Imunoglobulinová nefropatie je charakterizována antikomenzálními humorálními imunitními reakcemi

IgA nefropatie(IgAN) jehlavní příčinou selhání ledvin, přesto se o něm ví jen máloimunopatogeneze tohoto onemocnění. IgAN je charakterizován ukládáním IgA vledvinové glomeruly, ale zdroj a stimul pro produkci IgA nejsou známy. Klinická a experimentální data naznačují roli proaberantní imunitní reakcena slizniční mikrobiotu v IgAN a v některých zemích s vysokou prevalencí onemocnění je tonzilektomie považována za standardní léčbu. Abychom vyhodnotili vztah mezi mikroflórou a slizničními imunitními reakcemi, charakterizovali jsme mikroflóru mandlí u pacientů s IgAN oproti nepříbuzným účastníkům domácí kontrolní skupiny aidentifikoval zvýšený přenos roduNeisserie a zvýšené sérové ​​IgA cílené na Neisserie u pacientů s IgAN. Tato zjištění jsme zpětně přeložili v experimentálním IgAN řízeném nadměrnou expresí BAFF u BAFF-transgenních myší, které se staly náchylnými k infekci Neisseria zavedením humanizovaného transgenu CEACAM-1 (B × hC-Tg). Kolonizace myší B × hC-Tg Neisseria poskytla zvýšené hladiny systémového IgA specifického pro Neisseria. Pomocí vlastního testu ELISPOT jsme v ledvinách těchto myší objevili buňky vylučující IgA specifické proti Neisserii. Tato zjištění naznačují roli cytokinů řízených aberantních slizničních imunitních odpovědí na orofaryngeální patobionty, jako je Neisseria, v imunopatogenezi IgAN. Kromě toho v přítomnosti nadbytku BAFF může být IgA specifický pro patobionta produkován in situ v ledvině.

NOVÝ BYLINNÝ PROIGA NEFROPATIEPOMOCÍPŘÍČINA SELHÁNÍ LEDVIN

Zavedení

Mechanismy, které jsou základem patogeneze IgA nefropatie (IgAN), jsou málo pochopeny, přesto je jednou z nejčastějších příčin selhání ledvin. Široce přijímaná hypotéza „multi-hit hypothesis“ pro vývoj IgAN se zaměřuje na produkci patogenních imunokomplexů IgA s deficitem galaktózy1- v oběhu a uložených v ledvinových glomerulech pacientů s IgAN (1). Zdroj (tj. lymfoidní tkáně spojené se sliznicí a/nebo kostní dřeň) a stimuly pro produkci imunitního komplexu nejsou známy. Nedávno jsme prokázali, že plazmatické buňky produkující IgA ze střeva mohou migrovat do tkání neimunitního systému, jako je zanícený mozek v experimentálním modelu encefalitidy roztroušené sklerózy, což radikálně mění převládající názory na vlastnosti plazmatických buněk (2). Je proto lákavé spekulovat o tom, že buňky vylučující IgA odvozené ze sliznice by mohly být rekrutovány i do jiných orgánů, jako jsou ledviny.

Klinické a experimentální důkazy naznačují souvislost mezi IgAN a slizničními mikrobiálními expozicemi. Pacienti s IgAN mají makroskopickou hematurii souběžně s faryngitidou [3] a tonzilektomie je v Japonsku považována za standardní péči o pacienty s IgAN [4–6]. Naše předchozí studie myšího modelu IgAN naznačují, že komenzální mikrobiální kolonizace je nezbytná pro vývoj IgAN u myší nadměrně exprimujících člena rodiny TNF BAFF (7, 8). Tento model sdílí mnoho vlastností s lidským IgAN, včetně podglykosylovaného IgA; klinická a histologická měření poškození ledvin, jako je proteinurie; a IgA-dominantní glomerulonefritida (7, 8). Lokus TNFSF13 (APRIL) byl následně spojen s IgAN v celogenomových asociačních studiích (9). Protože APRIL a BAFF sdílejí podobné receptory, je osa BAFF/APRIL zapojena do patogeneze onemocnění IgAN.

Proto jsme předpokládali, že při nastavení vysokých hladin BAFF/APRIL se buňky vylučující IgA odvozené ze sliznice rekrutují do ledvin a přispívají k rozvoji IgAN. Abychom otestovali tuto hypotézu, charakterizovali jsme profily mikrobiomu mandlí a stolice velké kohorty pacientů s IgAN ve srovnání s účastníky nepříbuzné kontrolní skupiny v domácnosti. V krvi naší kohorty pacientů jsme identifikovali zvýšené nosičství neisserie na mandlích a zvýšenou produkci anti-Neisserie cíleného IgA. Tato pozorování jsme zpětně převedli do experimentálního modelu IgAN a zjistili jsme, že zvýšené hladiny BAFF vyvolaly zvýšenou systémovou imunitní reakci ovlivněnou IgA na slizniční expozici Neisseria. Zaznamenali jsme zvýšenou expresi RNA kódující sekretovanou sestřihovou variantu IgA v ledvinách našich experimentálních myší, což naznačuje lokální transkripci IgA. Pomocí vlastního ELISPOT jsme zjistili, že v ledvinách těchto myší byly detekovatelné buňky vylučující IgA specifické proti Neisserii. Naše zjištění ukázala, že maladaptivní odpověď hostitele na komenzální organismus byla spojena s onemocněním IgAN a náborem komenzálně specifických buněk sekretujících IgA do ledvin

Výsledky

Analýza 16s rRNA odhaluje změny v tonzilárním mikrobiomu pacientů s IgAN ve srovnání se zdravými kontrolami.

Vzhledem ke spojitosti mezi faryngitidou a hematurií u IgAN (4) jsme porovnali mikrobiotu mandlí a stolice kohorty pacientů s IgAN (n=93) s mikroflórou zdravých nepříbuzných jedinců v domácnosti (n {{3} }) pomocí sekvenování 16S rRNA V4. Klinické charakteristiky jsou uvedeny v tabulce 1. Nepozorovali jsme žádné statisticky významné rozdíly v Shannonově diverzitě nebo taxonomické bohatosti mezi případy a zdravými kontrolními vzorky mandlí (doplňkový obrázek 1; doplňkový materiál dostupný online s tímto článkem; https://doi.org/ 10.1172/jci.insight.141289DS1). Dominantní rod tonsil se mezi případy a kontrolami lišil (obrázek 1A), s trendem k rozdílům v Neisseria jako dominantním rodu ve vzorcích IgAN mandlí (χ2 test, P=0.15). Vyhodnotili jsme proto rozdíl v relativní abundanci (RA) Neisseria (obrázek 1B) a potvrdili jsme přítomnost významně vyššího výskytu Neisserie na mandlích v IgAN ve srovnání s kontrolami (2-neupravený t-test P {{19} }.002). Nebyly zaznamenány žádné rozdíly v rozmanitosti nebo taxonomické bohatosti mikrobioty stolice v IgAN ve srovnání s kontrolami (doplňkový obrázek 2).

Humorální imunitní reakce na Neisseria jsou u pacientů s IgAN vychýleny směrem k IgA versus IgG. Na základě pozorovaných rozdílů v tonzilární mikrobiální abundanci jsme předpokládali, že pacienti mohou vykazovat změněné titry antikomenzálních protilátek v jejich oběhu. Protože Neisseria představovala nejhojnější rod u pacientů, měřili jsme humorální odpovědi anti-Neisseria a vyhodnocovali poměr anti-Neisseria IgA k anti-Neisseria IgG v séru. Tento poměr je uváděn jako průměrná odpověď IgA/IgG proti panelu 4 kommenálních druhů Neisseria (anti-N. lactamica, N. sicca, N. cinerea a N. flavescens) a 4 patogenních N. men gingivitis (Nme) kmeny (90/18311, H4476, 208 a 860800). Jak je znázorněno na obrázku 2, pacienti s IgAN vykazovali zvýšení poměru titrů plazmatických IgA/IgG anti-Neisseria protilátek. Zvýšené titry IgA proti Neisseria byly pozorovány v reakci na patogenní Nme i komenzální kmeny (doplňkový obrázek 3). Proto pacienti s IgAN vykazovali ve srovnání se zdravými kontrolami tendenci k vytváření zvýšené IgA odpovědi na různé druhy komenzálních Neisseria a kmeny Nme.

Vliv nadměrné exprese BAFF na imunitní odpověď na Nme u BAFF-transgenních myší. Již dříve jsme uvedli, že cytokin APRIL (TNFSF13) byl zvýšen v séru pacientů s IgAN ve srovnání s kontrolami ve 2 nezávislých kohortách (8). Potvrdili jsme, že DUBEN byl u pacientů s IgAN v současné kohortě zvýšený (medián 1,98 vs. 1,55; IQR 1,75, {{10}},38; P < 0,01). Navíc jsme pozorovali pozitivní korelaci mezi hladinami APRIL v séru a proteinurií (Spearmanovo ρ=0,28, P=0,01). Stejně jako v naší předchozí studii jsme nepozorovali rozdíly v hladinách BAFF v séru.

APRIL se váže na TACI, TNF receptor, který podporuje změnu třídy na IgA (10). TACI je také stimulován multimery BAFF vyššího řádu a nadměrná exprese BAFF u BAFF-transgenních (BAFF-Tg) myší je dostatečná ke stimulaci TACI, čímž napodobuje signál APRIL/TACI (11). Důležité je, že jak stárnou, myši BAFF Tg vykazují onemocnění podobné IgAN charakterizované podglykosylovaným IgA v séru, ukládáním IgA v ledvinách, zvýšenou proteinurií a patologií ledvin (8). Již dříve jsme ukázali, že mikrobiota je základním kofaktorem podporujícím ukládání imunitních komplexů IgA v ledvinách BAFF nad tlakem BAFF-Tg myší (8). To znamená, že interakce hostitel-mikrobiom může hrát roli v etiologii IgAN, alespoň u myší. V našich předchozích studiích jsme však nehodnotili, zda by konkrétní mikrobiální kandidáti mohli urychlit patogenezi onemocnění podobného IgAN u myší BAFF-Tg.

Proto jsme dále zkoumali možnost, že u myší s nadměrnou expresí BAFF mohou být pozorovány imunitní reakce cílené na Neisseira a ovlivněné IgA. Name infikuje epitel prostřednictvím receptoru CEACAM-1. Protože se Name váže na lidi, ale ne na myši CEACAM-1, křížili jsme myši BAFF-Tg s myšmi, které exprimují lidskou formu CEACAM-1 (hC-Tg), abychom vytvořili dvojitě transgenní myši (B × hC- Tg). Transgenní myši a jejich kontroly ze stejného vrhu byly nazálně infikovány Nme a následně byly odebrány sérum a nosní výplachy pro analýzu. Jak je znázorněno na obrázku 3A, ačkoli myši hC-Tgneg (WT) nebyly znatelně kolionizovány Nme, hC-Tg a B × hC-Tg myši vykazovaly podobnou míru kolonizace Nme (80 % vs. 100 %, P {{ 15}} NS) a podobné bakteriální zátěže (192,9 vs. 116,7, P=NS) 5 dní po infekci. Tato data naznačují, že myši B × hC-Tg neměly změněné rychlosti kolonizace Nme ve srovnání s myšmi WT.

Již dříve jsme ukázali, že k navození imunity proti následné třetí nosní infekci u hC-Tg myší jsou zapotřebí 2 nosní infekce (12). Abychom určili, zda myši B × hC-Tg vykazovaly zlepšenou clearance Nme ve srovnání s kontrolami hC-Tg, jsme myši nazálně infikovali dvakrát, ve dnech 1 a 14. 24 hodin po sekundární infekci byla míra infekce hC-Tg myší a B × hC-Tg myši byly podobné (85 % vs. 80 %), což prokazuje nedostatek neutralizační imunity vyvolané 1 předchozí expozicí Nme (obrázek 3B). To znamená, že nadměrná exprese BAFF neeliminovala potřebu 2 infekcí k indukci ochrany proti kolonizaci v našem myším modelu.

Vzhledem k tomu, že nebyl žádný zřejmý dopad nadměrné exprese BAFF na nosní vnímavost k Nme, podívali jsme se na odpověď myších protilátek na kolonizaci Nme. Nejprve jsme hodnotili lokální IgA a IgG odpověď na Nme. Nosní Nme-specifický IgG, jak byl hodnocen v nasofaryngeální lavážní tekutině, nebyl detekován u žádné myši a nazální anti-Nme IgA titry byly podobné pro B × hC-Tg i hC-Tg myši (obrázek 3C). Dále měříme systémovou protilátkovou odpověď na infekci Nme. Po druhé nosní infekci vykazovaly myši hC-Tg i B × hC-Tg Nme-specifickou IgG odpověď v séru nad výchozí hodnotou, přičemž myši hC-Tg vykazovaly průměrný titr anti-Nme IgG 2-krát vyšší než že u B x hC-Tg myší (164 ng/ml vs. 54,6 ng/ml) (obrázek 3D). Naproti tomu myši B × hC-Tg vykazovaly průměrný titr anti-Nme IgA v séru, který byl 10-krát vyšší než u kontrol hC-Tg (321,7 ng/ml vs. 33,09 ng/ml) (obrázek 3E) . Celkově naše zjištění prokázala, že zatímco místní IgA odpověď na Nme byla srovnatelná mezi hC-Tg a B × hC-Tg myšmi, systémová humorální imunitní odpověď na expozici nazálního Nme byla u B × hC-Tg myší ovlivněna IgA (obrázek 3F).

Vliv kolonizace Nme na IgA v ledvinách myší BAFF-Tg. Vzhledem k tomu, že systémové hladiny IgA specifického pro Nme byly významně zvýšené u myší BAFF-Tg, předpokládali jsme, že kombinace transgenu BAFF a infekce Nme může urychlit patologii ledvin ve srovnání s neinfikovanými myšmi BAFF-Tg. Zhodnotili jsme proto glomerulární mezangiální expanzi barvením řezů ledvin kyselinou jodistou – Schiff (PAS). Pomocí semikvantitativního skóre mesangiální expanze jsme pozorovali nevýznamný trend ke zvýšené mezangiální expanzi u B × hC-Tg myší (obrázek 4, A a B).

Dále jsme zkoumali dopad infekce Nme na ukládání IgA v ledvinách, diagnostický znak IgAN. Pomocí imunohistochemie nebylo u žádné myši detekováno ukládání mezangiálního IgG (data nejsou uvedena). Navíc jsme nepozorovali mezangiální IgA v ledvinách myší WT nebo hC-Tg. Naproti tomu myši B × hC-Tg a BAFF-Tg vykazovaly ukládání IgA v oblastech mezangiální expanze PAS+ (reprezentativní část na obrázku 4C). Pro kvantitativnější analýzu byla exprese mRNA kódující sekretovanou sestřihovou formu IgA hodnocena pomocí kvantitativní PCR v ledvinách všech skupin myší (obrázek 4D). Mezi skupinami byl významný rozdíl v expresi sekretované sestřihové formy IgA (Kruskal-Wallis 1-way ANOVA, P=0.01), s dvojitě transgenními myšmi (B × hC-Tg) prokazující významně vyšší hladiny exprese IgA ve srovnání s jinými experimentálními skupinami (Dunnův vícenásobný srovnávací test upravil P < 0,05 pro všechna srovnání). Tyto výsledky ukázaly, že kolonizace myší BAFF-Tg Nme vedla ke zvýšené expresi IgA v samotné ledvině.

Po nedávném zjištění, že slizniční buňky vylučující IgA migrují do mozkové tkáně u myší s experimentální encefalitidou (2), předpokládali jsme, že intrarenální exprese IgA mRNA může odrážet přítomnost antikomenzálních buněk produkujících IgA, které migrovaly z místa počáteční expozice patobiontu. Navrhli jsme proto vlastní test ELISPOT pro detekci buněk sekretujících protilátky specifické pro Nme. Destičky ELISPOT s vysokou afinitou byly potaženy teplem usmrceným Nme a inkubovány s jednobuněčnou suspenzí imunitních buněk derivovaných z ledvin z našich experimentálních myší; Následně byly přidány detekční protilátky IgA konjugované s HRP. Zjistili jsme, že buňky vylučující IgA specifické pro Nme byly identifikovány v parenchymu ledvin myší infikovaných Nme, převážně v podmínkách zvýšených hladin BAFF (myši B × hC-Tg, obrázek 5).

Figure 1. Tonsil microbiota. (A) The most abundant genus (>Neisseria byla ve výtěrech z mandlí u pacientů s IgAN dvojnásobkem relativní četnosti dalšího nejhojnějšího rodu. Každá barva představuje jednotlivý rod a osa y označuje podíl vzorků s tímto rodem jako nejhojnějším organismem (χ2, P=0.18). (B) Relativní četnost rodu Neisseria byla významně vyšší u IgAN ve srovnání s nepříbuznými zdravými kontrolními jedinci v domácnosti (2-neupravený t-test P=0.002).