HLA-G je široce exprimován žírnými buňkami v oblastech orgánové fibrózy v játrech, plicích a ledvinách

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktní:Již dříve jsme prokázali, že žírné buňky exprimující HLA-G jsou spojeny s oblastmi vyvolanými virem hepatitidy Cjátrafibróza. Zde jsme se zaměřili na určení, zda je exprese HLA-G v žírných buňkách specifická pro virovou etiologii,játranebo k obecnému procesu fibrózy. Vyčíslili jsme HLA-G plus buňky a žírné buňky pomocí imunohistochemie (i)játrablokuje 41 případů alkoholické cirhózy, (ii) 10 případů idiopatické plicní fibrózy (IPF) a (iii) 10 případů renalfibróza. Povaha buněk HLA-G plus byla specifikována pomocí multiplexní imunofluorescence pomocí softwaru. Více než polovina všech HLA-G plus buněk byly žírné buňky ve fifibrotických oblastech alkoholické cirhózy a IPF. Vledviny,byly vystaveny fibróze, HLA-G plus buňky byly skutečně žírné buňky, ale nemohly být spočítány. Navíc v určitých případechjátraa plic, pozorovali jsme řadu buněčných uzlin, což byly sekundární nebo terciární folikuly, ve kterých byl HLA-G vysoce exprimován B lymfocyty. Závěrem lze říci, že HLA-G plus mastocyty bylo možné pozorovat ve fifibrotických oblastech všech studovaných orgánů. Předchozí studie naznačují ochrannou roli HLA-G plus mastocytů proti zánětu a fibróze. Pozorované folikuly s B lymfocyty, které exprimují HLA-G, mohou také posílit jejich antififibrotickou roli.

klíčová slova:fibróza; HLA-G; žírné buňky; folikuly; B lymfocyty; antifibrotikum; ledviny; Játra

ÚvodChronická onemocnění, která vedou k orgánové fibróze, jsou spojena s významnou mortalitou a morbiditou, představující až 45 procent úmrtí ve vyspělých zemích [1]. Prevalence fibrotických onemocnění se neustále zvyšuje a je důležitým problémem veřejného zdraví. Fibrotická onemocnění mohou postihnout všechny orgány, napřjátra, ledviny, plíce a srdce. Patologická fibróza je charakterizována přehnaným ukládáním složek extracelulární matrix (ECM), jako je kolagen. Taková akumulace ECM ničí normální architekturu orgánu a vede k orgánové dysfunkci a selhání se změnou specializovaných funkcí každého orgánu, tj.játra, funkce detoxikace, pro plíce, funkce výměny plynů a proledvina,funkce fifiltrace. Kromě toho může fibróza podporovat rozvoj rakoviny. Transplantace k náhradě fifibrotického orgánu často představuje nejlepší terapeutickou možnost. Proces fibrózy nastává v reakci na poranění nebo poškození tkáně po přetrvávající nebo příliš silné zánětlivé reakci. Fibróza, která je zpočátku reverzibilní, se může vyvinout do ireverzibilního stavu [2]. Thejátramůže být poraněn viry (hepatitida B, C, D, E), plísňovými toxiny, parazity, autoprotilátkami, dietou s vysokým obsahem tuků a nadměrnou konzumací alkoholu, která je častou etiologiíjátrafifibróza [3] a v některých zemích dokonce převažující příčinou. Když se urážky opakují,játravyvine chronickou hepatitidu s fibrózou následovanou pokročilou fibrózou nebo cirhózou, což je predisponující stav pro hepatocelulární karcinom (HCC).

V plicích představuje idiopatická plicní fibróza (IPF) nejčastější ze skupiny onemocnění, která zahrnuje hypersenzitivní fibrózu a revmatoidní plíce. Toto chronické progresivní fibrotizující intersticiální plicní onemocnění neznámého původu je vzácné a celosvětově postihuje tři miliony lidí. IPF je však spojena s předčasným úmrtím. IPF totiž vede k pokročilému respiračnímu selhání a představuje také nezávislý rizikový faktor pro rakovinu plic [4]. Transplantace plic by měla být zvážena jako možnost u mladých pacientů s pokročilým onemocněním.

Renálnífibróza je konečnou společnou cestou mnoha progresivníchonemocnění ledvin.Výskyt chronickýchnemoc ledvin, což vede ke konečné fázinemoc ledvin, výrazně vzrostl, postihuje 10 procent celosvětové populace, s vysokou mortalitou [5]. Dále pacienti s chronnemoc ledvinmají zvýšené riziko rozvojeledvinarakoviny (až 10krát větší než u běžné populace), s častým bilaterálním a/nebo multifokálním poškozením [6].

Bez ohledu na orgán, který rozvine fibrózu, je důležité porozumět mechanismům, které se podílejí na jejím vzniku, aby bylo možné vyvinout terapie, které jí zabrání. Zejména chronický zánět vede kjátraneboledvinovéfibróza a její kontrola může umožnit omezit její progresi a nástup selhání orgánů nebo rakoviny. Cytokiny a chemokiny hrají ústřední roli jak v orientaci imunitní odpovědi, tak v udržování zánětu [7,8]. Kromě těchto imunitních molekul byly zkoumány další proteiny, jako je HLA-G, molekula HLA třídy Ib dobře známá pro své imunomodulační vlastnosti [9]. Již dříve jsme prokázali, že HLA-G je exprimován žírnými buňkami, které jsou spojeny s oblastí vyvolanou virem hepatitidy Cjátrafibróza [10,11]. V této studii jsme zkoumali, zda je exprese HLA-G v žírných buňkách specifická pro virovou etiologii, tj.játranebo proces fibrózy, bez ohledu na orgán. Charakterizovali jsme expresi HLA-G v žírných buňkách a imunitních buňkách na parafifinových blocích kohort 41 pacientů s alkoholem indukovanou cirhózou, 10 s IPF a 10 sledvinovéfibróza. Přesná identifikace buněk exprimujících HLA-G byla provedena pomocí čtyřnásobné imunofluorescence na parafifinových řezech a softwaru, který samostatně analyzuje fluorescenci a spojuje ji ve třech případechjátraalkoholem indukovaná fibróza a dva z IPF.

Výsledek

Kvantitativní exprese a povaha HLA-G plus buněk u alkoholem indukované fibrózyPočáteční imunohistochemická studie byla provedena na sérii vzorků alkoholem indukované fibrózy (n=41), což umožnilo stanovení počtu buněk HLA-G plus a CD117 plus na celých sklíčkách poloautomatickým stanovením pomocí softwaru HALO. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Buňky HLA-G plus a CD117 plus byly spočítány na celém povrchu sériových sklíček 41 případů alkoholické cirhózy pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem po imunohistochemii s 4H84, která rozpoznává HLA-G, a anti-CD117/c-kit. Průměr, standardní odchylka a rozmezí jsou uvedeny pro buňky HLA-G plus a CD117 plus: 555 ± 699 HLA-G plus /(41–2686) a 200 ± 271 buněk CD 117 plus (12–1113).

Morfologické znaky HLA-G plus buněk u alkoholem indukované cirhózy topograficky odpovídají mastocytům (obrázek 1A). V určitých případech bylo provedeno dvojité značení CD117 a lidských žírných buněk a ukázalo se, že jaterní buňky CD117 plus jsou žírné buňky ve fifibrotické oblasti (obrázek 1A). Tři reprezentativní případy alkoholem indukované cirhózy byly studovány čtyřnásobnou imunofluorescencí a barvením Sirius Red pomocí softwaru HALO k přesné identifikaci buněk HLA-G plus. Průměrná plocha fibrózy odpovídala 19,4 procentůmjátratkáň. Identifikace HLA-G buněk plus ukázala, že 51 procent jsou žírné buňky (Tabulka 2; Obrázek 1A, 1B1) definované lidskou žírnou buňkou tryptázou plus CD1177 fenotypem nebo lidskou žírnou buňkou tryptázou plus společné barvení na CD117. Žírné buňky exprimující HLA-G byly lokalizovány ve fifibrotických oblastech (obrázek 1B1). Naopak 49 procent buněk HLA-G plus nebyly žírné buňky ani buňky CD117 plus (tabulka 3) a obecně se zdálo, že jsou seskupeny jako uzliny (obrázek 1B2). Pro identifikaci těchto buněk bylo tedy provedeno jiné značení na různých zónách (tabulka 4). Rozdělení různých typů buněk HLA-G plus se lišilo v závislosti na oblastijátravyšetřená tkáň (tabulky 3 a 4). Celkově se zdálo, že 63 procent HLA-G plus buněk ve fifibrotické oblasti jsou žírné buňky oproti pouze 3 procentům v uzlinách. Kromě toho 68 procent HLA-G plus buněk v uzlinách koexprimovalo CD20, marker B lymfocytů (obrázek 1C1) a 3 procenta CD3 (obrázek 1C2). HLA-G plus CD117 tryptáza žírných buněk HLA-G plus CD117 HLA-G plus CD117 tryptáza žírných buněk plus a HLA-G plus CD117 plus tryptáza žírných buněk plus buňky byly spočítány ve třech reprezentativních případechjátrafifibróza pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem. Buňky byly počítány ve dvou různých oblastech vzorku alkoholické cirhózy, tj. fifibrotická oblast a buněčný uzel, v reprezentativním případějátrafifibróza pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem. Žádné HLA-G plus buňky koexprimují CD31, marker endoteliálních buněk nebo CD1a, marker dendritických buněk.

Obrázek 1. Povaha HLA-G buněk na reprezentativním případějátrafibróza. (A) V prvním odstavci dvě fotografie vlevo ukazují expresi HLA-G a CD117 na reprezentativním případujátrafifibróza ze 41 případů pomocí imunohistochemie, s 4H84 rozpoznávajícím HLA-G a protilátkou CD117 rozpoznávající c-kit buňky. Sklíčka byla kontrastně obarvena Mayerovým hematoxylinem. Rozpětí fibrózy je ohraničeno červenou čarou. Oblasti v kruzích topograficky odpovídají sklíčkům obarveným HLA-G a CD117. Obdélník ukazuje silné zvětšení těchto oblastí, což naznačuje, že dvě buňky HLA-G odpovídají dvěma buňkám CD117. Navíc mají morfologii kompatibilní se žírnými buňkami. Fotografie ve dvojité fluorescenci (CD117/tryptáza žírných buněk) se třemi fotografiemi vpravo odpovídajícími jednoduché fluorescenci (DAPI barví jádra modře, CD117 zeleně, tryptáza žírných buněk červeně) ukazuje většinu společně značených buněk ve žluté barvě. Buňky CD117 jsou z velké části žírné buňky. (B) Čtyřnásobná imunofluorescence na reprezentativním případějátrafifibróza (ze tří) pomocí DAPI s jádry modře, HLA-G (s protilátkou 4H84) se zelenou pseudobarvou, CD117 v azurové pseudobarvě, tryptázou žírných buněk v červené pseudobarvě a složený obraz nebo sloučení. Vpravo je znázorněno barvení Sirius Red. 1 a 2 odpovídají dvěma různým oblastemjátra,respektive rozsah fibrózy a buněčný uzel. Většina HLA-G buněk koexprimuje CD117 a tryptázu žírných buněk při fibróze (1). Naproti tomu většina HLA-G buněk koexprimuje žírné buňky, s výjimkou určitých HLA-G buněk na periferii buněčného uzlu (2), v blízkosti fibrózy nebo při fibróze. (C) Čtyřnásobná imunofluorescence na buňkách uzlujátrafifibróza zobrazená v B2, s DAPI, HLA-G se zelenou pseudo-barvou, CD20 s fuchsiově růžovou nebo CD3 s azurovou pseudo-barvou, v tomto pořadí, v 1 a 2. Porovnání zbarvení Sirius Red je vpravo. Čtverec ukazuje omezenou topograficky oblast obsahující HLA-G pozitivní buňky a odpovídající buňky v této zóně. Složený snímek ukazuje růžové společné značení HLA-G a CD20. Nebylo pozorováno žádné společné barvení mezi HLA-G se zelenou pseudobarvou a CD3 s azurovou pseudobarvou.

Absolutní počet buněk HLA-G plus, CD3 plus (T lymfocyty), CD20 plus (B lymfocyty) a žírných buněk tryptáza plus (žírné buňky) byl stanoven pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem na jednom reprezentativním případě a je vyjádřen na mm2.

Analýza HLA-G plus buněk u IPFV první studii provedené na sérii IPF (n=10) imunohistochemicky, jak bylo popsáno dříve, jsme odhadli počet buněk HLA-G plus na 135 ± 62/mm2 a počet buněk CD117 plus na 227 ± 134/mm2 (tabulka 5). Buňky HLA-G plus se neshodovaly s buňkami CD117 plus u plicní fibrózy (obrázek 2A). HALO analýza čtyřnásobné imunofluorescence a barvení Sirius Red ukázaly, že povaha HLA-G buněk se liší v závislosti na histologické oblasti plic (tabulka 6). Ve skutečnosti 63 procent HLA-G plus buněk ve fifibrotických oblastech byly žírné buňky (B1, C1), zatímco tvořily pouze 7 procent HLA-G plus buněk v uzlinách (B2, C2). Většina buněk HLA-G plus v uzlinách koexprimovala CD20 (obrázek 2B).

Obrázek 2. Povaha HLA-G buněk v reprezentativním případě IPF. (A) V prvním odstavci fotografie vlevo ukazuje zbarvení Sirius Red jednoho reprezentativního případu z deseti IPF, prostřední fotografie ukazuje kontrastní barvení Mayerovým hematoxylinem pomocí imunohistochemie. Oblasti v kroužcích topograficky odpovídají na HLA-G a CD117 barvených sklíčkách s 4H84 rozpoznávajícími HLA-G a CD117 protilátkou rozpoznávající c-kit buňky. Obdélníky ukazují silné zvětšení těchto oblastí, což naznačuje, že buňky HLA-G neodpovídají buňkám CD117. (B) Čtyřnásobná imunofluorescence na reprezentativním případějátrafifibróza ze dvou s použitím DAPI s jádry modře, HLA-G (s protilátkou 4H84) se zelenou pseudo-barvou, CD117 v azurové pseudo-barvě, tryptáza žírných buněk v červené pseudo-barvě a složený obraz nebo sloučení. Na pravé straně je znázorněna Sirius Red; 1 a 2 odpovídají dvěma různým oblastem plic, respektive rozpětí fibrózy a buněčného uzlu. (C) Pětinásobná imunofluorescence s DAPI, HLA-G se zelenou pseudobarvou, tryptáza s červenou pseudobarvou, CD3 s azurovou pseudobarvou, CD20 s fuchsiově růžovou pseudobarvou, na stejném případu IPF znázorněném na (B) . (C1) odpovídá oblasti (B1). V (C1) většina HLA-G buněk odpovídá žírným buňkám v oblasti fibrózy, zatímco velmi vzácné žírné buňky jsou HLA-G v uzlu zobrazeném v (C2). Většina buněk uzlu je CD20. Analýza HALO ukázala, že většina HLA-G plus buněk jsou B lymfocyty.

Buňky HLA-G plus a CD117 plus byly spočítány pro 10 případů pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem po imunohistochemii. Je uveden průměr, standardní odchylka a rozmezí.

Analýza HLA-G plus buněk u renální fibrózyVe studii série 10 případůledvinovéimunochemicky jsme zjistili 133 ± 102 HLA-G plus buněk/mm2 a 426 ± 207 CD117 plus buněk/mm2 (tabulka 7). Mezi buňkami HLA-G plus a CD117 plus nebyla žádná shoda (obrázek 3A).

Obrázek 3. Povaha HLA-G buněk na reprezentativním případěledvinovéfibróza. (A) V prvním odstavci fotografie vlevo ukazuje zbarvení Sirius Red, prostřední fotografie ukazuje kontrastní barvivo Mayerovým hematoxylinem pomocí imunohistochemie. Oblasti v kroužcích topograficky odpovídají sklíčkům obarveným HLA-G a CD117, přičemž 4H84 rozpoznává HLA-G a CD117 rozpoznává buňky c-kit. Červené šipky jsou pozitivní buňky. Obdélníky ukazují silné zvětšení těchto oblastí, což naznačuje, že HLA-G buňky neodpovídají buňkám CD117. (B) Čtyřnásobná imunofluorescence na reprezentativním případějátrafibróza pomocí DAPI s jádry modře, HLA-G (s protilátkou 4H84) se zelenou pseudobarvou, CD117 v azurové pseudobarvě, tryptáza žírných buněk v červené pseudobarvě a složený obraz nebo sloučení. Na pravé straně je znázorněn Sirius Red. Buňky obarvené žlutě na sloučení odpovídají HLA-G plus mastocytům. (C) Oblasti obarvené azurovou odpovídají mnoha tubulům exprimujícím pouze CD117. Buňky obarvené žlutě na sloučení odpovídají HLA-G plus mastocytům.

HLA-G plus a CD117 plus buňky byly spočítány pro 10 případůledvinovéfifibróza pomocí softwaru HALO s příslušným algoritmem po imunohistochemii. Průměr, standardní odchylka a rozmezí jsou uvedeny pro buňky HLA-G plus a CD117 plus. Čtyřnásobné značení pomocí softwaru HALO spojeného se Sirius Red a morfologická analýza ukázaly podstatnou heterogenitu značení na částiledvinanejen podle anatomické oblasti, ale také v rámci stejného anatomického kompartmentu (obrázek 3B,C). Výčet a výpočet procenta HLA-G plus buněk tedy nebyly v tomto orgánu relevantní. Mikroskopické vyšetření skutečně prokázalo silné zbarvení obvodu tubulů CD117, které se neznačilo společně s obvodem žírných buněk (obrázek 3C). HLA-G plus buňky jsou žírné buňky a jsou umístěny v zánětlivém intersticiu (obrázek 3B,C).

DiskuseExprese HLA-G proteinů byla poprvé prokázána v cytotrofoblastech na rozhraní plodu a matky [12]. Za bazálních podmínek je jeho exprese do značné míry omezena na specifické tkáně, jako je rohovka [13], brzlík [14] a ostrůvky pankreatu [15]. Některé typy buněk jsou však také schopny ji exprimovat, jako jsou bronchiální epiteliální buňky [16], mezenchymální buňky [17], buňky monocytární linie [18–20] a erytroidní a endoteliální prekurzory [21], ve zvláštních podmínkách . Již dříve jsme prokázali, že žírné buňky mohou exprimovat HLA-G v bazálním stavu se zvýšenou expresí v určitých prostředích bohatých na cytokiny, zejména fifibrotickéjaterní tkáně.Zkoumali jsme, zda HLA-G může být exprimován žírnými buňkami spojenými sjátrafibróza z jiné etiologie nebo fibróza v jiném orgánu studiem 41 případů vyvolaných alkoholemjátracirhóza, 10 z IPF a 10 zledvinovéfibróza.

Infekce, toxická a metabolická poškození a idiopatická zánětlivá onemocnění mohou podporovat rozvoj fibrózy, protože chronické poškození indukuje apoptózu parenchymálních buněk, které uvolňují profibrogenní a zánětlivé cytokiny, jako je TGF-. Buňky produkující kolagen se v reakci na poranění diferencují od rezidentních mezenchymálních buněk. Epiteliální k mezenchymálnímu přechodu je fenomén transdiferenční entiace buněk, který je pozorován u cholangiocytů vjátra, pneumocyty v plicích a tubulární epiteliální buňky vledvina[22]. Apoptotické buňky vyvolávají zvýšení koncentrace TGF- ve všech orgánech. V různých orgánech však lze rozlišit specifické rysy fifibrogeneze. Vjátra,apoptóza se týká hepatocytů, zatímco postihuje epiteliální buňky v plicích aledvina[22]. Tudíž rezidentní fibroblasty vledvinaa plíce se aktivují na myofifibroblast exprimující a-SMA, kolagen1, zatímcojátramyofifibroblasty si zachovávají své nervově specifické markery [23].

Vjátra,jaterní hvězdicové buňky přispívají více než 80 procenty všech buněk produkujících kolagen. V plicích je poškození pneumocytů spojeno s apoptózou endoteliálních buněk. Role zánětu u IPF je kontroverzní. Typická IPF nevykazuje příliv zánětlivých buněk, ale někteří autoři předpokládají roli zánětu v diferenciaci plicních fifibroblastů na myofifibroblasty produkující ECM [24]. Na IPF se podílejí opakované alveolární epiteliální léze neznámé etiologie a apoptóza alveolárního epitelu [25]. Vledvinaajátra,myelomonocytární buňky se rekrutují z kostní dřeně a představují 14 až 15 procent a 8 až 12 procent myofifibroblastů. V plicích není pozorována žádná reverzibilita fibrózy na rozdíl odjátraaledvinapři absenci zranění a pokud nebylo dosaženo bodu, odkud není návratu. Zánětlivé procesy jsou u IPF skutečně omezené, zejména v časné fázi onemocnění, zatímco opakované alveolární epiteliální léze neznámé etiologie a apoptóza alveolárního epitelu mohou podporovat proliferaci a aktivaci plicních fifibroblastů nebo myofifibroblastů [25].

Pokud jde ojátrafifibróza, neúspěšný proces hojení ranledvinatkáně po chronickém, trvalém poranění vede k produkci a sekreci prozánětlivých cytokinů, stejně jako TGF-, který hraje klíčovou roli ve fifibrotickém procesu. Například vjátrafifibróza, TGF-, která je vyjádřena jako nepatrné množství v klidovém HSC, je rychle produkována tímto typem buněk popoškození jater.Kromě HSC byly popsány další zdroje TGF- jako krevní destičky, makrofágy, hepatocyty a také mastocyty [26]. TGF- 1 je uložen v matrici ve své latentní formě a jakmile je aktivován, podporuje přechod z fifibroblastu na myofifibroblast, což je zásadní pro proces fibrózy. Kromě toho inhibuje degradaci ECM potlačením metaloproteáz a podporou přirozeného inhibitoru TIMP. Indukuje tedy produkci ECM prostřednictvím SMAD3-závislých nebo neasociovaných mechanismů [27]. Ve skutečnosti existuje vzájemná interakce mezi žírnými buňkami a TGF-. TGF- je silný atraktant pro žírné buňky; ve skutečnosti jsou patologické procesy zprostředkované TGF- často spojeny s akumulací žírných buněk [28]. Žírné buňky jsou navíc jedním z primárních zdrojů IL-17, které řídí fifibrózu závislou na TGF- - [29]. Bylo také popsáno, že TGF- podporuje nebo potlačuje funkce žírných buněk. TGF- skutečně inhibuje expresi vysokoafinitního IgE receptoru Fc1RI, který aktivuje žírné buňky [30]. Na druhé straně inhibuje proliferaci žírných buněk, degranulaci a produkci několika efektorových molekul, jako je histamin a TNF- [31]. Vzhledem ke zvýšení MC u fibrózy může být vliv TGF- na funkce MC důležitý při regulaci zánětlivých odpovědí, které udržují proces fibrózy.

Jako u hepatitidy C vyvolané viremjátrafibrózou, zjistili jsme, že polovina HLA-G plus buněk u alkoholem indukované cirhózy jsou žírné buňky (tabulka 2) a pouze 34 procent žírných buněk exprimovalo HLA-G, s vysokou individuální variabilitou ukázanou směrodatnou odchylkou (tabulka 1) . Kromě toho jsme pozorovali zřetelné rozdělení podle regionujátra,ve kterých 63–92 procent HLA-G plus buněk ve fifibrotických oblastech byly žírné buňky, zatímco pouze 3–23 procent byly žírné buňky v buněčných uzlinách (tabulka 3). Podobně je u mastocytů pozorován odlišný vzorec, protože 92 procent mastocytů ve fifibrotických oblastech exprimovalo HLA-G, zatímco pouze 23 procent exprimovalo HLA-G v buněčných uzlinách (data nejsou uvedena). Exprese HLA-G tedy není omezena na virovou etiologiijátracirhóza. Ve skutečnosti jsme získali podobný výsledek pro plíce. U IPF bylo 63 procent HLA-G plus buněk ve fifibrotických oblastech žírné buňky, zatímco pouze 7 procent z těch v uzlinách byly žírné buňky (tabulka 6). Případyledvinovéfibróza byla zvláštní. V důsledku velkého počtu tubulů nebylo možné správně spočítat buňky ve fifibrotických oblastech, protože žírné buňky infifiltrovaly tubuly. Bylo možné provést pouze kvalitativní mikroskopické pozorování, které ukázalo, že řada HLA-G plus buněk jsou žírné buňky, aniž by bylo možné odlišit tubuly od fifibrotických oblastí (obrázek 3). Zdá se tedy, že HLA-G je exprimován žírnými buňkami při fifibrotickém onemocnění prostřednictvím buněčného povrchu a intracytoplazmatických molekul, bez ohledu na orgán. Již dříve jsme prokázali, že lidské žírné buňky v kultuře byly schopny produkovat rozpustné formy HLA-G v kondicionovaném médiu v bazálním stavu a že sekrece se zvýšila po stimulaci cytokiny, včetně IL-10 [10].

Vyšší procento žírných buněk (více než polovina) exprimujících HLA-G vjátraa plíce lze vysvětlit zánětlivými složkami fibrózy. Jako vrozené imunitní buňky se počet žírných buněk při zánětlivých stavech zvyšuje a mohou také uvolňovat prozánětlivé mediátory [32]. Počet žírných buněk je zvýšený u fibrotických onemocnění. Hustota žírných buněk je skutečně vyšší v plicích pacientů s IPF než u pacientů s jinými plicními patologiemi [33] a normálními plícemi. Podobně i člověkonemocnění ledvinjsou doprovázeny zvýšením počtu žírných buněk vledvinovékortexu, zejména v oblasti fibrózy [34], protože mastocyty jsou u zdravých pozorovány jen zřídkaledviny.

Předchozí publikace uváděly, že žírné buňky v normálních lidských játrech, plicích a normálních lidských játrech chybí nebo se vyskytují jen zřídkaledviny[35]. Pokrok ve znalostech o žírných buňkách ukázal, že žírné buňky jako vrozené imunitní buňky lze pozorovat ve všech tkáních, ale jsou hojnější na místech vystavených prostředí. Navíc vykazují velký repertoár receptorů, které jim umožňují reagovat na podněty a interagovat s jinými buňkami [36].Renálnížírné buňky funkčně připomínají ty v plicích. Pro úlohu žírných buněk při fibróze byly hlášeny protichůdné údaje. Řada autorů navrhla, že žírné buňky se podílejí na fibróze, protože hrají roli v akutním a chronickém zánětu, který jej iniciuje. Žírné buňky jsou navíc schopny vylučovat histamin, heparin a IL-4, které zvyšují proliferaci fibroblastů. Jiní [37,38], včetně nás [39] však prokázali, že žírné buňky hrají antififibrotickou roli: například na zvířecích modelech, jako jsou Ws/Ws myši a krysy s deficitem žírných buněk. Okazaki a kol. ukázali, že indukovaná fibróza byla závažnější u potkanů ​​s deficitem žírných buněk než u potkanů ​​divokého typu [38].

Navíc bylo prokázáno, že žírné buňky jsou u rakoviny polarizované, podobně jako makrofágy [40]. Protizánětlivé mastocyty exprimují cytokiny, jako je IL-10, a jejich počet je nepřímo spojen se závažností zánětu, zatímco prozánětlivé mastocyty odpovídají prozánětlivému nastavení. Je pravděpodobné, že protizánětlivé žírné buňky exprimují zejména HLA-G, protože (i) v několika modelech byla prokázána souvislost mezi hladinami IL-10 a expresí HLA-G a (ii) HLA-G má protizánětlivý účinek. Žírné buňky exprimující HLA-G mohou být přítomny v rané fázi onemocnění, během zánětlivé fáze, aby působily proti zánětu, který je první reakcí na lézi. V literatuře bylo uvedeno, že Il-10 může snížením zánětlivé odpovědi inhibovat proliferaci a syntézu kolagenu myofifibroblastů [41]. IL-10 může u alkoholika skutečně hrát ochrannou rolinemoc jater[42]. Naproti tomu u pacientů s IPF byly zjištěny vyšší sérové ​​hladiny IL-10 než u normálních jedinců a nejvyšší hladina IL-10 v bronchoalveolární laváži byla prokázána u pacientů s IPF ve srovnání se sarkoidózou nebo hypersenzitivní pneumonitidou [43]. To bychom mohli vysvětlit méně důležitou zánětlivou složkou. vledvinovéfibrózou, bylo na myším modelu prokázáno, že nedostatek IL-10 se zhoršilledvinazáněty a fibrózy [44]. U lidí léčba lokální IL-10 imunoterapií spojenou s antagonistou TGF zlepšuje chronickounemoc ledvin [45].

Dalším relevantním výsledkem je pozorování HLA-G plus buněk v buněčných uzlinách v blízkosti fifibrotických oblastí ve vzácných případech alkoholické cirhózy. Tyto buňky jsou morfologicky charakterizovány shlukem snadno rozpoznatelných buněk malé až střední velikosti, což naznačuje lymfoidní agregát. Jejich morfologické charakteristiky naznačují folikuly, což jsou struktury tvořené převážně B lymfocyty. Čtyřnásobná imunofluorescence v uzlinách tuto hypotézu potvrdila, protože 68 procent HLA-G plus buněk koexprimovalo CD20, což je specifický marker B lymfocytů (tabulka 3). Podobné struktury byly také pozorovány u IPF s podobným výsledkem, který ukazuje, že 76 procent HLA-G plus buněk v uzlinách jsou B lymfocyty (tabulka 6). Lymfoidní neogeneze byla popsána u fibrózy. Za určitých patologických stavů, jako je přetrvávající zánět, se tedy buněčné agregáty mohou vyvinout do vysoce organizované struktury připomínající sekundární lymfoidní tkáň, tj. terciární lymfoidní orgány nebo ektopické lymfoidní folikuly [46]. Takové lymfoidní folikuly obsahují oblasti bohaté na T-buňky a odlišné folikuly B-buněk s germinálními centry [47]. Mechanismus, kterým infifiltrující B buňky organizují ektopický folikul a germinální centrum, je řízen lymfotoxinem- 1 2 a lymfoidními chemokiny, jako je CC-chemokinový ligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-chemokinový ligand 12 (CXCL12) a CXCL13, které regulují navádění lymfocytů. Kromě lymfotoxinu a chemokinů je k indukci a udržení tvorby folikulů nutná také antigenní stimulace. Takové folikuly nebyly pozorovány v naší kohortě vyvolané virem hepatitidy Cjátrafifibróza a byly nalezeny pouze v jednom ze tří případů vyvolaných alkoholemjátrafibróza, což naznačuje odlišné stadium onemocnění. Funkce ektopických lymfoidních orgánů a jejich korelace se zánětem a fibrózou není dosud jasná. Řada studií prokázala novou a překvapivou roli B-buněk v regulaci fifibroblastů při fibróze, ve které je jejich profifibrotický účinek analogický s profifibrotickým účinkem TGF- a je také zesílen faktorem aktivujícím B-buňky (BAFF) [48].

Význam buněčného zdroje HLA-G u fibrózy je nejen popisný, ale také funkční. HLA-G má prostřednictvím svých specifických receptorů, jako jsou ILT2 a ILT4, inhibiční účinek na funkci všech typů lymfocytů [49] a dendritických buněk [20,50]. Přítomnost HLA-G na těchto imunitních buňkách, kromě toho, že je markerem zánětu, je také známkou vhodné imunitní reakce tím, že také snižuje zánět. Je skutečně známo, že HLA-G hraje ochrannou roli proti přehnaným zánětlivým reakcím, jak bylo dříve prokázáno u septického šoku [51]. Kromě toho jsme již dříve studovali vzájemnou interakci mezi žírnými buňkami a jaterními hvězdicovými buňkami a ukázali jsme, že vede k přitahování žírných buněk a významnému snížení produkce kolagenu buňkami HSC prostřednictvím produkce HLA-G [39]. Kromě toho může exprese HLA-G B buňkami v ektopických folikulech také přispívat k potlačení profifibrotického účinku B lymfocytů na myofifibroblasty inhibicí B buněk prostřednictvím autokrinního mechanismu.

Pacienti a metody

PacientiKohorta 41játrabyli studováni pacienti po transplantaci s cirhózou způsobenou alkoholem. Pacienti byli informováni o protokolu a byla zjištěna nepřítomnost námitek (nemocniční etická komise, oznámení č. 16.47). Deset vzorků parafinových blokůledvinovéfifibróza a 10 IPF (nemocniční etická komise, oznámení č. 16.123), zcela a nevratně anonymizované, byly studovány v souladu s principy Helsinské deklarace. Klinické a biologické charakteristiky těchto tří kohort jsou shrnuty v tabulkách 8–10.

Metodologie

Imunohistochemie a imunofluorescenceTkáně byly odvozeny z explantovanýchjátraaledvinovénebo plicní biopsie. Byly připraveny sériové řezy zalité v parafifinu (tloušťka 4 um) a bylo provedeno standardní histologické barvení, tj. barvení HES a značení kolagenu Sirius Red. Paralelně byla provedena imunohistochemie a imunofluorescence na sériových řezech řezů zalitých v parafifinu ze stejného bloku po deparafinizaci a protokolu pro získání antigenu. Primární protilátky (mAb) byly následující: monoklonální myší anti-lidský HLA-G (Exbio, 4H84 2 µg/ml nebo 1:100, Vestec, Česká republika), polyklonální králičí anti-lidský CD117/c-kit , rozpoznávající myeloidní a žírné buňky (Dako, 1:200, Copenhagen, Dánsko), myší monoklonální anti-lidská (hum) mastocytární tryptáza (klon AA1, Dako, 1:1000), specifická pro žírné buňky, monoklonální anti-lidská CD3 (Thermo Scientifics, SP7, 1:500, Waltham, MA, USA), specifické pro T lymfocyty a monoklonální anti-humánní CD20 (Dako, M0755, 1:600), specifické pro B lymfocyty.

Stručně řečeno, sklíčka pro imunohistochemii byla inkubována s primární protilátkou v automatickém systému Discovery Ultra (Roche, Meylan, Francie). Vázaná primární protilátka byla odhalena pomocí biotinylované kozí anti-myší nebo anti-králičí IgG sekundární protilátky (Vector, ABCYS, les Ulis, Francie, 1:70}0) a diaminobenzidinu (detekční souprava DAB MAP, Roche , Meylan, Francie), následované zbarvením Mayerovým hematoxylinem. Abychom přesně určili povahu HLA-G plus buněk, trojité (DAPI, CD117, tryptáza žírných buněk), čtyřnásobné (DAPI, HLA-G, CD117, tryptáza žírných buněk) a pětinásobné (DAPI, HLA-G, CD3, CD20, žírné buňky tryptáza) imunoflfluorescenční barvení bylo poté provedeno na třech reprezentativních případech alkoholem indukované cirhózy a dvou reprezentativních případech IPF. Odhalení bylo provedeno pomocí souprav Discovery FAM, rhodamin, DCC a Cy5 (Ventana Medical systems, Illkirch, Francie). Po obarvení byl obraz celého povrchu řezu digitalizován při 20× nebo 40× zvětšení pomocí konfokálního skeneru (Pannoramic Scanner, 3DHistech, Budapest, Maďarsko). Imunohistochemie a multiplexní imunofluorescenční barvení byly analyzovány pomocí softwaru pro digitální analýzu HALO (V3.0.311). Software byl trénován k rozpoznání fifibrózy (Sirius Red) pomocí modulu Area Quantifification (V2.1.3), zatímco modul Fish-IF (v1.2.2) byl trénován pro vzorky označené barvivy. Celé řezy každého vzorku byly vybrány pro analýzu s odpovídajícím algoritmem. Data byla extrahována do tabulkového softwaru pro analýzu.

ZávěrTato práce spojená s našimi předchozími datovými experimenty o antiprotektivní roli žírných buněk prostřednictvím exprese HLA-G [39] naznačuje, že žírné buňky hrají antififibrotickou a ochrannou roli prostřednictvím exprese HLA-G ve fifibrotických situacích. Tuto roli posilují B lymfocyty exprimující HLA-G v ektopických folikulech. Celkově tato zjištění naznačují ochrannou roli HLA-G exprimovaného žírnými buňkami ve fifibrotických orgánech.