Jak chránit renální tubulární buňky postižené apoptózou vyvolanou gentamicinem?

Ochranné účinky Zhibai Dihuang Wan na renální tubulární buňky postižené apoptózou vyvolanou gentamicinem

Další informace:{0}}

klíčová slova: Akutní ledvinachoroba, Apoptóza, Gentamicin,Renální tubulární buňka, ledvina.

Abstraktní

Etnofarmakologický význam: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) je starověká tradiční čínská medicína složená z osmi rostlinných složek a používá se k léčbě chronickýchledvinazánětů a cukrovky po tisíce let. Nicméně vliv ZDW na akutníledvinazranění je stále neznámé. Měli jsme v úmyslu identifikovat vliv ZDW na buněčný růst agentamicin- indukované apoptotické poškození vrenální tubulární buňky.

Materiály a metody: Extrahovali jsme ZDW umělou střevní tekutinou a léčili potkanarenální tubulární buňky(NRK-52E) s různými koncentracemi extrakce ZDW. Buněčná proliferace agentamicin-indukovanýapoptózaNRK-52E buněk bylo hodnoceno pomocí monitorování proliferace v reálném čase a barvení annexinem V, v daném pořadí. Western blotting byl použit k vyhodnocení úrovní exprese Bcl-2 a kaspázy-3. Účinek ZDW nagentamicin-indukovanýledvinaporanění bylo také monitorováno u myší pomocí terminálního deoxynukleotidyltransferázou zprostředkovaného biotinylovaného UTP nick end značení (TUNEL) testu a měření sérového kreatininu a dusíku močoviny v krvi.

Výsledky: Zjistili jsme, že 30 μg/ml ZDW podporuje proliferaci buněk potkanarenální tubulární buňky. ZDW také vyjádřil na dávce závislý ochranný účinek protigentamicin-indukovanýapoptózav buňkách. Předúprava 3 μg/ml nebo 30 μg/ml ZDW maximálně zvýšila Bcl-2 a snížila štěpenou kaspázu-3 vgentamicin-ošetřené buňky NRK-52E. Z rostlinných složek ZDW pouze Phellodendron amurense Rupr., kůra (Cortex Phellodendri) a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek inhibovaly oběgentamicin-indukované snížení Bcl-2 a zvýšení štěpené kaspázy-3. Phellodendron amurense Rupr., kůra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek také inhibovángentamicin-indukovanýapoptózapři určitých koncentracích; tyto dvě složky však byly méně účinné než ZDW. V modelu myšigentamicinpři nefropatii, léčba ZDW významně snížila apoptotické buňky v kůře ledvin a zlepšila funkci ledvin.

Závěry: Naše výsledky naznačují, že ZDW při adekvátních dávkách zeslabujegentamicin- indukované apoptotické poškození vrenální tubulární buňkya také chráníledvinyzgentamicin- indukované poranění u myší.

1. Úvod

Bylinné léky se používají k léčbě různých nemocí po mnoho staletí, zejména v čínské společnosti. V poslední době se potenciální vedlejší účinky bylin naledvinabyly hlášeny (Isnard Bagnis et al., 2004). V roce 1991 nefrologové v Belgii informovali o mnoha mladých ženách, které požily výtažky z čínských bylin obsahujících Aristolochia fang chi v dietních režimech, které vykazovaly různé stupně selhání ledvin (Vanherweghem et al., 1993). Bylo prokázáno, že expozice neúmyslně přidané rostlině Aristolochia obsahující kyselinu aristolochovou (AA) je hlavní příčinou poškození ledvin, atypií uroteliálních buněk a karcinomu (De Broe, 2012). Vzhledem k tomu, že tradiční čínská medicína je obecně praktikována na Tchaj-wanu a v pevninské Číně, AA nefropatie převládá v těchto oblastech a představuje potenciální problém veřejného zdraví (Grollman, 2013). Většina nefrologů na Tchaj-wanu doporučuje pacientům, aby se vyhýbali tradiční bylinné medicíně. Nicméně některé tradiční bylinné léky se ukázaly jako slibné v léčběledvinaonemocnění v preklinických studiích nebo klinických studiích (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Přestože je nezbytné vyhnout se používání rostlin Aristolochia v rostlinných lécích, rostlinné léky jsou stále potenciálními kandidáty na léčbu některýchledvinanemocí.

Klikněte pro efekty Cistanche pro nadledvinky

Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), polybylinný přípravek, se používá k léčbě chronických onemocněníledvinazánětů a cukrovky po tisíce let. ZDW se vyrábí z Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8 procenta), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený (Radix Rehmanniae preparata, 27,6 procenta), Dioscorea oppositifolia L. (13,8 procenta), Phellopr. amurense (Cortex Phellodendri, 6,9 procenta), Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek (6,9 procenta), Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra (Moutan Cortex, 10,3 procenta), Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek (Rhizomatis co.10ma Alis) (Schw.) Wolf (10,3 procenta), a neobsahuje Aristolochia. Mezi těmito složkami jsou Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, Phellodendron amurense Rupr., kůra a kokosové ořechy Poria jsou uváděny jako prospěšné pro diabetickou nefropatii nebo chronické poškození ledvin na zvířecích modelech (Yokozawa a kol., 2004; Kim a kol., 2008; Jiang a kol., 2012; Zhao a kol., 2013). ZDW bez Anemarrhena asphodeloides Bunge a Phellodendron amurense Rupr., kůra měla také částečný ochranný účinek na časnou diabetickou nefropatii u potkanů ​​(He et al., 2007). Tato zjištění naznačují, že ZDW má potenciálně ochranné účinky proti poškození ledvin. Nicméně vliv ZDW na buněčný růst aapoptózazrenální tubulární buňkyje stále nejasné.

Gentamicinje široce používané aminoglykosidové antibiotikum k léčbě gramnegativních bakteriálních infekcí, ale vyvolává akutníledvinaporanění asi u 30 procent pacientů (Singh et al., 2012). V renálních proximálních tubulárních buňkách indukujícíapoptózaje klíčovým cytotoxickým mechanismemgentamicin(Servais et al., 2006).Gentamicinnavozujeapoptózaprostřednictvím mitochondriemi zprostředkované signální dráhy, včetně snížení Bcl-xL a zvýšení štěpené kaspázy-3 a -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). K dnešnímu dni neexistuje žádný ideální klinický lék, kterému by bylo možné předcházetgentamicin- vyvolané akutníledvinazranění. V této studii jsme zkoumali vliv ZDW nagentamicin-indukovanýapoptózavrenální tubulární buňkyin vitro a in vivo. Naše data odhalila ochranný účinek ZDW nagentamicin-léčenorenální tubulární buňkya dále prokázal příspěvek jeho složek k ochrannému účinku ZDW.

2. Materiály a metody

2.1. Reagencie a příprava ZDW

Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), fetální telecí sérum a činidla pro tkáňové kultury byly získány od Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Všechny ostatní chemikálie reagenční čistoty byly získány od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). Prášky ZDW (šarže č. 051941) a jeho přísady (Cornus officinalis Siebold & Zucc, šarže č. C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, šarže č. C730N; Dioscorea oppositifolia L., šarže č. C624N; Phellodendron amurense Rupr., kůra, šarže č. C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek, šarže č. C805N; Paeonia sufruticosa, Andrews sufruticosa šarže č. C813Y, Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek, šarže č. C819N, Poria cocos (Schw.) Wolf, šarže č. C827N) byly zakoupeny od SunTen Pharmaceutical Co. (Taipei, Taiwan). Podle pokynů výrobce 29 g 8-bylinné směsi (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., kůra, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek a 3 g Poria cocos (Schw.) Wolf) byl uvařen v 290 ml destilované vody po dobu 4 hodin při 100 1C, přefiltrována, lyofilizována za získání 7,5 g suchých extraktů a poté smíchána s 2,2 g kukuřičného škrobu a 5,3 g práškové celulózy za vzniku 15 g ZDW. Všechny bylinky byly ověřeny profesorem herbologie z Brion Research Institute of Taiwan, ROC. Vzorky voucherů byly uloženy v Herbáři Národního výzkumného institutu čínské medicíny, Taiwan, ROC (čísla voucherů: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. – NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., kůra – NHP-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek – NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra – NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek – NHP-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf – NHP -00309). Rostlinné léky (0,1 g) byly tráveny 1 ml umělé střevní tekutiny (1 procento pankreatinu, 50 mM dihydrogenfosforečnanu draselného, ​​pH 7,5) při 37 1C po dobu 2 hodin, filtrovány přes 0.{58}} μ m filtry a poté aplikovány v buněčných experimentech. Kromě toho byla samotná umělá střevní tekutina také inkubována při 37 1C po dobu 2 hodin, filtrována přes 0,{62}} μm filtry a poté aplikována v kontrolních skupinách.

2.2. Analýza otisků prstů pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC)

Kvalita ZDW byla měřena pomocí HPLC. Stručně řečeno, {{0}},1 g prášku ZDW bylo rozpuštěno v démonické vodě při pokojové teplotě po dobu 2 hodin, přefiltrováno přes {{10}}.22- μm filtry a poté aplikovány v HPLC analýze. Sto μl roztoku bylo naneseno na 250 4,6 mm C18-kolonu (Grace. Columbia, USA) pomocí systému Waters HPLC vybaveného 60{{18 }} řadič a detektor 996 fotodiodového pole (Waters, St. Massachusetts, USA). Vzorek byl poté eluován 0–95% lineárním gradientem methanolu v démonické vodě, pH 7,0, po dobu 60 minut při průtoku 0,8 ml/min. Eluenty byly detekovány a kvantifikovány při 254 nm od 0 min do 60 min při teplotě místnosti. Analýza byla provedena 10krát a výsledky jsou konzistentní.

2.3. Buněčná kultura

Zakoupili jsme potkaní renální proximální tubulární buňky (NRK-52E) od Bioresource Collection and Research Center (Hsinchu, Taiwan). Buňky byly kultivovány v DMEM doplněném antibiotickým/antifungálním roztokem a 10% fetálním bovinním sérem. Byly pěstovány, dokud se monovrstva nestala splývající. Kultivované buňky pak byly kultivovány v médiu bez séra přes noc před experimentem. Extrakty ZDW umělou střevní tekutinou byly přidány k hladovějícím buňkám v uvedené koncentraci a inkubovaná umělá střevní tekutina byla aplikována jako kontrolní léčba. Po 24 hodinách inkubace byly vzorky buněk sklizeny a aplikoványapoptózaanalýza a analýza Western blotting.

2.4. Monitorování buněčné proliferace v reálném čase

Ke sledování buněčné proliferace jsme použili systém „xCELLigence“ od Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN, USA). NRK-52E buňky byly nasazeny v duplikátech na E-plotny v hustotě 10 000 buněk/jamku. E-destičky byly poté přeneseny do přístroje xCELLi-glance RTCA DP pro automatizované monitorování v reálném čase ve zvlhčovaném inkubátoru obsahujícím 5 procent CO2 při 37 1C. Po 24 hodinách byly buňky v E-deskách přes noc ponechány hladovět. Pro test proliferace byly k buňkám přidány extrakty ZDW po dobu 30 minut a poté 3 mmol/lgentamicinbyl přidán do buněk. Buněčný index, libovolná jednotka odrážející impedanci buňky-senzor, byl měřen každých 15 minut. Výpočet sklonu byl proveden pomocí softwaru RTCA verze 1.2 (Roche Applied Sciences). Byly provedeny tři nezávislé experimenty.

2.5. Detekce apoptózy

K detekci bylo použito dvojité barvení fluorescein isothiokyanát (FITC)-annexin V/propidiumjodid (PI).apoptózavyvolanýgentamicinléčba. Ošetřené buňky NRK{0}}E byly sklizeny a dvakrát promyty ledově chladným fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS). Specifická vazba FITC-annexinu V a obarvená PI byla provedena za použití anexinuapoptózadetekční souprava (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, USA), podle pokynů výrobce. Buňky byly poté analyzovány pomocí průtokové cytometrie.

2.6. Western blot analýza

Dvacet mikrogramů proteinového lyzátu NRK{0}}E bylo aplikováno do každé dráhy blotovacího proužku a analyzováno Western blotem. Protilátky pro Bcl-2 a kaspázu-3 byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) a pro test naředěny v poměru 1:1000. Glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) byla detekována jako kontrola nanášení. Relativní hladiny proteinových pásů byly kvantifikovány pomocí softwaru Quantiscan (Biosoft, Cambridge, Spojené království).

2.7. Zvířata a léčba

Samci myší BALB/c ve věku 8 týdnů a o hmotnosti 20–25 g byli získáni od BioLasco Taiwan (Taipei, Taiwan). Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro experimentální péči o zvířata a použití na lékařské univerzitě v Taipei. Zvířata byla umístěna v centrálním zařízení, podrobena 12-hodinovému cyklu světlo-tma a byla jim poskytnuta běžná potrava pro potkany a voda z vodovodu. Experimentální skupina myší (n¼6) progentamicinléčení byly podrobeny intraperitoneální (IP) injekci sgentamicin(20 mg/kg/den) po dobu 10 dnů. Prášek ZDW (1 nebo 2 g/kg) byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a předtím orálně podángentamicininjekci pokaždé. Myším v kontrolní skupině (n=6) byl orálně a intraperitoneálně podáván fyziologický roztok. Všechny myši byly anestetizovány pomocí pentobarbitalu 30–50 mg/kg tělesné hmotnosti intraperitoneálně (Sigma, St. Louis, MO) 1 den po jejich poslední injekci. Zvířata byla poté usmrcena ještě pod vlivem anestezie a vzorky krve byly odebrány ze srdce pro měření sérového kreatininu a dusíku močoviny v krvi. Theledvinybyly odebrány laparotomií a tkáň ledvinové kůry byla bleskově zmražena v tekutém dusíku a uložena v -80C.

2.8. Test in situ terminální deoxynukleotidyltransferázou zprostředkovaný biotinylovaným UTP nick end značení (TUNEL)

Zmrazené tkáňové řezy (4 μm) zledvinabyly zpracovány fluoresceinem ApopTag in situapoptózadetekční souprava (CHEMICON International, Inc., CA, USA) podle pokynů výrobce. Krátce,ledvinatkáňová sklíčka byla předem ošetřena proteinázou K a H₂O₂a inkubovány s reakční směsí obsahující koncovou deoxynukleotidyltransferázu (TdT) a dUTP konjugovaný s digoxigeninem po dobu 1 hodiny při 37 1C, upevněny montážním roztokem obsahujícím PI a nakonec pozorovány fluorescenční mikroskopií.

2.9. Statistické analýzy

Data jsou prezentována jako průměr 7 standardních odchylek (SD). Statistické analýzy byly provedeny pomocí Studentových t-testů, kde P 0.05 bylo považováno za statisticky významné.

3. Výsledky

3.1. Vliv ZDW na buněčnou proliferaci

Pro kontrolu kvality ZDW jsme použili HPLC ke stanovení chromatogramu otisků prstů, jak je znázorněno na obr. 1. Nejprve jsme zkoumali vliv extraktů ZDW na proliferaci buněk NRK-52E. Pro napodobení gastrointestinálního prostředí byl ZDW tráven a extrahován pomocí umělé střevní tekutiny a poté aplikován v buněčných experimentech.

Při monitorování buněčné proliferace v reálném čase proliferační křivky i sklony ukázaly, že buňky ošetřené 30 μg/ml ZDW měly vyšší rychlost proliferace ve srovnání s kontrolními buňkami ošetřenými umělou střevní tekutinou (obr. 2A a B). Naproti tomu 300 μg/ml ZDW významně snížilo rychlost proliferace. Dávkování 30 μg/ml ZDW obsahuje 4 μg/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μg/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, 4 μg/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., kůra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek a 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Wolf. Tyto dávky složek však místo toho snížily proliferaci NRK-52E buněk (obr. 2C).Gentamicinvýznamně inhiboval buněčný růst a dokonce snížil index počtu buněk, který se částečně obnovil po ošetření 3 nebo 30 ug/ml ZDW, jak je znázorněno na obr. 2A. Vysoké dávky ZDW (300 μg/ml) dále zvýšily inhibiční účinekgentamicinna buněčnou proliferační kapacitu. Naše výsledky naznačují, že nízká dávka ZDW (3–30 g/ml) podporuje proliferaci buněk NRK-52E, a to i v přítomnostigentamicinléčba.

3.2. Vliv ZDW na apoptózu

Dále jsme hodnotili vliv extraktů ZDW nagentamicin-indukovanýapoptózav NRK{{0}}E buňkách barvením annexinem V/PI a průtokovou cytometrií. Jak je znázorněno na obr. 3, extrakty ZDW od 0,3 do 300 μg/ml neindukovaly signifikantníapoptózav buňkách NRK-52E. Expozice 3 mmol/lgentamicinvýrazně zvýšené apoptotické buňky. Předúprava buněk ZDW se významně snížilagentamicin-indukovanýapoptózav závislosti na dávce a inhibiční účinek vrcholil při 30 μg/ml a klesal při 300 μg/ml ZDW (obr. 3).

ZDW extrahuje chráněné buňky NRK-52E zgentamicin-indukovanýapoptóza. Pro potvrzení tohoto výsledku jsme také sledovali vliv ZDW na apoptotickou signální dráhu indukovanougentamicin. V normálních NRK{{0}}E buňkách koncentrace ZDW od 0,3 do 300 μg/ml významně neovlivnily expresi Bcl-2 a štěpení kaspázy-3 (obr. 4).Gentamicinléčba významně snížila expresi Bcl-2 a indukovala štěpení kaspázy-3 v NRK-52E buňkách. Předúprava buněk pomocí ZDW zlepšila expresi Bcl-2 ingentamicin-ošetřené buňky a výrazně sníženégentamicin-indukované kaspázové-3 štěpení (obr. 4).

3.3. Vliv složek ZDW na apoptózu

Výsledky ukázaly, že nejúčinnější koncentrace ZDW se blížila 30 μg/ml. Teoreticky 30 μg/ml ZDW obsahuje 4 μg/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μg/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, 4 μg/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., kůra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek a 3 μ g/ml Poria kokos. Extrakty těchto složek v uvedených koncentracích však neovlivnily proliferaci buněk NRK-52E, jak bylo zjištěno monitorováním buněčné proliferace v reálném čase (data nejsou uvedena). Dále jsme samostatně monitorovali složky ZDW z hlediska jejich účinků na expresi Bcl-2 a kaspázového-3 štěpenígentamicin-ošetřené buňky NRK-52E. Obr. 5 ukazuje, že Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., kořen, pečený, Dioscorea opak, Paeonia suffruticose Andrews, kořenová kůra, Alisma Plantago-Aquatica L., oddenek a Poria cocos neovlivnily expresi Bcl-2 a štěpení kaspázou{5}}gentamicin-ošetřené buňky. Pouze 0,2 μg/ml Phellodendron amurense Rupr., kůra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek při 4 a 60 μg/ml obě inhibovalygentamicin-indukované snížení Bcl-2 a současně zvýšení štěpení kaspázou-3 (obr. 5).

Podobně jako u výsledků Western blotting odhalilo barvení annexinem V/PI, že Phellodendron amurense Rupr., kůra při 0,2 μg/ml a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek při 4 a 60 μg/ml významně inhibovalygentamicin-indukovanýapoptóza(obr. 6). Ostatní rostlinné složky nevykazovaly antiapoptotický účinekgentamicin-ošetřené NRK-52E buňky, jak bylo zjištěno průtokovou cytometrií (data nejsou uvedena). ZDW obsahuje 6,9 ​​procenta Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma. Dávka 60 μg/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma byla výrazně vyšší než množství obsažené v 300 μg/ml ZDW, což byla nejvyšší dávka použitá v této studii. Phellodendron amurense Rupr., dávka kůry 0,2 μg/ml byla podobná množství Phellodendron amurense Rupr., kůra obsažená v 3 μg/ml ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma dávka 4 μg/ml se blížila množství Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma obsažené v 30 μg/ml ZDW. Koncentrace ZDW 3 i 30 μg/ml měly významné antiapoptotické účinky (obr. 2), které mohou částečně vyplývat z Phellodendron amurense Rupr., kůra, a Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma.

3.4. Ochranný účinek ZDW na ledviny

Ochranný účinek ZDW nagentamicin-indukovanýapoptózabyl dále prokázán na myším zvířecím modelu. Myši byly léčenygentamicin(20 mg/kg/den) nebo fyziologický roztok jako kontroly; experimentální skupiny byly navíc léčeny ZDW (1 nebo 2 g/kg/den). Na konci léčebného období (9 dní) seledvinybyly odebrány laparotomií a nařezány pro in situ testy TUNEL. Jak je znázorněno na obr. 7, jádra vledvinařezy byly odhaleny jako světlé skvrny obarvené PI. Rozptýlená a světlá jádra obarvená pomocí TUNEL mohla být detekována v celé ledvinové kůřegentamicin-ošetřená zvířata, přesto byla v kontrolních vzorcích zjištěna jen zřídka. Léčba ZDW sníženagentamicin- indukovaná apoptotická jádra způsobem závislým na dávce. Většina jader značených TUNEL byla pozorována v epitelu proximálního tubulu. ZDW inhiboval in vivogentamicin-indukovaná buňkaapoptózau krysyrenální tubulární buňky. Renální funkce experimentálních myší byla také monitorována měřením koncentrace dusíku močoviny v krvi a sérového kreatininu.

Obr. 8 ukazuje, že koncentrace dusíku močoviny v krvi a sérového kreatininu byly zvýšeny v krvigentamicin-ošetřené skupiny a léčba ZDW je významně inhibovalagentamicin-indukované zvýšení. Tyto výsledky naznačují, že ZDW exprimuje renální ochranný účinek in vivo.

4. Diskuze

V této studii jsme se zaměřili na vliv ZDW nagentamicin-indukovanýapoptózau potkana proximálněrenální tubulární buňky. Hlavní nálezy ukázaly, že ZDW (3 a 30 μg/ml) oslabujegentamicin-indukované apoptotické poškození v NRK-52E buňkách (obr. 3). Předběžná úprava ZDW také inhibovalagentamicin-indukované apoptotické signály, včetně snížení Bcl-2 a zvýšení štěpení kaspázou{2}} (obr. 4). V modelu myšigentamicintoxicita, léčba ZDW významně snížila apoptotické buňky v renální kůře a zlepšila renální funkce (obr. 7 a 8). Naše výsledky naznačují, že ZDW chránírenální tubulární buňkyzgentamicin-indukovanýapoptóza. Kromě toho jsme také zjistili, že 30 μg/ml ZDW podporuje proliferaci buněk NRK- 52E (obr. 2), což by mohlo přispět k obnově renálních tubulů zakutníledvinachoroba. Vysoká dávka ZDW (300 μg/ml) však snížila buněčnou proliferaci a snížil se i její antiapoptotický účinek (obr. 2 a 3). Tyto výsledky ukazují, že ZDW ve vysokých dávkách je cytotoxický prorenální tubulární buňky. Proto navrhujeme podávání ZDW v adekvátních dávkách pro pacienty sgentamicin-indukovanýledvinazranění.

Rostlinné léky používané v buněčných experimentech byly stráveny a extrahovány pomocí umělé střevní tekutiny obsahující pankreatin. Pankreatin se skládá z amylázy, lipázy a proteázy. V zásadě lze biologicky dostupné molekuly v rostlinných léčivech získat pomocí laboratorní extrakce, která napodobuje gastrointestinální prostředí v takových detailech, jako jsou přítomné chemikálie a enzymy, teplota, doba expozice a pH. V našem systémurenální tubulární buňkyměl šanci interagovat s biologicky dostupnými molekulami v rostlinných léčivech, ale ne se surovinami. Účinné biologicky dostupné molekuly ZDW v našem systému jsou stále neznámé. Detekce absorpce ZDW vrenální tubulární buňkyje zatím obtížné, protože neexistuje žádný vhodný cíl ke sledování. Umělé střevní extrakty ZDW však vykazovaly v buněčných experimentech účinek závislý na dávce. Tyto experimenty naznačují, že umělé střevní extrakty ZDW obsahují účinné biologicky dostupné molekuly působící na renální tubulární buňky. Na druhé straně perorální ZDW také v závislosti na dávce projevil renální ochranný účinekgentamicin-ošetřené myši (obr. 7 a 8). Tyto údaje naznačují, že účinné molekuly umělých střevních extraktů ZDW mohou také existovat vledvinymyší ošetřených ZDW. Naše výsledky ukazují farmakologickou shodu mezi buněčnými studiemi s umělými střevními extrakty rostlinných léků a studiemi na zvířatech s perorálními rostlinnými léky. Aplikace umělých střevních tekutin v buněčných studiích je k dispozici v poslední době. V buňkách Caco-2 byly použity umělé střevní tekutiny ke zkoumání charakteristik buněčného příjmu L-valyl-ara-C (Cheon et al., 2006). Orální biologická dostupnost půdních kontaminantů byla měřena in vitro pomocí umělých střevních tekutin (Ellickson et al., 2001). Biologická dostupnost arsenu v různých druzích rýže byla také studována pomocí in vitro systému gastrointestinálních tekutin (He et al., 2012). Umělá gastrointestinální extrakce přinesla výsledky v rozumné shodě s klinickými měřeními biologické dostupnosti arsenu měřenými analýzou moči u dospělých lidí po požití tradiční čínské medicíny obsahující arsen (Koch et al., 2007). Kromě toho bude pankreatin v umělé střevní tekutině během inkubace 37 1C samotráven a ztratí svou enzymatickou aktivitu. Koncentrace pankreatinu v buněčných experimentech byla také velmi nízká (0.3 30 ppm). Vliv pankreatinu na buněčnou proliferaci aapoptózaje velmi omezená. Navrhujeme, aby umělá extrakce střevní tekutiny byla jednou z ideálních extrakčních metod pro tradiční bylinné léky v experimentech s buněčnými kulturami.

Z rostlinných složek ZDW jsou pouze Phellodendron amurense Rupr., kůra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek inhibovanýgentamicin-indukovanýapoptózav konkrétních koncentracích (obr. 5 a 6). Phellodendron amurense Rupr., kůra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, oddenek by měl hrát roli v ochranném účinku ZDW v NRK-52E buňkách. Phellodendron amurense Rupr., kůra obsahuje řadu alkaloidů jako je berberin, palmatin a jatrorrhizin. Phellodendron amurense Rupr., kůra je známá protizánětlivá látka (Mori et al., 1995; Uchiyama et al., 1989) a snižuje oxidační stres vledvinydiabetických krys (Kim et al., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge je široce používán v čínské tradiční medicíně. Oddenky Anemarrhena asphodeloides Bunge mají antidiabetické, protidestičkové agregační a diuretické účinky (Takahashi et al., 1985). Timosaponiny izolované z oddenků Anemarrhena asphodeloides Bunge potlačují agregaci krevních destiček a tvorbu superoxidu indukovanou AA v lidských neutrofilech (Zhang et al., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge také hraje klíčovou protektivní roli při ischemickém poškození mozku (Oh et al., 2007). Na rozdíl od ZDW, Phellodendron amurense Rupr., kůry a Anemarrhena asphodeloides Bunge vykazoval oddenek antiapoptotické účinky v omezeném rozsahu koncentrací (obr. 3 a 6). Navíc 30 μg/ml ZDW podporovalo buněčnou proliferaci, ale všechny složky v 30 μg/ml ZDW místo toho buněčnou proliferaci snižovaly (obr. 2C). Tento výsledek naznačuje, že účinek ZDW na podporu proliferace nemusí vyplývat z jeho jednotlivých složek. Ochranný účinek ZDW by mohl vyplývat, alespoň částečně, ze synergických účinků způsobených složkami nebo z vytváření modifikovaných molekul vytvořených ve farmaceutických směšovacích procesech ZDW. Tradičně mnoho praktiků čínské medicíny věří, že polybylinný přípravek je obvykle účinnější než jeden bylinný lék, což podporují naše výsledky.

V této studii,gentamicinkoncentrace použitá v experimentech s buněčnými kulturami byla podobná dříve publikovaným studiím (Juan et al., 2007).Gentamicinkoncentrace 1–3 mmol/l účinně indukoványapoptózavrenální tubulární buňkya toto koncentrační rozmezí je blízké in vivoledvinaúrovně zjištěné běhemgentamicinantimikrobiální léčba u myší a krys (El Mouedden a kol., 2000a, 2000b; Sandoval a Molitoris, 2004; Servais a kol., 2005). Jinými slovy,gentamicinkoncentrace použité v této studii in vitro byly podobné koncentracím zjištěným u myšíledvinyin vivo běhemgentamicinléčba. V našem experimentu s myšígentamicinbyla podávána v dávce 20 mg/kg intraperitoneálně jednou denně agentamicin-indukovanýapoptózabyl pozorován u myšiledviny(obr. 7). Tato dávka je navržena jako stejné udržovací dávky pro dospělého pacienta s odhadovanou clearance kreatininu 90 ml/min (El Mouedden et al., 2000a). Navíc ochranná dávka ZDW byla v této studii 1 až 2 g/kg/den. Myš je 7 až 8krát méně metabolicky účinná než člověk. Vzhledem k rozdílu mezi rychlostmi metabolismu myší a lidí se dávkování ZDW ve studiích na zvířatech blíží tradiční aplikaci ZDW u lidí. Tato zjištění poskytují základ pro budoucí výzkumy na lidech.

Apoptotická signalizace závislá na kaspáze hraje klíčovou roligentamicin-indukovanýapoptóza. V mitochondriální dráze je kaspáza-3 popravčí kaspáza, kterou lze štěpit na aktivní kaspázou-9, která je aktivována z prokaspázy-9 cytosolickým cytochromem c (Padanilam, 2003; Jiang a Wang , 2004). Mitochondriální uvolňování cytochromu c je regulováno proteiny rodiny Bcl{5}}, které se vážou na vnější membránu mitochondrií a blokují odtok cytochromu c (Yang et al., 1997). V naší studii

gentamicinzvýšilo štěpení kaspázy{0}} a snížilo expresi Bcl{1}} v buňkách NRK-52E. Tyto mitochondriemi zprostředkované apoptotické jevy byly zvráceny léčbou ZDW. Na základě zjištění této studie jsme navrhli, že ZDW chránírenální tubulární buňkyzgentamicin-indukované apoptotické poškození prostřednictvím inhibice mitochondriální dráhy.

5. Závěry

Stručně řečeno, ZDW v adekvátních dávkách podporoval buněčnou proliferaci a inhibovalgentamicin-indukovanýapoptózau krysyrenální tubulární buňky. ZDW také snižujegentamicin-indukovaná renální toxicita in vivo. ZDW by mohl mít terapeutický potenciál pro pacienty sgentamicin-indukovanýledvinazranění.

Poděkování

Tato studie byla sponzorována Bureau of Health Promotion, Department of Health, ROC (DOH98-HP-1106).