lézí u myší s deficitem LDL receptoru. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:263–268. doi: 10.1161/01.atv.0000051701.90972.e5

51. Cunningham L, Finckbeiner S, Hyde RK, Southall N, Marugan J, Yedavalli VR, Dehdashti SJ, Reinhold WC, Alemu L, Zhao L a kol. Identifikace benzodiazepinu Ro5-3335 jako inhibitoru CBF leukémie prostřednictvím kvantitativního vysoce výkonného screeningu proti interakci RUNX1-CBF. Proč Natl Acad Sci USA. 2012;109:14592–14597. doi: 10.1073/pnas.1200037109

52. Reaven PD, Emanuele NV, Wiitala WL, Bahn GD, Reda DJ, McCarren M, Duckworth WC, Hayward RA; Vyšetřovatelé VADT. Intenzivní kontrola glukózy u pacientů s diabetem 2. typu: 15-roční sledování. N Engl J Med. 2019;380:2215–2224. doi: 10.1056/NEJMoa1806802

53. Arts RJ, Joosten LA, Netea MG. Imunometabolické okruhy v trénované imunitě. Semin Immunol. 2016;28:425–430. doi: 10.1016/j.smim.2016.09.00254. Quintin J, Saeed S, Martens JHA, Giamarellos-Bourboulis EJ, Ifrim DC, Logie C, Jacobs L, Jansen T, Kullberg BJ, Wijmenga C a kol. Infekce Candida albicans poskytuje ochranu proti reinfekci prostřednictvím funkčního přeprogramování monocytů. Buněčný hostitelský mikrob. 2012;12:223–232. doi: 10.1016/j. com.2012.06.006

55. Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, Liu W, Kim S, Lee S, Perez-Neut M, et al. Metabolická regulace genové exprese acetylací histonů. Příroda. 2019;574:575–580. doi: 10,1038/s41586-019-1678-1

56. Christ A, Günther P, Lauterbach MAR, Duewell P, Biswas D, Pelka K, Scholz CJ, Oosting M, Haendler K, Baßler K, et al. Západní strava spouští NLRP3-závislé přeprogramování vrozené imunity. Buňka. 2018;172:162–175.e14. doi: 10.1016/j.cell.2017.12.013

57. Glass CK, Natoli G. Molekulární kontrola aktivace a primingu v makrofázích. Nat Immunol. 2016;17:26–33. doi: 10.1038/ni.3306

58. Voon DC, Hor YT, Ito Y. Komplex RUNX: překračování hematopoézy do imunity. Imunologie. 2015;146:523–536. doi: 10.1111/imm.12535

59. Himes SR, Cronau S, Mulford C, Hume DA. Transkripční faktor Runx1 řídí růst a přežívání makrofágů-1-závislý a nezávislý na CSF. Onkogen. 2005;24:5278–5286. doi: 10.1038/SJ. onc.1208657

60. Zhang S, Yu M, Guo Q, Li R, Li G, Tan S, Li X, Wei Y, Wu M. Annexin A2 se váže na endozomy a negativně reguluje TLR4-spouštěné zánětlivé reakce prostřednictvím TRAM- cesta TRIF. Sci Rep. 2015;5:15859. doi: 10.1038/srep15859

61. Alrdahe S, Al Sadoun H, Torbica T, McKenzie EA, Bowling FL, Boulton AJM, Mace KA. Dysregulace vývoje makrofágů a fenotypu u diabetických lidských makrofágů může být zachráněna transdukcí proteinu Hoxa3. PLoS One. 2019;14:e0223980. doi: 10.1371/journal.pone.0223980

62. Durst KL, Hiebert SW. Role členů rodiny RUNX v transkripční represi a umlčování genů. Onkogen. 2004;23:4220–4224. doi: 10.1038/sj.onc.1207122

63. Amann JM, Nip J, Strom DK, Lutterbach B, Harada H, Lenny N, Downing JR, Meyers S, Hiebert SW. ETO, cíl t(8;21) u akutní leukémie, vytváří zřetelné kontakty s více histonovými deacetylázami a váže mSin3A prostřednictvím své oligomerizační domény. Mol Cell Biol. 2001;21:6470–6483. doi: 10.1128/MCB.21.19.{12}}.2001

64. Rose JT, Moskovitz E, Boyd JR, Gordon JA, Bouffard NA, Fritz AJ, Illendula A, Bushweller JH, Lian JB, Stein JL, et al. Inhibice komplexu transkripčního faktoru RUNX1-CBF ohrožuje identitu epiteliálních buněk mléčné žlázy: fenotyp potenciálně stabilizovaný bookmarkingem mitotických genů. Oncotarget. 2020;11:2512–2530. doi: 10.18632/oncotarget.27637

65. Moreno PR, Murcia AM, Palacios IF, Leon MN, Bernardi VH, Fuster V, Fallon JT. Koronární složení a infiltrace makrofágy ve vzorcích aterektomie od pacientů s diabetes mellitus. Oběh. 2000;102:2180– 2184. doi: 10.1161/01.cir.102.18.2180

66. Perazza LR, Mitchell PL, Jensen BAH, Daniel N, Boyer M, Varin TV, Bouchareb R, Nachbar RT, Bouchard M, Blais M a kol. Dietní sacharóza indukuje metabolický zánět a aterosklerotická kardiovaskulární onemocnění více než dietní tuk u LDLr-/-ApoB100/100 myší. Ateroskleróza. 2020;304:9–21. doi: 10.1016/j.aterosclerosis.2020.05.002

67. Flynn MC, Kraakman MJ, Tikellis C, Lee MKS, Hanssen NMJ, Kammoun HL, Pickering RJ, Dragoljevic D, Al-Sharea A, Barrett TJ a kol. Přechodná intermitentní hyperglykémie urychluje aterosklerózu tím, že podporuje myelopoézu. Circ Res. 2020;127:877–892. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.120. 316653

Laurence Edgar, DPhil*; Naveed Akbar, Ph.D.*; Adam T. Braithwaite, Ph.D.; Thomas Krausgruber, Ph.D.; Héctor Gallart-Ayala, Ph.D.; Jade Bailey, DPhil; Alastair L. Corbin, DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; Joshua T. Chai, DPhil; Mohammad Alkhalil, DPhil; André F. Rendeiro, Ph.D.; Klemen Ziberna, DPhil; Ritu Arya, MRes; Thomas J. Cahill, DPhil; Christoph Bock, Ph.D.; Jurga Laurencikiene, Ph.D.; Mark J. Crabtree, Ph.D.; Madeleine E. Lemieux, Ph.D.; Niels P. Riksen, MD, Ph.D.; Mihai G. Netea, MD, Ph.D.; Craig E. Wheelock, Ph.D.; Keith M. Channon, MD; Mikael Rydén, MD, Ph.D.; Irina A. Udalová, Ph.D.; Ricardo Carnicer, Ph.D.; Robin P. Choudhury, DM.

For more information:1950477648nn@gmail.com