Jak Polysacharid Cistanche Deserticola ovlivňuje vstřebávání kostí?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Polysacharid Cistanche deserticola zeslabuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních forem kyslíku

Dezhi Song a kol

Osteoporóza je metabolické onemocnění charakterizované osteopenií a poškozením kostní mikrostruktury. Osteoklasty jsou primární efektorové buňky, které degradují kostní matrix a jejich abnormální funkce vede k rozvoji osteoporózy. Akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS) během buněčného metabolismu podporuje proliferaci a diferenciaci osteoklastů, a proto hraje důležitou roli v osteoporóze.Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) má nádor,protizánětlivéa antioxidační aktivitu. Dopad osteoklastů CDPon je však nejasný. V této studii bylo použito barvení kyselou fosfatázou rezistentní na tartrát, imunofluorescence, reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce a analýza westernblot, aby se prokázalo, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhiboval osteoklastogenezi a resorpci hydroxyapatitu. Kromě toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)také inhiboval expresi genů osteoklastových markerů včetně Ctsk, Mmp9 a Acp5 a neměl žádný účinek na expresi nukleárního faktoru κB (RANK) aktivátoru receptoru. Mechanické analýzy odhalily, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresi antioxidačních enzymů k oslabení produkce ROS zprostředkované RANKL v osteoklastech a inhibuje nukleární faktor aktivovaných T buněk a aktivaci mitogenem aktivované proteinkinázy. Tyto výsledky naznačují, že CDP může představovat kandidátní léčivo pro léčbu osteoporózy způsobené nadměrnou aktivitou osteoklastů.

KLÍČOVÁ SLOVAkostní resorpce,Cistanchedeserticolapolysacharid, MAPK, osteoklasty, reaktivní formy kyslíku

1|ÚVOD

Rovnováha mezi tvorbou kosti zprostředkovanou osteoblasty a resorpcí kosti zprostředkovanou osteoklasty hraje zásadní roli při udržování metabolické homeostázy kostí (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Když kostní resorpce převyšuje kostní tvorbu, dochází k osteoporóze, která je charakterizována snížením kostní hmoty a poškozením kostní mikrostruktury (Ikeda, 2008). Osteoporóza je časté onemocnění u starších jedinců a žen po menopauze a její patogeneze není plně objasněna (Cooper & Melton, 1992). Nedostatek estrogenu je primární příčinou osteoporózy (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Kromě toho mohou být reaktivní kyslíkové druhy (ROS) indukovány receptorovým aktivátorem ligandu jaderného faktoruκB (RANKL) a jsou spojeny s tvorbou osteoklastů (Yip et al., 2005), a tak mohou přispívat k rozvoji osteoporózy (Manolagas, 2010). Některé studie zjistily, že nedostatek antioxidantu Nrf2 zvyšuje hladiny ROS a podporuje diferenciaci osteoklastů indukovanou RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Snížení produkce ROS během diferenciace osteoklastů by proto mělo být hodnoceno jako terapeutická strategie pro léčbu osteoporózy.

Osteoklasty pocházejí z monocytární nebo makrofágové hematopoetické linie a jsou jedinými vícejadernými buňkami, které provádějí kostní resorpci (Teitelbaum, 2000). Výzkum zahrnující tvorbu osteoklastů má proto velký význam při vývoji účinné léčby onemocnění kostního metabolismu (Lorenzo, 2017). Faktor stimulující kolonie makrofágů (M‐CSF) a RANKL, produkované osteoblasty a aktivovanými T buňkami, jsou důležité cytokiny, které regulují osteoklastogenezi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indukuje expresi nukleárního faktoru aktivovaných T buněk (NFATc1), což je kritický transkripční faktor aktivní během tvorby osteoklastů (Ishidaet al., 2002). Aktivovaný NFATc1 podporuje expresi genů osteoklastových markerů, jako je tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAcP) a katepsin K (CTSK), které regulují osteoklastogenezi a funkci osteoklastů (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysacharid(CDP) je izolován z masitých stonkůCistanchea má imunitní regulaci, protinádorové, antiagingové a další farmakologické účinky (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)měl inhibiční účinek na produkci oxidu dusnatého (NO) indukovanou lipopolysacharidy v myších mikrogliálních buňkách (BV‐2 buňky; Nan et al., 2013). Kromě toho extrakt bohatý na afenylethanoidy (ECD) zCistanchezlepšila schopnost plavání myší snížením poškození svalů, oddálením akumulace kyseliny mléčné a zlepšením ukládání energie (Cai et al., 2010). Nicméně účinky CDP na funkci a aktivitu osteoklastů zůstávají neznámé.

V této studii jsme prokázali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje RANKL-indukovanou diferenciaci osteoklastů a kostní resorpci. Základním mechanismem bylo CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zvyšuje expresi antioxidačních enzymů k oslabení produkce ROS a následně potlačuje signální kaskády NFAT aktivované RANKL a mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK). Tyto výsledky naznačují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)může být použit k léčbě osteoporózy způsobené nadměrnou osteoklastickou kostní resorpcí.

2|MATERIÁLY A METODY

2,1|Materiály

CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(čistota > 98 procent) byla zakoupena od Solarbio (Peking, Čína) a připravena v zásobní koncentraci 1 mM ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Protilátky jsou specifické pro c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2,TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforylovaný (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK a ‐aktin byly získány od Santa Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Protilátky proti V-ATPáze d2 byly produkovány, jak bylo popsáno dříve (H. Feng et al., 2009). Testovací systém 3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐karboxymethoxyfenyl)‐2‐(4‐sulfofenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) a luciferáza byly získány od společnosti Promega (Sydney, Austrálie). Rekombinantní M-CSF byl zakoupen od R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantní protein GST‐rRANKL byl exprimován a purifikován, jak bylo popsáno dříve (Xu et al., 2000).

2,2|Buněčná kultura

Buňky RAW264.7 (buňky myších makrofágů) byly získány z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a kultivovány v modifikovaném minimálním esenciálním médiu (Thermo FisherScientific, Scoresby, Austrálie) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra, 2 mM L-glutaminu 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (kompletní médium). Monocyty pocházející z kostní dřeně (BMM) byly izolovány z 6 týdnů starých myší C57BL/6J, které byly usmrceny podle postupů schválených Výborem pro etiku zvířat na University of Western Australia (RA/3/100/1244). vypreparovaly se měkké tkáně a kostní dřeň byla vypláchnuta z femuru a tibie, která byla poté kultivována v kompletním médiu v přítomnosti M‐CSF (50 ng/ml).

2,3|Test osteoklastogeneze

BMM byly naneseny na 96jamkové kultivační destičky v hustotě 6 × 103 buněk na jamku a ošetřeny kompletním médiem obsahujícím M-CSF (50 ng/ml) a GST-rRANKL (100 ng/ml), v přítomnosti nebo nepřítomnosti různé koncentrace CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tři jádra) byla identifikována jako osteoklasty.

2,4|Testy cytotoxicity

BMM byly nasazeny do 96-jamkových destiček v množství 6 × 103 buněk na jamku a ponechány přes noc, aby přilnuly. Následující den byly buňky inkubovány s různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Po dalších 48 hodinách byl přidán roztok MTS (20 ul/jamka) a inkubován s buňkami po dobu 2 hodin. Absorbance při 490 nm byla stanovena pomocí čtečky mikrodestiček (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Imunofluorescenční barvení

BMM byly nasazeny v hustotě 6 × 103 buněk na jamku v přítomnosti M-CSF (50 ng/ml) přes noc. Buňky byly poté stimulovány M‐CSF a GST‐rRANKL (100 ng/ml), dokud se nevytvořily zralé osteoklasty. Theosteoklasty byly poté ošetřeny různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)po dobu 48 hodin před fixací 4 procenty paraformaldehydu, permeabilizací pomocí 0,1 procenta Triton X-100-PBS a blokováním 3 procenty hovězího sérového albuminu v PBS. Připravené buňky byly inkubovány s faloidinem konjugovaným s rhodaminem po dobu 45 minut v tmavý, aby se obarvil na F-aktin. Buňky byly poté promyty PBS, jádra kontrastně obarvena 4′,6‐diamidino‐2‐fenylindolem (DAPI) a opatřena krycími sklíčky pro konfokální mikroskopii.

2,6|Test resorpce hydroxyapatitu

Pro měření aktivity osteoklastů byly BMM (1 × 105 buněk na jamku) kultivované na šestijamkových destičkách potažených kolagenem (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) stimulovány pomocí GST‐rRANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ml ), dokud nebyly generovány zralé osteoklasty (Zhou et al., 2016). Buňky byly poté jemně odděleny od destičkového roztoku pro disociaci buněk (Sigma-Aldrich) a stejný počet zralých osteoklastů byl nasazen do jednotlivých jamek v 96jamkových destičkách potažených hydroxyapatitem (Corning Osteoassay, Corning, NY). Zralé osteoklasty byly inkubovány v médiu obsahujícím GST‐rRANKL a M‐CSF s nebo bez CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)v uvedených koncentracích. Po 48 hodinách byla polovina jamek imunohistochemicky obarvena na aktivitu TRAcP, jak je popsáno výše, pro stanovení počtu vícejaderných buněk na jamku. Zbývající jamky byly běleny po dobu 10 minut, aby se odstranily buňky a umožnilo se měření resorbovaných oblastí. Resorbované oblasti byly fotografovány pod standardní světelnou mikroskopií a software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) byl použit ke kvantifikaci procentuální plochy povrchu hydroxyapatitu resorbovaného osteoklasty.

2,7|Luciferázové reportérové ​​testy

Pro zkoumání aktivace transkripce NFATc1 byly buňky RAW264.7 stabilně transfekovány luciferázovým reportérovým konstruktem reagujícím na NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekované buňky byly kultivovány na 48‐jamkových destičkách. 0,5 x 105 buněk na jamku a předem ošetřené různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na 1 hod. Po předběžném ošetření byly buňky stimulovány GST-rRANKL (100 ng/ml) po dobu 24 hodin a luciferázová aktivita byla měřena pomocí luciferázového reporterového testovacího systému podle protokolu výrobce (Promega).

2,8|Kvantitativní analýza reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (RT-PCR).

Celková RNA byla izolována z buněk pomocí činidla Trizol podle protokolu výrobce (Thermo Fisher Scientific). Komplementární DNA byla syntetizována pomocí reverzní transkriptázy viru myší leukémie Moloney s 1 ug RNA templátu a oligo‐dT primerů. Amplifikace specifických sekvencí polymerázové řetězové reakce byla provedena pomocí následujícího programu: 94 stupňů po dobu 5 minut, následovaných 30 cykly 94 stupňů po dobu 40 s, 60 stupňů po dobu 40 s a 72 stupňů po dobu 40 s a konečným prodlužovacím krokem 5 minut při 72 stupňů. Podrobné informace o specifických primerech jsou uvedeny v tabulce 1. Relativní hladiny messenger RNA byly vypočteny normalizací na expresi provozního genu Hmbs.

2,9|Western blot analýza

BMM byly kultivovány v kompletním médiu s M‐CSF v šestijamkových destičkách a stimulovány GST‐rRANKL (100 ng/ml) po uvedené časy. Buňky byly lyžovány v radioimunoprecipitačním lyzačním pufru a proteiny byly rozděleny elektroforézou na gelu dodecylsulfát sodný-polyakrylamid a přeneseny na poly(vinylidenfluoridové) membrány (GE Healthcare,Silverwater, Austrálie). Membrány byly blokovány v 5% odstředěném mléce po dobu 1 hodiny a poté sondovány různými specifickými primárními protilátkami za jemného protřepávání přes noc při 4 stupních. Membrány byly promyty a následně inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou. Reaktivita protilátek byla poté detekována pomocí zesíleného chemiluminiscenčního činidla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a vizualizována pomocí Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracelulární detekce ROS

Intracelulární hladiny ROS byly detekovány pomocí 2′,7′‐dichlorfluorescein diacetátu pro stanovení buněčného ROS detekční soupravy (Abcam, Melbourne, Austrálie). BMM (5 × 103 buněk na jamku) byly kultivovány v 96jamkových destičkách a ošetřeny RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) a CDP po dobu 72 hodin. Intracelulární hladiny ROS byly měřeny pomocí 2′,7′‐dichlorfluorescein diacetátu, který v přítomnosti ROS oxiduje na fluorescenční DCF. Buňky byly promyty v Hankově pufru a inkubovány ve tmě po dobu 30 minut s 10 uM DCFH-DA. Snímky byly získány pomocí konfokální mikroskopie.

2.11|Statistické analýzy

Všechna data jsou reprezentativní pro alespoň tři experimenty provedené třikrát, pokud není uvedeno jinak. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. K určení významnosti rozdílů mezi výsledky byla použita jednosměrná analýza rozptylu následovaná Student-Newman-Keulspost hoc testy, přičemž p < ​​0,05="" bylo="" považováno="" za="">

3|VÝSLEDEK

3,1|CDP inhibuje RANKL-indukovanou osteoklastogenezi a fúzi osteoklastů

Chcete-li zjistit, zda CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)může potlačit RANKL-indukovanou osteoklastformaci, nejprve jsme provedli test osteoklastogeneze pomocí myších BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM byly léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 5 dnů se zvyšujícími se koncentracemi CDP. CDP snížil počet TRAcP-pozitivních vícejaderných buněk při koncentraci CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)dosáhl 5 uM nebo vyšší (obrázek la,b). K vyhodnocení CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)toxicitu a potvrzení, že tyto výsledky nebyly odrazem buněčné smrti nebo počtu, provedli jsme test MTS. BMM byly léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 48 hodin s různými dávkami CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). CDP neměl žádný vliv na proliferaci BMM při koncentraci 15 uM nebo nižší (obrázek 1c).

Testovat účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)při fúzi osteoklastů byly osteoklasty indukovány léčbou RANKL a M‐CSF, s nebo bez různých dávek CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Osteoklasty byly barveny rhodamin-faloidinem a DAPI, aby se vyhodnotil počet jader na osteoklasty (obrázek 2a). Počet osteoklastů i průměrný počet nukleiperových osteoklastů se po CDP snížily(Cistanchedeserticolapolysacharid)ošetření (5–10 uM; obrázek 2b,c). Proto CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)měly inhibiční účinky na RANKL-indukovanou osteoklastogenezi a fúzi osteoklastů způsobem závislým na dávce.

3,2|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)tlumí RANKL-indukovanou osteoklastickou hydroxyapatitovou resorpční aktivitu

Pro detekci účinku CDP byl proveden test resorpce hydroxyapatitu(Cistanchedeserticolapolysacharid)na funkci osteoklastů (obrázek 3a). Po 24-hodinové inkubaci se počet osteoklastů na jamku nezměnil, zatímco plocha resorpce hydroxyapatitu byla významně snížena ošetřením 5 a 10 uM CDP ve srovnání s kontrolními skupinami (obrázek 3b,c). Tyto výsledky ukazují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má silné inhibiční účinky jak na tvorbu osteoklastů, tak na aktivitu osteoklastresorpce bez jakýchkoli cytotoxických účinků.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibuje genovou expresi osteoklastových markerů

Dále zkoumat inhibiční účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na osteoklastogenezi a osteoklastickou kostní resorpci byly BMM léčeny RANKL a M‐CSF po dobu 5 dnů s různými koncentracemi CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)Poté byla provedena .RT‐PCR k detekci exprese genů osteoklastových markerů. Exprese Nfatc1, klíčového transkripčního faktoru během osteoklastogeneze, byla inhibována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)způsobem závislým na dávce (obrázek 4a). Kromě toho CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)(5 a 10 µM) downreguloval expresi genů souvisejících s kostní resorpcí, včetně Mmp9, Ctsk a Acp5 (obrázek 4b–d).

3,4|CDP potlačuje aktivitu NFATc1 a downstream proteinovou expresi

Prozkoumat účinek CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na RANKL-indukovanou aktivitu NFATc1 byl proveden aluciferázový reportérový test. Léčba pomocí CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid), při koncentracích 5 uM a vyšších, významně inhibovaly aktivitu NFATc1 indukovanou RANKL (obrázek 5a). Kromě toho analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)významně potlačila proteinovou expresi NFATc1 a c‐Fos u BMM léčených RANKL a M‐CSF po dobu 3 a 5 dnů (obrázek 5b). Navíc exprese proteinů souvisejících s funkcí osteoklastů, jako je V-ATPáza-d2 a CTSK, byla downregulována v přítomnosti CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)ve srovnání s kontrolními skupinami. CDP však neměl žádný vliv na expresi RANK (obrázek 5b).

3,5|CDP podporuje expresi antioxidačních enzymů k odstranění produkce ROS během osteoklastogeneze indukované RANKL

Aby se prozkoumal základní mechanismus inhibice osteoklastogeneze závislé na CDP, byly BMM léčeny RANKL (100 ng/ml) a M‐CSF (50 ng/ml) spolu s PBS nebo CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)po dobu 72 hodin. Zkoumali jsme účinek CDP na intracelulární produkci ROS stimulovanou RANKL. Intracelulární hladiny ROS byly zvýšeny léčbou RANKL, která byla oslabena CDP (5 a 10 uM; obrázek 6a). Jak počet ROS-pozitivních buněk, tak intenzita barvení ROS byly sníženy ošetřením CDP způsobem závislým na dávce (obrázek 6b,c). Analýza Western blot ukázala, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)podporovaly expresi thioredoxinu (TRX1) a glutathionreduktázy (GSR), zatímco potlačovaly expresi indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (NOS2) u BMM, které byly léčeny RANKL a M-CSF po dobu 3 dnů (obrázek 6d).

Chcete-li dále prozkoumat, zda CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačili diferenciaci osteoklastů snížením produkce ROS, pak jsme BMM ošetřili peroxidem (10 uM), abychom napodobili vysoký stav ROS v buňkách. BMM byly indukovány RANKL a M‐CSF po dobu 3 dnů a výsledky analýzy westernblot a RT‐PCR ukázaly, že peroxid podporoval expresi NFATc1 a c‐Fos ve srovnání s kontrolními skupinami. V souladu s výsledky na obrázku 5 byla exprese NFATc1 a c-Fos potlačena CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zatímco peroxid zachránil inhibiční účinek CDP (obrázek 6e,f). Tato data naznačovala, že CDP potlačila expresi NFATc1 a c-Fos vychytáváním produkce ROS.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje dráhy MAPK během osteoklastogeneze indukované RANKL

Dále jsme zkoumali účinek CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)léčba na expresi TRAF6 zprostředkovanou RANKL a aktivaci dráhy MAPK. Po inkubaci v médiu bez séra po dobu 2 hodin byly BMM stimulovány RANKL, s CDP nebo bez CDP, po dobu 60 minut. Stimulace pomocí CDP (10 uM) neměla žádný vliv na expresi TRAF6 a zeslabila fosforylaci JNK2 aERK1/2 v 10 a 20 minutách (obrázek 7). Kromě toho byla fosforylace p38 významně inhibována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)léčba po dobu 60 minut ve srovnání s kontrolními skupinami (obrázek 7). Tyto údaje ukazují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje RANKL-indukované MAPK signální dráhy v souladu s jeho inhibičním účinkem na tvorbu a aktivitu osteoklastů.

4|DISKUSE

Cistanche, známý jako „pouštní ženšen“, přitahuje v poslední době velkou pozornost pro svou schopnost modulovat imunitu a působit ochranně během stárnutí a oxidačního stresu (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Bylo prokázáno, že fenylpropanoidem substituované glykosidy, hlavní aktivní složky Cistanche, inhibují NO aktivitu v makrofázích (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Kromě toho aCistancheextrakt redukoval oxidační stres v reperfundovaném myokardu po ischemii a hrál významnou roli v inhibici apoptotických drah vedoucích ke kardioprotekci (Yu, Li, & Cao, 2016). Jako důležitá součást Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)má různé farmakologické funkce. Naše současná studie zjistila, že CDP potlačila diferenciaci a aktivaci osteoklastů aktivovanou RANKL zeslabením produkce ROS a také aktivací NFAT a MAPK.

Jako kyselá fosfatáza existuje TRAcP v různých buňkách a je hojný v osteoklastech a alveolárních makrofázích (Snipes, Lam, Dodd, Gray a Cohen, 1986). TRAcP je charakteristickým enzymem osteoklastů a jeho exprese úzce souvisí s funkcí osteoklastů, která je považována za indikátor aktivity osteoklastů a kostní resorpce (Minkin, 1982). V naší studii, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhiboval počet TRAcP-pozitivních buněk, což naznačuje, že RANKL-indukovaná osteoklastogeneze byla blokována CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid). Degradace kostní matrix osteoklasty závisí na katepsinu K (CTSK) a MMP (Gruber, 2015). Zde CDP významně downreguloval expresi funkčních genů osteoklastů, jako jsou Mmp9, Ctsk a Acp5.

Diferenciace a funkce osteoklastů jsou regulovány více signálními drahami (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Po navázání na RANK RANKL rekrutuje adaptorový protein TRAF6 k aktivaci exprese NFATc1, což je důležitý transkripční faktor pro tvorbu osteoklastů, ovlivňující genovou expresi specifickou pro osteoklasty, včetně TRAcP a CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). V této studii jsme zjistili, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)neměl žádný vliv na expresi RANK a TRAF6 v osteoklastech. Nicméně CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)inhibovaly RANKL-indukovanou aktivaci NFATc1 během osteoklastogeneze BMM. Kromě toho bylo prokázáno, že ROS, produkovaný mitochondriemi v procesu dodávání elektronů, podporuje proliferaci a diferenciaci osteoklastů a reguluje degradaci kostní matrix (Ha et al., 2004). Nedávná studie zjistila, že RANKL indukoval nukleární import Bach1 a zeslabil produkci antioxidačních enzymů zprostředkovanou Nrf2, čímž zesílil intracelulární expresi ROS a osteoklastogenezi u myší (Kanzaki et al., 2017). Navíc, zvýšená tvorba intracelulárních ROS tvorbou a aktivitou homocysteinem zesílených osteoklastů (Koh et al., 2006). Naše studie zjistila, že CDP snížila akumulaci ROS v osteoklastech inhibicí exprese NOS2 a podporou exprese antioxidačních enzymů, jako je TRX1 a glutathionreduktáza. Když jsme BMM ošetřili peroxidem, abychom zvýšili intracelulární akumulaci ROS, výsledky, které zvýšily ROS mohly zlepšit expresi NFATc1, odhalily, že ROS byl před NFATc1. Také jsme zjistili, že peroxid zachránil inhibiční účinek exprese CDPon NFATc1. Naše data tedy naznačují, že CDP potlačuje akumulaci ROS pro inhibici exprese NFATc1 a poté pro tvorbu a funkci represoklastů.

ERK, JNK a p38 patří do rodiny MAPK, která se také podílí na regulaci diferenciace osteoklastů (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivuje dráhu MAPK zvýšením fosforylace ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). Ukázali jsme, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačil RANKL-zprostředkovanou fosforylaci klíčových proteinů v dráze MAPK, čímž přispěl k inhibičnímu účinku CDPon na expresi genů osteoklastových markerů. Pokud je nám známo, jedná se o první studii ukazující inhibiční účinky CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)na produkci ROS, aktivaci NFAT a MAPK, což představuje nové mechanismy účinku CDP in vitro.

V souhrnu jsme ukázali, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)zeslabuje osteoklastogenezi a resorpci hydroxyapatitu a expresi genů osteoklastových markerů včetně Ctsk, Mmp9 a Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)schopný potlačit produkci ROS zprostředkovanou RANKL, stejně jako aktivaci NFAT a MAPK (obrázek 8). Souhrnně naše výsledky naznačují, že CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)může představovat kandidátní léčivo pro léčbu stavů souvisejících s osteoklasty doprovázených nadprodukcí ROS.

OBRÁZEK ​​8 Schematický diagram CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)funkce při diferenciaci osteoklastů. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharid)potlačuje RANKL-indukovanou produkci ROS, stejně jako aktivaci NFATc1 a MAPK, a tím inhibuje osteoklastogenezi. CDP,Cistanchedeserticolapolysacharid; MAPK, mitogenem aktivovaná proteinkináza; NFATcl, jaderný faktor aktivovaných T buněk; RANKL, receptorový aktivátor jaderného faktoru κBligand; ROS, reaktivní formy kyslíku [Barevný obrázek si můžete prohlédnout na atwileyonlinelibrary.com]

PODĚKOVÁNÍ

Tato studie byla podpořena Čínskou nadací pro přírodní vědy (81572164), Národním programem pro výzkum a vývoj klíčových technologií Číny (2017YFC1103300), Nadací přírodních věd v provincii Guangxi (2016GXNSFAA380295) a Výzkumným projektem univerzitní vědy a technologie v provincii Guangxi (2017YFC1103300) ). Je také částečně podporován projektem GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards a Australian Health and Medical Výzkumná rada (NHMRC, č. 1107828 a 1027932).

STŘET ZÁJMŮ

Autoři prohlašují, že nedochází ke střetu zájmů

Z: 'Cistanchedeserticolapolysacharidzmírňuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních forem kyslíku Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684