Jak polysacharid Cistanche snižuje melanogenezi a snižuje oxidační stres?

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysacharid Cistanche deserticola indukuje melanogenezi v melanocytech a snižuje oxidační stres

1Dermatologická klinika, Třetí nemocnice Xiangya, Central South University, Changsha, Čína

2Urologická klinika, Třetí nemocnice Xiangya, Central South University, Changsha, Čína

3Medicine Experimental Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Čína

Cistanchedeserticolamá mnoho efektů, klikněte sem a dozvíte se více

Abstraktní: Jako hlavní součást poruch pigmentace jsou onemocnění depigmentace kůže, jako je vitiligo a achromický névus, velmi časté a nyní jim je věnována větší pozornost. Patogeneze depigmentace zahrnuje dysfunkci a ztrátu melanocytů, které jsou pravděpodobně způsobeny dědičností, autoimunitou a oxidačním stresem. Mezi nimi,oxidační streshraje klíčovou roli; jen málo klinických léčebných postupů se však může vypořádat s oxidačním stresem. jak bylo oznámeno,Cistanchedeserticola polysacharid(CDP) je účinný antioxidant; na základě toho jsme zhodnotili jeho roli v melanocytech a dále odhalili mechanismy. V této studii jsme zjistili, že CDP může podporovat melanogenezi v lidských epidermálních melanocytech (HEM) a myších melanomových B16F10 buňkách a také indukuje pigmentaci u zebřiček. Kromě toho by CDP mohla aktivovat mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) signální dráhu, pak up-regulovat expresi transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF) a downstream genů TYR, TRP1, TRP2 a RAB27A. Jinak jsme zjistili, že CDP může zmírnit H2O2-indukovanou cytotoxicitu a apoptózu v melanocytech. Další důkazy odhalily, že CDP by mohla posílit antioxidační dráhu NRF2/HO{11}} a vychytat intracelulární ROS. Stručně řečeno, CDP může podporovat melanogenezi a bránit melanocytům před poškozením oxidativním stresem, což naznačuje, že CDP pomáhá udržovat normální stav melanocytů. CDP tedy může být novým lékem pro léčbu depigmentačních onemocnění.

KLÍČOVÁ SLOVA:

Cistanche deserticola polysacharid, depigmentační onemocnění, melanocyty, melanogeneze, NRF2,oxidační stres

1. ÚVOD

Kožní depigmentační onemocnění, jako je vitiligo a achromický névus, se vyznačují plošnou nebo rozsáhlou depigmentací kůže.1 Přestože kožní léze jen zřídka způsobují vážné fyzické poškození, ovlivňují vzhled pacienta a vytvářejí závažnou psychickou zátěž, dokonce i poruchy duševního zdraví.2 Mezi hlavní patologické změny v depigmentaci patří dysfunkce a ztráta melanocytů, což výrazně ovlivňuje syntézu a transport melaninu3, což vede k nedostatečné akumulaci melaninu v kůži.

Mechanismy zapojené do depigmentace jsou v současné době neznámé, ale studie identifikovaly některé související faktory. Na jedné straně funkce melanocytů částečně závisí na transkripčním faktoru asociovaném s mikroftalmií (MITF), který je dobře znám tím, že podporuje expresi genů souvisejících s melanogenezí, včetně tyrosinázy (TYR), proteinu souvisejícího s tyrosinázou 1 (TRP1), souvisejícího s tyrosinázou. protein 2 (TRP2), ras-příbuzný protein Rab-27a (RAB27A) a fascinující aktin-bundling protein 1 (FSCN1).4 Mezi těmito geny hraje klíčovou roli v syntéze melaninu prostřednictvím oxidace l-dopa TYR. dopachinon.5 Na druhou stranu studie naznačují kombinaci několika faktorů, které mohou být zodpovědné za ztrátu melanocytů, včetně dědičnosti, prostředí, autoimunity a oxidačního stresu.6-9 Z těchto faktorů je za nejdůležitější považován oxidativní stres .

Mechanismyoxidační streszpůsobující depigmentaci byly částečně odhaleny; Přetížení reaktivními formami kyslíku (ROS) je jedním z klíčových faktorů.10 Přetížení ROS při depigmentaci zahrnuje nerovnováhu mezi pro-a antioxidačními systémy.11 Jedním z prvků, které se podílejí na této nerovnováze, je jaderný faktor erytroidní 2- faktor 2/prvek antioxidační odezvy (NRF2/ARE) poškození antioxidační dráhy.12 Tato dráha se skládá z NRF2 a antioxidačních enzymů, jako je hemoxygenáza-1 (HMOX-1, HO-1) , kataláza (CAT), glutathionperoxidáza 1 (GPX1) a NAD(P)H chinondehydrogenáza 1 (NQO1).13 Když jsou melanocyty vystaveny nadměrnému ROS, NRF2 se může přemístit do jádra a vázat se na konzervované ARE, pak podporovat exprese antioxidačních enzymů. U některých depigmentačních onemocnění, jako je vitiligo, však poškozená antioxidační dráha NRF2/ARE nemůže účinně vychytávat ROS.14 Mezi klinické terapie běžně používané při depigmentaci patří topické nebo systémové kortikosteroidy, inhibitory kalcineurinu, úzkopásmové ultrafialové záření B (NBUVB; 311 nm) , 308-nm excimerové světlo, autologní epidermální transplantace a terapie tradiční čínskou medicínou (TCM). Kortikosteroidy a inhibitory kalcineurinu mohou snížit abnormální imunitní aktivaci,15 zatímco fototerapie se používají jako léčba první volby; konkrétně NBUVB stimuluje proliferaci melanocytů a destrukci T-buněk,16 zatímco 308-nm excimerové světlo indukuje apoptózu T-buněk.17 Kromě toho účinky terapií TCM souvisí s podporou melanogeneze.18 Do jisté míry tyto metody jsou užitečné pro zlepšení depigmentace, ale kontrola progrese onemocnění zůstává náročná. Je nutné vyvinout nové terapie, zejména u oxidativního stresu, který byl dříve opomíjen.

Cistanche deserticolaje známý jako „pouštní ženšen“.19 Jeho složky jsou užitečné při poškození jater vyvolaném ethanolem a střevní zánětlivé hyperplazii; lze jej také použít jako činidlo proti únavě, zánětu a nádoru.{5}} Nedávno Guo et al uvedli, žeCistanche deserticola polysacharid(CDP), jedna z jeho hlavních složek, měla antioxidační a hepatoprotektivní aktivitu20; další dvě studie identifikovaly jeho roli při ochraně buněk před poškozením při kyslíkově-glukózové deprivaci/reperfuzi a osteoporóze.23,24 Role CDP u depigmentačních onemocnění však nebyla objasněna. Zde jsme se snažili potvrdit, zda CDP coxidační stresOvlivňuje melanogenezi a chrání melanocyty před oxidačním stresem.

2.|MATERIÁLY A METODY

2,1|Chemikálie a protilátky

Cistanche deserticolapolysacharid(CDP) a l-dopa byly zakoupeny od Yuanye Biotec (čistota větší nebo rovna 98 procentům; Shanghai, Čína). Peroxid vodíku (H2O2), dimethylsulfoxid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazoliumbromid ( MTT) a Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit byly zakoupeny od Sigma-Aldrich. 4% neutrální paraformaldehyd byl zakoupen od Biosharp (Hefei, Čína); a Immunofluorescence Stained Kit (Alexa Fluor 488) a 2,7-dichlorfluorescein-diacetát (DCFH-DA) byly zakoupeny od Beyotime Biotec (Shanghai, Čína). Fontana-Masson Stain Kit a Nucleoplasmic Protein Extraction Kit byly zakoupeny od Sloarbio (Peking, Čína). Doplněk pro růst lidských melanocytů (HMGS), Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) a médium 254 byly zakoupeny od Gibco. Fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael). Primární protilátky pro -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 a HO-1 byly zakoupeny od Cell Signaling Technology, primární protilátka pro MITF byla zakoupena od St John's Laboratory, primární protilátka pro p-MITF byla zakoupena od Affinity Biosciences, primární protilátka pro GAPDH byla zakoupena od Bioworld a primární protilátka pro TRP1 byla zakoupena od EMD Millipore.

2,2| Buněčná kultura a léčba

Buňky myšího melanomu B16F10 byly kultivovány v médiu DMEM doplněném 10 procenty FBS a 1 procentem směsi antibiotik penicilin-streptomycin. Lidské epidermální melanocyty (HEM) byly odděleny od lidské předkožky (viz naše předchozí studie25) a kultivovány v médiu 254 doplněném HMGS, 5 procenty FBS a 1 procentem směsi antibiotik penicilin-streptomycin. Všechny buňky byly kultivovány ve vlhkém inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2. CDP byl rozpuštěn v DMSO a zředěn

s médiem před použitím byla konečná koncentrace DMSO nižší než 0,1 procenta. H2O2 byla před použitím zředěna médiem.

2,3|Kultivace a léčba zebřičky

Embrya a médium zebrafish byly zakoupeny od EzeRinka Biotech. Experimentální protokol byl schválen Etickou komisí Central South University. Zebřičky byly kultivovány v 12-jamkových destičkách při 37 stupních od světla a ošetřeny různými koncentracemi CDP. K dennímu pozorování a záznamu melaninů v hlavách a ocasech zebřičky byl použit inverzní mikroskop. Po pozorování jsme vyměnili médium a znovu přidali CDP. Hustota melaninu v ocasech zebřičky byla měřena pomocí obrázku J a hodnoty jsou prezentovány jako integrované optické hustoty (IOD).

2,4| Životaschopnost buněk

Životaschopnost buněk byla měřena pomocí MTT testu. Pro zkoumání cytotoxicity CDP byly buňky HEM a B16F10 implantovány do 96-jamkových destiček v hustotě 2 × 1{{30}}3 buněk/jamku a kultivovány, dokud buňky byly připevněny k destičkám. Buňky byly poté ošetřeny různými koncentracemi (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 a 320 ug/ml) CDP po dobu 24, 48 nebo 72 hodin. Před měřením bylo do každé jamky přidáno 20 ul MTT a destičky byly inkubovány při 37 stupních po dobu 4 hodin. Poté jsme odstranili supernatant a přidali 160 μl DMSO do každé jamky, aby se rozpustily krystaly formazanu. Hodnota absorbance při 490 nm byla měřena multimodovou čtečkou destiček (PerkinElmer). Pro zkoumání účinku CDP v podmínkách cytotoxicity vyvolané H2O{24}} byly buňky HEM a B16F10 umístěny na 96-jamkové destičky v hustotě 4 x 103 buněk/jamku. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi CDP (0, 20, 40 nebo 80 ug/ml) po dobu 24 hodin, v tomto okamžiku jsme do každé jamky přidali H2O2 (konečné koncentrace: 500 μm pro HEM a 1,0 mm pro buňky B16F10). a inkubovali buňky dalších 24 hodin. Vytvořili jsme skupiny léčené CDP a negativní kontrolní (NC) skupiny. Kroky detekce byly stejné jako dříve popsané.

2,5|Stanovení obsahu melaninu NaOH

Buňky byly kultivovány v {{0}}mm Petriho miskách a ošetřeny CDP v různých koncentracích (0, 20, 40 a 80 ug/ml) po dobu 48 hodin, poté štěpeny trypsinem a shromážděny v 1. 5-ml zkumavky. Buňky jsme dvakrát promyli dvakrát destilovanou vodou, resuspendovali je v 1 ml ethanolu a vortexovali, aby se uvolnil melanin. Poté jsme směs odstředili (200 g, 5 minut) a odstranili supernatant, do každé zkumavky jsme přidali 1 ml 10% DMSO (zředěného 1 mm roztoku NaOH) a suspendovali sediment. Suspenzi jsme inkubovali ve vodní lázni při 80 stupních po dobu 1 hodiny, aby se rozpustil melanin. Nakonec jsme přenesli 200 μl kapaliny na 96-jamkovou destičku a použili jsme multimódovou čtečku destiček k měření hodnoty absorbance při 470 nm.

2,6|Měření aktivity tyrosinázy

Buňky byly kultivovány v {{0}}mm Petriho miskách a před měřením ošetřeny CDP, štěpeny trypsinem a shromážděny do 1,{2}}ml zkumavek a dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS ). Přemístili jsme 106 buněk z každého vzorku do nové zkumavky a supernatant jsme po centrifugaci zlikvidovali, poté jsme přidali 1 ml 0,5% Tritonu X-100 do buněčné pelety a skladovali směs při 0 stupních po dobu 15 minut. Poté jsme přidali 1 ml l-dopa (1 mm, zředěný 0,1 M fosfátovým pufrem) jako substrát a promíchali roztok, přemístili 200 μl směsi na 96-jamkovou destičku okamžitě a změřili hodnotu absorbance (A0) při 475 nm pomocí multimodové čtečky destiček, měření opakovali po 10 minutách (A10). Aktivita tyrosinázy byla vypočtena pomocí (A10-A0)/105 a výsledky jsou vyjádřeny jako procenta (procenta) oproti negativní kontrole.

2,7| Barvení melaninem Fontana-Masson

Buňky byly kultivovány v 12-jamkových destičkách do dosažení 50% hustoty. Po ošetření byly buňky fixovány 4% neutrálním paraformaldehydem po dobu 30 minut a promyty destilovanou vodou. Poté jsme do každé jamky přidali 500 μl roztoku amoniaku a stříbra Fontana a uložili destičky na 16 hodin do temna, aby se obarvil melanin. Poté jsme buňky pětkrát promyli destilovanou vodou (pokaždé 1 minutu) a namočili je na 5 minut do 500 μl hyposiřičitanu; nakonec jsme odstranili hyposiřičitan a buňky znovu proplachovali destilovanou vodou po dobu 1 minuty. Potom jsme použili inverzní mikroskop k pozorování a záznamu melaninů.

2,8|Extrakce RNA a kvantitativní reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce

Buňky byly kultivovány v 6-jamkových destičkách. Po ošetření byly buňky štěpeny trypsinem a shromážděny do 1,{2}}ml zkumavek. Buňky jsme dvakrát promyli PBS, poté jsme přidali 1 ml lyzačního pufru, promíchali směs a umístili zkumavky na 5 minut na led, aby se buňky úplně lyžovaly. RNA byla extrahována pomocí soupravy Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) a reverzně transkribována (RT) pomocí ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitativní reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce (PCR) byla provedena pomocí KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Reakční objem RT směsi byl 20 μL, zatímco reakční objem PCR směsi byl 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, přidejte DEPC H2O do 20 μL ). Experimenty byly prováděny podle protokolů. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce SI.

2,9|Extrakce proteinů a Western blotting/imunofluorescence

Buňky byly kultivovány v 100-mm Petriho miskách. Po ošetření byly buňky štěpeny trypsinem a shromážděny do 1,{2}}ml zkumavek. Buňky jsme dvakrát promyli PBS, poté přidali do 500 ul RIPA lyzačního pufru (Thermo Fisher) doplněného 1 mm fenylmethylsulfonylfluoridem (Thermo Fisher) a 1:100 zředěným koktejlem inhibitorů fosfatázy (Roche). Jaderný a cytoplazmatický protein byl extrahován pomocí Nucleoplasmic Protein Extraction Kit podle protokolu výrobce. Zkumavky jsme umístili na led na 30 minut a každých 5 minut jsme je protřepali, aby došlo k úplné lýze buněk. Buňky jsme odstředili (200 g, 4 stupně, 15 minut), přemístili supernatant do nové zkumavky a měřili koncentraci celkového proteinu pomocí soupravy pro stanovení proteinů BCA (KeyGEN Biotec). Proteiny jsme vařili s 5× nakládacím pufrem (Beyotime Biotec, Čína) při 100 stupních po dobu 10 minut, poté jsme je skladovali při -80 stupních. Při Western blotu byla použita metoda elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (PAGE) a 20 ug proteinu z každé skupiny bylo separováno a přeneseno na polyvinylidenfluoridovou membránu. Po zablokování antigenem jsme membránu inkubovali v primární protilátce zředěné 1:1000 po dobu 16 hodin při 4 stupních, poté jsme membránu promyli PBST a inkubovali v 1:10 000 zředěné fluorescenční sekundární protilátce po dobu 1 hodiny při 37 stupních . Intenzita fluorescence byla detekována pomocí systému Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluorescence byla provedena pomocí Immunofluorescence Stained Kit (Alexa Fluor

488) s 1:100 ředěním primární protilátky.

2.10|Měření buněčné apoptózy

Buňky byly kultivovány v {{0}}mm Petriho miskách a ošetřeny různými koncentracemi (0, 20, 40 a 80 ug/ml) CDP po dobu 24 hodin a byl přidán H2O2 ( konečné koncentrace: 500 μm pro HEM, 1,0 mm pro buňky B16F10) do každé jamky a inkubovány dalších 24 hodin. Založili jsme také CDP-léčené a NC skupiny. Po ošetření jsme buňky štěpili trypsinem bez EDTA a shromáždili je do zkumavek, poté jsme buňky dvakrát promyli PBS a resuspendovali je ve 100 ul PBS. Buňky byly obarveny soupravou Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit podle protokolu a detekovány průtokovou cytometrií (FCM). K analýze rychlosti apoptózy byl použit software FlowJo.

2.11| Intracelulární měření ROS

Buňky byly kultivovány v {{0}}jamkových destičkách a ošetřeny různými koncentracemi (0, 20, 40 a 80 ug/ml) CDP po dobu 24 hodin, ke které jsme přidali H2O2 (konečné koncentrace: 500 μm pro HEM,

1.0 mm pro buňky B16F10) do každé jamky, inkubujte je další

24 hodin a nastavte skupiny ošetřené CDP a NC. Po ošetření jsme buňky dvakrát promyli PBS, abychom odstranili veškeré médium a FBS, poté jsme zředili sondu DCFH-DA na 1:1000 médiem a přidali do každé jamky. Buňky jsme inkubovali při 37 stupních po dobu 30 minut a promyli jsme je třikrát médiem bez séra. Použili jsme an

invertovaný fluorescenční mikroskop pro pozorování a záznam fluorescence, poté použil ImageJ k měření intenzity fluorescence.

2.12|Statistiky a analýzy

Data v této práci jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD) a statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism (verze 7.0) nebo SPSS (verze 22.0) a Student's t-test nebo jednocestná analýza rozptylu (ANOVA) byla použita pro srovnání více skupin. Šedá hodnota proužků proteinu WB byla standardizována pomocí GAPDH nebo -aktinu. Hodnoty P < 0,05="" byly="" považovány="" za="" významné.="" všechny="" experimenty="" byly="" opakovány="" alespoň="">

3|VÝSLEDEK

3,1|CDP indukovala melanogenezi v HEM a B16F10 buňkách

Než jsme začali, použili jsme test MTT ke zkoumání potenciální cytotoxicity CDP na buňky HEM a myšího melanomu B16F10. Buňky byly ošetřeny CDP v různých koncentracích po dobu 24, 48 nebo 72 hodin. Testování životaschopnosti HEM prokázalo, že když byly koncentrace nižší než 320 ug/ml, CDP neměl žádný vliv na životaschopnost buněk; avšak životaschopnost významně poklesla, když koncentrace dosáhla 320 ug/ml po 24, 48 a 72 hodinách (P < 0,05;="" obrázek="" 1a).="" životaschopnost="" buněk="" b16f10="" se="" také="" snížila="" po="" 48="" a="" 72="" hodinách,="" kdy="" cdp="" dosáhl="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" ale="" žádná="" změna="" nebyla="" pozorována="" při="" nižších="" koncentracích="" (obrázek="" 1b).="" poté="" jsme="" předběžně="" prozkoumali="" roli="" cdp="" v="" melanogenezi="" a="" porovnali="" jeho="" účinky="" s="" účinky="" -melanocyty="" stimulujícího="" hormonu="" (-msh;="" koncentrace:="" 20,="" 100="" a="" 400="" nm)="" a="" dmso="" (0,1="" procenta)="" v="" hem.="" výsledky="" barvení="" melaninu,="" aktivity="" tyrosinázy="" a="" obsahu="" melaninu="" naznačují,="" že="" cdp="" byl="" srovnatelný="" s="" -msh="" pro="" podporu="" melanogeneze,="" zatímco="" ošetření="" 0,1="" procenta="" dmso="" nedělalo="" žádný="" rozdíl="" (obrázek="">

Podle toho jsme dále zdokonalili náš průzkum. HEM byly ošetřeny CDP v různých koncentracích (20, 40 a 80 ug/ml) po dobu 48 hodin; byly provedeny testy barvení melaninu, obsahu melaninu a aktivity tyrosinázy a všechny ukázaly významný nárůst po léčbě CDP způsobem závislým na koncentraci, který dosáhl vrcholu ve skupině s 80 ug/ml (P < 0,05,="" obrázek="" 2a-c)="" .="" poté="" jsme="" měřili="" hladiny="" mrna="" a="" proteinů="" genů="" souvisejících="" s="" melanogenezí="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" a="" fscn1).="" cdp="" významně="" zvýšila="" hladiny="" mrna="" těchto="" genů="" v="" hem="" (p="">< 0,05;="" obrázek="" s2a).="" kromě="" toho="" se="" zvýšily="" hladiny="" proteinů="" mitf,="" tyr,="" trp1="" a="" rab27a,="" stejně="" jako="" poměr="" fosforylovaného="" mitf="" k="" celkovému="" mitf="" (p="">< 0,05),="" zatímco="" trp2="" a="" fscn1="" nevykazovaly="" žádný="" rozdíl="" (obrázek="" 2d,="" e).="" výsledky="" ukázaly,="" že="" cdp="" může="" podporovat="" melanogenezi="" a="" up-regulovat="" expresi="" genů="" souvisejících="" s="" melanogenezí="" v="" lidských="">

Dále jsme znovu ověřili účinky CDP s buňkami B16F10 a zjistili jsme, že obsah melaninu v buňkách B16F10 se významně zvýšil (P < 0,01;="" obrázek="" s2b).="" kromě="" toho="" cdp="">

3,2|CDP podporoval melanogenezi u zebřiček

Prozkoumat, zda by CDP mohla podporovatmelanogenezein vivo jsme použili embrya zebrafish. Embrya zebrafish byla rozdělena do čtyř skupin a kontinuálně ošetřena samotným médiem (NC) nebo CDP v různých koncentracích (20, 40 a 80 ug/ml); hustota a distribuce melaninových granulí byla pozorována a zaznamenávána každý den. Jak embrya zebrafish rostla, zjistili jsme, že hustota melaninu se postupně zvyšuje v hlavách a ocasech. Třetí den byly rozdíly mezi skupinami rozpoznatelné a rozdíl se dále zvětšoval, dokud jsme neukončili experiment šestého dne (obrázek 3A). Použili jsme obrázek J k měření hustoty melaninu v ocasech zebrafish; hustota melaninu ve skupinách léčených CDP byla významně vyšší než v kontrolní skupině (P < 0,05;="" obrázek="">

3,3|CDP aktivovaná signální dráha MAPK v buňkách HEM a B16F10

Odhalit mechanismy, kterými se CDP propagovalomelanogeneze, léčili jsme HEM pomocí CDP v různých koncentracích (20, 40 a

80 ug/ml) po dobu 48 hodin a poté zkoumali fosforylované a celkové hladiny proteinů ERK, JNK a p38 v signální dráze MAPK. Jak bylo měřeno Western blotem, hladiny p-ERK, p-JNK a p-p38 byly po ošetření CDP zvýšeny (P < 0,05),="" zatímco="" jejich="" celkové="" hladiny="" se="" nezměnily="" (obrázek="" 4a,="" b).="" experimenty="" byly="" opakovány="" s="" buňkami="" b16f10="" a="" fosforylované="" hladiny="" proteinů="" erk,="" jnk="" a="" p38="" byly="" zvýšeny="" (p="">< 0,05),="" ale="" celkové="" hladiny="" mapk="" se="" nezměnily="" (obrázek="" 4c,="" d),="" v="" souladu="" s="" výsledky="" v="" hem.="">

3,4|CDP zeslabená H2O2-indukovaná

cytotoxicita a apoptóza u HEM a B16F10 buněk

K simulaci jsme použili H2O2oxidační stresprostředí a dále zkoumal roli CDP v melanocytech podoxidační stres. Konečná koncentrace H2O2 použitá v HEM byla 500 μm, zatímco v buňkách B16F10 byla 1,0 mm. Abychom prozkoumali účinek CDP na H2O2-indukovanou cytotoxicitu, předem jsme ošetřili HEM a B16F10 buňky CDP v různých koncentracích (20, 40 a 80 ug/ml) po dobu 24 hodin, poté jsme přidali H2O2 a pokračovali v jejich léčbě. po dobu 24 hodin před provedením pozorování a testu MTT.

H2O2 způsobila zjevné blebbing membrány a smrštění buněk v HEM, ve skupinách předem ošetřených CDP byla situace zmírněna. Léčba samotným CDP neměla žádný účinek (obrázek 5A). Test MTT ukázal podobný výsledek v tom, že léčba H2O2 snížila životaschopnost HEM, zatímco CDP významně zlepšila tento škodlivý dopad

3,5|CDP vychytávaná H2O2-indukovaná intracelulární ROS v HEM a buňkách B16F10

Abychom prozkoumali mechanismy CDP pro snížení H2O2-indukované cytotoxicity a apoptózy, dále jsme detekovali intracelulární ROS v buňkách HEM a B16F10 pomocí fluorescence DCFH-DA

4|DISKUSE A ZÁVĚRY

V této studii jsme zkoumali roli CDP v HEM a B16F10 buňkách. Poprvé jsme zjistili, že CDP může propagovatmelanogenezev melanocytech a podporují pigmentaci u zebřiček. Následný experiment ukázal, že signální dráha MAPK byla aktivována působením CDP. Dále jsme zkoumali jeho roli voxidační stresa zjistili, že CDP může zmírnit H2O2- indukovanou cytotoxicitu a apoptózu v melanocytech; mezitím by CDP mohla aktivovat antioxidační dráhu NRF2/HO-1 a vychytat intracelulární ROS podoxidační strespodmínky.

Mitogenem aktivovaná proteinkináza je životně důležitá cesta zapojená do regulace MITF, klíčového transkripčního faktoru, který podporuje expresimelanogenezegenů a následně ovlivňuje syntézu a transport melaninu.26,27 V naší studii byla ak- aktivace ERK, JNK a p38 v melanocytech významně zvýšena po léčbě CDP; mezitím výrazy MITF/p-MITF a TYR, TRP1, TRP2 a RAB27A řízené MITF

byly odpovídajícím způsobem upregulovány. Proto navrhujeme, aby CDP mohl

podporovatmelanogenezeprostřednictvím aktivace dráhy MAPK, ale jak CDP aktivuje MAPK, zůstává neznámé. Podle nedávných studií je toll-like receptor 4 (TLR4) vysoce exprimován v melanocytech a účastní se melanogeneze.28,29 TLR4 je důležitý transmembránový protein, který může specificky vázat lipopolysacharid (LPS)30; studie uvádějí, že LPS může vyvolat melanogenezi.29 Je zajímavé, že několikpolysacharidyextrahované z rostlin nebo hub údajně aktivovaly TLR a downstream signální dráhy, jako je MAPK a nukleární faktor kappa beta (NF-κB).31,32 Proto máme podezření, že CDP může být rozpoznán a vázán TLR, poté aktivuje downstream signál MAPK- ling cestu a podporujemelanogeneze. Kromě toho je známo, že nukleotid-vazebné oligomerizační receptory podobné doménám (NLR) rozpoznávají intracelulární ligandy a řídí aktivaci signálních drah MAPK a NF-κB.33,34 Jak bylo uvedeno, polysacharidy extrahované z Ganoderma lucidum a Astragalus mohou vstupovat do buněk. a ovlivňují NLR.35,36 Je tedy možné, že CDP může vstupovat do melanocytů a regulovat signální dráhu MAPK prostřednictvím NLR. K ověření této hypotézy jsou však zapotřebí další studie.

Některé dosavadní studie uvádějí aplikaci bylinpolysacharidyv melanogenezi k inhibici produkce melaninu.37,38 V této studii však CDP podporovala melanogenezi v

melanocyty a tento účinek byl dále potvrzen po srovnání s -MSH. CDP je také druhpolysacharidextrahovaných z bylin, máme podezření, že opačný účinek CDP může souviset se strukturálními rozdíly mezi CDP a jinýmipolysacharidy. Polysacharidy vznikají polymerací monosacharidů, ale jsou variabilní v typu monosacharidu, složení monosacharidů, glykosidické vazbě, struktuře postranního řetězce a molekulové hmotnosti39,40; předpokládá se, že tyto faktory určují jejich biologické funkce.41 Stávající studie navrhly strukturu CDP a navrhly, že struktura CDP následně ovlivňuje její funkci.42 K úplnému pochopení CDP a potvrzení naší hypotézy je tedy zapotřebí více důkazů.

Melanogeneze je důležitý ochranný mechanismus rezistence

poškození ultrafialovým zářením a udržování tělesné homeostázy43; zároveň

melanocyty jsou snadno vystaveny nepříznivým prostředím, jako je přetížení ROS.11 Je známo, že ROS se podílejí na podpořemelanogeneze, jedním z mechanismů je aktivace MAPK.44 Studie však také odhalily, že tento efekt existuje pouze v rámci určité úrovně ROS, zatímco přetížení ROS významně zhoršuje melanogenezi.45 Vztah mezi ROS, MAPK a melanogenezí je za různých podmínek proměnlivý. rovnováha mezi pro- a antioxidačními systémy je samozřejmě důležitá. U depigmentačních onemocnění, jako je vitiligo, nevyvážený antioxidační systém a nekontrolovatelné přetížení ROS poškodí melanocyty a sníží životaschopnost buněk.11,46 V této studii jsme použili různé koncentrace H2O2 k simulaci přetížení ROS v buňkách a HEM vykazovaly horší toleranci k H2O2 než buňky B16F10. Když byly melanocyty vystaveny působení H2O2, jejich životaschopnost a míra apoptózy se zhoršily, ale

Předúprava CDP by mohla částečně zvrátit trend. Současně byl ROS vyčištěn. Jak bylo uvedeno, aktivace antioxidační dráhy NRF2/ARE je hlavní metodou vychytávání ROS v kožních buňkách.14 V našich experimentech byly hladiny proteinů NRF2 a HO-1 v melanocytech zvýšeny po ošetření H2O2 bez CDP; to znamená, že H2O2-indukovalaoxidační stresmůže aktivovat dráhu NRF2/HO-1, ale to nestačí k udržení redoxní rovnováhy a ochraně buňky před poškozením. Předúprava CDP však zvýšila antioxidační dráhu NRF2/HO-1 a obnovila rovnováhu. Navrhujeme tedy, že CDP může chránit melanocyty před poškozením oxidativním stresem prostřednictvím aktivace antioxidační dráhy NRF2/HO{5}} a vychytávání ROS.

Zjistili jsme, že samotná léčba CDP nemá žádný vliv na ROS nebo NRF2/HO-1 v melanocytech. Tento výsledek naznačuje, že CDP může ovlivnit redoxní rovnováhu za oxidačního stresu, ale ne za normálních podmínek. Kromě toho je antioxidační dráha NRF2/HO-1 údajně regulována signálními cestami PI3K, NF-κB a MAPK.47,48 V naší studii byl CDP schopen aktivovat signální dráhu MAPK. Je možné, že CDP může aktivovat dráhu NRF2/HO-1 prostřednictvím upregulujících MAPK. Jak uvedl Slominski, melanocyty jsou senzory stresu zapojené do regulační sítě a jejich funkce se mohou rychle měnit v reakci na prostředí.49 Domníváme se, že role CDP je ovlivněna stavem melanocytů, může podporovat melanogenezi bez ovlivnění antioxidantu. systému za normálních podmínek, ale obnovte redoxní rovnováhu podoxidační strespodmínky. Proto může být funkce a přežití melanocytů udržována dvěma různými způsoby pomocí CDP. CDP pomáhá melanocytům udržovat homeostázu, která je také důležitou funkcí melanogeneze.50,51

Závěrem lze říci, že CDP může podporovatmelanogenezemelanocytů

prostřednictvím aktivace signální dráhy MAPK. CDP může zlepšit přežití melanocytů aktivací antioxidační dráhy NRF2/HO-1 a vychytáváním intracelulárních ROS za podmínek oxidačního stresu. Naše zjištění jsou smysluplná, protože ukazují, že CDP může podporovat obojímelanogenezea chrání před melanocytyoxidační stresporanění, které je pravděpodobně zodpovědné za dysfunkci a ztrátu melanocytů. Výsledky této studie naznačují, že CDP by mohl být novým lékem v léčbě depigmentačních onemocnění.

PODĚKOVÁNÍ

Tato práce byla podpořena National Natural Science Foundation of China (č. 81703101), New Xiangya Talent Projects Třetí nemocnice Xiangya Central South University (č. JY201623 a č. 20170301), Natural Science Foundation provincie Hunan ( č. 2018JJ3788 a č. 2018JJ3793) a Projekt zdravotní komise Hunan (č. C2019173). Dr. Yibo Hu provedl hlavní část studie a napsal rukopis; Profesor Jing Chen a Qinghai Zeng navrhli studii a řídili psaní rukopisu; Profesor Jinhua Huang, Lihua Huang a Hong Xiang poskytli technickou podporu a analyzovali data; Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang a Xiaojiao Zhao přispěli k části experimentů.

KONFLIKT ZÁJMŮ

Autoři potvrzují, že nedochází ke střetu zájmů.

PROHLÁŠENÍ O DOSTUPNOSTI DAT

Údaje, které podporují zjištění této studie, jsou na přiměřenou žádost k dispozici od odpovídajícího autora.

REFERENCE

1. Bleuel R, Eberlein B. Terapeutický management vitiliga. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Měli bychom při léčbě vitiliga upřednostňovat psychologické intervence? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. vitiligo. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentace melaninu v kůži savců a její hormonální regulace. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tyrosin a L-dihydroxyfenylalanin jako regulátory funkcí melanocytů podobné hormonům. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:14-27.

6. Spritz RA. Sdílené genetické vztahy, které jsou základem generalizovaného vitiliga a autoimunitního onemocnění štítné žlázy. Štítná žláza. 2010; 20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Dětské vitiligo v Číně: klinické profily a imunologické nálezy u 620 případů. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktivní T-lymfocyty u zánětlivých kožních onemocnění. Front Immunol. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, a kol. Vitiligo: Patogeneze, klinické varianty a léčebné přístupy. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et al. Reaktivní formy kyslíku v metabolické a zánětlivé signalizaci. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanocyty jako podněcovatelé a oběti oxidačního stresu. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oxidační stres a vitiligo: Nrf2-JSOU

signalizační připojení. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinková-Kostová AT. Regulační síť Nrf2 poskytuje rozhraní mezi redoxním a intermediárním metabolismem. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Význam Nrf2

dráha v (foto)-oxidační stresové odpovědi v melanocytech a keratinocytech lidské epidermis. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, a kol. In vivo model indukce a terapie vitiliga: dvojitě zaslepená, randomizovaná klinická studie. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Úzkopásmová ultrafialová B fototerapie a 308-nm excimerový laser v léčbě vitiliga: přehled. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novák Z, Bonis B, Baltas E, et al. Xenonchloridový ultrafialový B laser

je účinnější při léčbě psoriázy a při indukci apoptózy T buněk než úzkopásmové ultrafialové B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, a kol. Účinky vodných extraktů Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator a Rehmanniae radix preparator na melanogenezi a migraci lidských melanocytů. J Ethnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": recenze. Am J Chin Med. 2012; 40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, a kol. Předběžná charakteristika, antioxidační a hepatoprotektivní aktivitapolysacharidzCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016; 93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, a kol. Protiúnavová aktivita extraktu bohatého na fenylethanoidy zCistanche deserticola. Phytother Res. 2010; 24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X a kol. Protinádorové a protizánětlivé účinky oligosacharidů zCistanche deserticolaextrakt při poranění míchy. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, a kol.Cistanche deserticola polysacharidychrání buňky PC12 před poškozením vyvolaným OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018; 99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z a kol.Cistanche deserticola polysacharidzmírňuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních forem kyslíku. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J a kol. Downregulace TUG1 podporuje melanogenezi a UVB-indukovanou melanogenezi. Exp Dermatol. 2019; 28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Program melanocytové linie uděluje rezistenci vůči inhibici MAP kinázové dráhy. Příroda. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovanský J. "Fyziologie transkripce" tvorby pigmentu v melanocytech: ústřední role MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F a kol. Kultivované lidské melanocyty exprimují funkční toll-like receptory 2–4, 7 a 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Lidské melanocyty exprimují funkční Toll-like receptor 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, a kol. Koreluje aktivity adjuvans rodiny GLA. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC a kol. Novelapolysacharidzískaný z Craterellus cornucopioides zvyšuje imunomodulační aktivitu u imunosupresivních myších modelů prostřednictvím regulace TLR4-NF-kappaB dráhy. Funkce jídla. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR a kol. TLR-4 může zprostředkovat signální cesty AstragalapolysacharidRAP indukoval expresi cytokinů RAW264.7 buněk. J Ethnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, a kol. Bakteriální T6SS efektor EvpP zabraňuje aktivaci zánětu NLRP3 inhibicí Ca(2 plus)-dependentní MAPK-Jnk dráhy. Buněčný hostitelský mikrob. 2017; 21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: mnohostranný imunitní senzor in-Nate. Trends Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Protizánětlivé a hepatoprotektivní účinky Ganoderma lucidumpolysacharidyproti poškození jater vyvolanému tetrachlormethanem u myší Kunming. Farmakologie. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B a kol. Astragaluspolysacharidzmírňuje myší kolitidu prostřednictvím inhibice zánětu NLRP3. Planta Med. 2017; 83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J a kol. Ganoderma lucidumpolysacharidsnižuje melanogenezi inhibicí parakrinních účinků keratinocytů a fibroblastů cestou IL-6/STAT3/FGF2. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, a kol. ÚčinekpolysacharidFMP-1 z Morchella esculenta o melanogenezi v buňkách B16F10 a zebrafish. Funkce jídla. 2018; 9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, a kol. Molekulární charakteristiky a biologické aktivitypolysacharidyz vojtěšky (Medicago sativa L.). Živiny. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. Přítomnost stopových složek významně rozšiřuje molekulární odpověď Aspergillus niger na guarovou gumu. Nová biotechnologie. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, a kol. Charakterizace rostlinypolysacharidyz Dendrobium officinale vícenásobnými chromatografickými a hmotnostními spektrometrickými technikami. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Strukturní charakterizace a imunologická aktivita dvou extraktů ze studené vodypolysacharidyzCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Jak se UV světlo dotýká mozku a endokrinního systému přes kůži a proč. Endokrinologie. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Nové údaje o poruchách hyperpigmentace. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Suppl 5):18-21.

45. Sklář SJ. Vitiligo, reaktivní formy kyslíku a T-buňky. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Odhalení pravdy o antioxidantech: mitohormeze vysvětluje zdravotní přínosy vyvolané ROS. Nat Med. 2014; 20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P a kol. Kurkumin aktivuje gen hem oxygenázy-1 prostřednictvím regulace Nrf2 a prvku reagujícího na antioxidanty. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signalizace

hemoxygenáza-1 a její protizánětlivý terapeutický potenciál.

Biochem Pharmacol. 2010; 80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocyty jako "smyslové" a regulační buňky v epidermis. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Úloha melaninového pigmentu u melanomu. Exp Dermatol. 2015; 24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, et al. Úloha melanogeneze v regulaci chování melanomu: melanogeneze vede ke stimulaci exprese HIF-1alfa a doprovodných drah závislých na HIF. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.