Inhibice GSK3 fosforylací na Ser389 kontroluje neurozánět
Oct 24, 2023
Abstraktní: Inhibice glykogen syntázy kinázy 3 (GSK3) fosforylací Ser9 ovlivňuje mnoho fyziologických procesů, včetně imunitní odpovědi. Důsledky inhibice GSK3 alternativní fosforylací Ser389 však zůstávají špatně charakterizovány. Zde jsme zkoumali neurozánět u myší GSK3 Ser389 knock-in (KI), u kterých je narušena fosforylace Ser389 GSK3. Počet aktivovaných mikroglií/infiltrovaných makrofágů, astrocytů a infiltrovaných neutrofilů byl u těchto zvířat významně vyšší ve srovnání s protějšky C57BL/6J divokého typu (WT), což naznačuje, že selhání inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 vede k trvalému nízkému neurozánět. Navíc aktivace gliových buněk a mozková infiltrace imunitních buněk v reakci na lipopolysacharid (LPS) selhala u myší GSK3 Ser389 KI. Tyto účinky byly specifické pro mozek, protože periferní imunita nebyla podobně ovlivněna. Kromě toho fosforylace IkB kinázového komplexu (IKK) v reakci na LPS u myší GSK3 Ser389 KI selhala, zatímco fosforylace STAT3 byla plně zachována, což naznačuje, že signální dráha NF-KB je specificky ovlivněna touto regulační dráhou GSK3. Celkově naše zjištění naznačují, že inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 řídí zánětlivou reakci mozku, což zvyšuje potřebu vyhodnotit její roli v progresi neurozánětlivých patologií.
cistanche tubulosa – působí protizánětlivě
Klíčová slova: neuroinflammation; mikroglie; astrocyty; neutrofily; NF-kB signalizace; průtoková cytometrie
Co dělá bylina cistanche — Anti- zánětlivé
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche
【Požádat o víc】E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Úvod
Glykogen syntáza kináza 3 (GSK3) je serin-threonin kináza se širokou specifitou. GSK3 reguluje tak rozmanité procesy, jako je zánět, buněčný růst, buněčná diferenciace a energetický metabolismus, a podílí se na onemocněních souvisejících s věkem, jako je diabetes, Alzheimerova choroba a rakovina [1]. Obě izoformy GSK3, GSK3 a GSK3, jsou všudypřítomné, ale jejich funkce se plně nepřekrývají [2]. GSK3 je konstitutivně aktivní, i když jeho aktivita může být inhibována sekvestrací do cytosolových komplexů a také fosforylací na zbytcích Ser9 a Ser389 [3]. Akt-indukovaná fosforylace GSK3 na Ser9 je regulační dráha GSK3 přítomná ve většině buněčných typů a je to výchozí dráha pro omezení aktivace GSK3 a prevenci buněčné smrti. Na rozdíl od toho jsme zjistili, že fosforylace Ser389 indukovaná p38 MAPK je omezena na specifické tkáně, jako je mozek, brzlík a slezina [4] a že mozková exprese fosfo-Ser389 GSK3 je vývojově regulována [5]. Fosforylace GSK3 pomocí Ser389 je spouštěna primárně reakcí dvouřetězcových zlomů DNA a je zásadní umožnit opravu DNA [6,7]. Zatímco tedy fosforylace na Ser9 je hlavní cestou pro inaktivaci cytoplazmatického GSK3, fosforylace Ser389 se používá k inaktivaci jaderného poolu GSK3 ke zvýšení přežití během opravy DNA DSB [8]. Selhání inaktivace GSK3 prostřednictvím fosforylace Ser389 v reakci na DSB vede ke zvýšené buněčné smrti nekroptózou [6,7]. To je vysoce relevantní, protože nekroptotický typ smrti je více zánětlivý a byl nalezen u zánětlivých onemocnění [9]. Avšak na rozdíl od fosforylace Ser9 zůstávají důsledky fosforylace GSK3 na Ser389 špatně charakterizovány. Řada studií podporuje souvislost mezi GSK3 a zánětem. Aktivace GSK3 zánětlivými stimuly, jako je stres, infekce nebo trauma, tedy podporuje produkci prozánětlivých cytokinů, jako je IL-6, IL-1 a IFN, zatímco inhibice GSK3 potlačuje syntézu prozánětlivých mediátorů a zvyšuje produkci IL-10 imunitními buňkami [10]. GSK3 může být aktivován lipopolysacharidem (LPS), jedním z hlavních imunostimulačních endotoxinů gramnegativních bakterií [11,12]. Po navázání bakteriálního LPS na Toll-like receptory (TLR) zprostředkovává GSK3 uvolňování zánětlivých cytokinů v buňkách vrozeného imunitního systému [13]. Navíc bylo publikováno, že podávání inhibitorů GSK3 myším léčeným letální dávkou LPS významně zvyšuje přežití zvířat [14]. Navzdory těmto prozánětlivým účinkům spojeným s GSK3 byly také dokumentovány protizánětlivé účinky [15,16]. Regulace GSK3 je tedy rozhodující pro udržení rovnováhy mezi prozánětlivými a protizánětlivými cytokiny po aktivaci TLR [17]. Nukleární faktor kB (NF-kB) zprostředkovává produkci prozánětlivých cytokinů a je jedním z hlavních transkripčních faktorů aktivovaných TLR. Několik autorů potvrdilo, že GSK3 je schopen aktivovat signalizaci NF-kB prostřednictvím fosforylace IkB kinázového komplexu (IKK), který fosforyluje IkB a uvolňuje aktivní NF-kB. Dalším transkripčním faktorem fosforylovaným GSK3 je signální převodník a aktivátor transkripce-3 (STAT3), který zprostředkovává neurozánět v kontextu septického šoku [18]. Fosforylace STAT3 pomocí GSK3 vede k jaderné translokaci a aktivaci. GSK3 navíc inhibuje protizánětlivé transkripční aktivity CREB a AP-1, čímž zesiluje expresi prozánětlivých cytokinů [10,19]. Mikrogliové buňky jsou rezidentními makrofágy v CNS. Spolu s infiltrovanými leukocyty hraje aktivace mikroglií klíčovou roli v neurozánětu. Astrocyty jsou také gliové buňky s neuroimunitními funkcemi, protože přeslechy s mikrogliemi, leukocyty a endoteliálními buňkami, čímž modulují jak vrozené, tak adaptivní imunitní reakce [20]. Aktivace mikroglií a astrocytů v reakci na zánětlivé podněty (glióza) je charakterizována velkými buněčnými změnami, které zahrnují proliferaci, hypertrofii a uvolňování cytokinů [21]. GSK3 se podílel na rozvoji gliózy v reakci na LPS nebo nadměrnou expresí neurálního GSK3 [22]. Existují také důkazy, že gliální reaktivita a neurozánět indukovaný GSK3 mohou být zprostředkovány aktivací NF-kB dráhy v mozku [19,23]. Naproti tomu inaktivace GSK3 snižuje gliální reaktivitu, omezuje neurozánětlivou odpověď a zvyšuje protizánětlivou aktivitu CREB v nervových buňkách [24]. V důsledku toho se předpokládá, že GSK3 hraje zásadní roli v progresi neurozánětlivých poruch, jako je Alzheimerova choroba a roztroušená skleróza [25]. Fosforylace je regulační mechanismus aktivity GSK3 s hlavními důsledky pro kontrolu imunitní odpovědi. Inhibice GSK3 klasickou fosforylací Ser9 tedy upreguluje produkci protizánětlivých mediátorů a downreguluje uvolňování prozánětlivých cytokinů [26], ačkoli se také podílí na řešení zánětu v modelu experimentální kolitidy indukované kyselinou trinitrobenzensulfonovou [27]. Defektní inhibice GSK3 fosforylací Ser9 v mozku souvisí se zánětlivými neuropatologiemi, jako je Parkinsonova choroba [28] a schizofrenie [29]. Na rozdíl od toho, navzdory vysokým hladinám fosfo-Ser389 GSK3 nalezeným v mozku [4], zůstává neznámé, zda tato cesta inaktivace GSK3 hraje roli při ladění neurozánětu. Zde zkoumáme možnou roli inaktivace GSK3 zprostředkované fosforylací Ser389 při neurozánětu pomocí myší GSK3 KI, u kterých byl GSK3 Ser389 nahrazen Ala, aby se zabránilo C-terminální fosforylaci GSK3 [7,8]. Naše výsledky ukazují, že selhání inaktivního GSK3 fosforylací na Ser389 za fyziologických podmínek vede k chronickému neurozánětu nízkého stupně, stejně jako nedostatečné odpovědi na zánětlivé stimuly, jako je LPS. Tento chronický zánět se zdá být specifický pro mozek, protože periferní imunitní systém je z velké části neovlivněn. Také jsme ukázali, že nepřítomnost fosfo-Ser389 GSK3 v mozku myší GSK3 KI reguluje signalizaci NF-kB, což je centrální událost při kontrole neurozánětu. Naše zjištění proto poskytují podporu pro zapojení inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 v zánětlivých neuropatologiích.
2. Výsledky
2.1. Selhání inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 vede ke zvýšenému bazálnímu neurozánětu
Inaktivace GSK3 fosforylací na Ser9 byla spojena s protizánětlivým stadiem v mozku [30]. I když je inaktivace GSK3 fosforylací na Ser389 důležitá pro snížení neuronální smrti způsobené dvouřetězcovými zlomy DNA v mozku, žádné studie nezkoumaly, zda by tato dráha mohla také regulovat neurozánětlivou odpověď. Proto jsme použili dříve popsané myši GSK3 Ser389 KI, ve kterých je Ser389 nahrazen Ala, aby se zabránilo fosforylaci Ser389. Zkoumali jsme rezidentní a infiltrované imunitní buňky v celém mozku (kromě mozečku a čichových bulbů) z myší WT a GSK3 Ser389 KI mechanickou disociací tkáně a gradientu Percoll, podle dříve optimalizovaného protokolu, abychom získali vyváženou směs rezidentních a infiltrovaných buněk v mozku, včetně mikroglií/makrofágů, astrocytů, infiltrovaných neutrofilů a lymfocytů [31]. Buňky byly poté analyzovány průtokovou cytometrií za použití standardních markerů (obrázek S1 v doplňkových materiálech) [31–33]. Aktivované a klidové mikroglie/makrofágy byly identifikovány jako CD11b+CD45high a CD11b+CD45low, zatímco lymfocytární populace byla označena jako CD45+CD11b− [32,34]. Neutrofily byly charakterizovány jako CD45+Ly6G+ buňky; a astrocyty byly definovány v populaci CD45− expresí buněčného povrchového antigenu-2 (ACSA-2). Tento marker se používá pro detekci vyvíjejících se a dospělých astrocytů [35]. Upregulace ACSA-2 byla pozorována u reaktivních astrocytů spojených se zánětlivými stavy, jako je autoimunitní demyelinizace [36]. Již dříve jsme zjistili, že počet astrocytů ACSA-2+ v myších mozcích se po léčbě LPS zvyšuje, což dále naznačuje, že hladina exprese ACSA-2 koreluje s aktivací astrocytů v reakci na zánětlivé podněty [31]. Ačkoli ACSA-2 může být také exprimován v malé subpopulaci mikroglií a makrofágů [35], tyto buňky jsou v populaci CD45+. Analýza průtokovou cytometrií izolátů mozkových buněk z myší za fyziologických podmínek odhalila výrazné zvýšení frakce aktivovaných mikroglií/makrofágů u GSK3 Ser389 KI myší ve srovnání s WT myšmi (obrázek la). Naproti tomu procento klidových mikroglií se snížilo v mozcích myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 1b). Kromě toho došlo k výraznému zvýšení přítomnosti astrocytů ACSA-2+ (tj. aktivovaných astrocytů) u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 1c). Pokud jde o infiltraci imunitních buněk v mozku, došlo k jasné akumulaci neutrofilů v mozku myší GSK3 Ser389 KI ve srovnání s myšmi WT (obrázek 1d), což dále prokazuje přítomnost probíhající zánětlivé reakce v mozku myší GSK3 Ser389 KI za fyziologických podmínek. podmínky. Frekvence CD45+CD11b− leukocytů (převážně lymfocytárních buněk) v mozku však nebyla u myší GSK3 Ser389 KI ovlivněna (obrázek 1e). Tyto výsledky společně ukazují, že selhání inhibice GSK3 fosforylací na Ser389 vede k chronické vrozené zánětlivé reakci v mozku, která způsobuje reaktivitu mezi mikrogliemi a astrocyty.
Obrázek 1. Inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 ovlivňuje populace mozkových buněk, které se podílejí na neurozánětu. Mozky myší WT i GSK3 Ser389 KI byly odebrány a zpracovány pro analýzu průtokovou cytometrií (a) CD11b++CD45high aktivovaných mikroglií/makrofágů, (b) CD11b++CD45low klidových mikroglií, (c) ACSA -2+ astrocyty, (d) Ly6G+ neutrofily a (e) CD11b− lymfocyty. Histogramy představují počet buněk vyjádřený jako procento buněk CD45− (astrocyty) nebo CD{16}} buněk (všechny ostatní populace). Data jsou uvedena jako průměr ± SEM (n=7–9). Ke srovnání genotypů byl použit Studentův t-test. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, divoký typ; KI a knockin GSK3 Ser389.
2.2. Nedostatek účinku fosforylace GSK3 na Ser389 na buňky sleziny
Abychom prozkoumali, zda je změněný zánětlivý stav detekovaný u myší GSK3 Ser389 KI omezen na mozek nebo zda je účinek také systémový, provedli jsme analýzu průtokovou cytometrií pro různé buněčné populace ve slezině. Neutrofily byly identifikovány jako Ly6G+ buňky. Exprese Ly6G byla vysoce variabilní, protože závisí na fázi zrání buněk, jak bylo ukázáno dříve [37]. Kromě toho byly monocytární myeloidní buňky označeny jako Ly6G–CD38+CD11b+ buňky. Tyto monocyty/makrofágy představovaly dvě jasně odlišné populace na základě úrovní exprese CD38, jak již bylo dříve publikováno [38]. Byly také hodnoceny buňky CD8+, CD{13}} buňky a B{14}} buňky (B buňky) (obrázek S2 v doplňkových materiálech).
Obrázek 2. Analýza průtokovou cytometrií ukazuje podobné populace slezinných buněk u myší WT a GSK3 Ser389 KI. Po disociaci slezinných buněk byla použita průtoková cytometrie k posouzení počtu (a) Ly6G+ neutrofilů, (b) CD38+CD11b+ monocytů/makrofágů, (c) CD4+ buněk, (d) CD8+ buňky a (e) B220+ buňky. Histogramy ukazují počty buněk vyjádřené jako procento z celkového počtu buněk. Data odpovídají průměru ± SEM (n=5–7). Ke srovnání genotypů byl použit Studentův t-test. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389.
2.3. LPS není schopen zvýšit neurozánět u myší GSK3 Ser389 KI
Dále jsme zkoumali, zda zrušení fosforylace Ser389, kromě způsobení bazálního tonického zánětu, může také ovlivnit zánětlivou reakci spouštěnou LPS. Myším WT a GSK3 Ser389 KI byla intraperitoneálně injikována subletální dávka (0,5 mg/kg) bakteriálního lipopolysacharidu (LPS). Zánětlivá odpověď mozku byla zkoumána o tři dny později, protože bylo již dříve prokázáno, že taková léčba vyvolává zánět nízkého stupně v mozcích myší [39,40]. Tato odpověď LPS také připomíná chronický zánětlivý stav pozorovaný u několika neurologických onemocnění, včetně deprese, úzkosti a Parkinsonovy choroby [41,42]. Jak se očekávalo, LPS indukoval gliovou reaktivitu u WT myší, jak bylo určeno zvýšením frekvence aktivovaných mikroglií/makrofágů (obrázek 3a) a sníženou frekvencí klidových mikroglií (obrázek 3b). Na rozdíl od toho LPS nedokázal spustit žádnou další zánětlivou reakci u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 3a, b). Tabulka 1 přímo porovnává velikost LPS odpovědí mezi dvěma genotypy. Kromě toho tato léčba LPS zvýšila procento ACSA-2+ astrocytů u myší WT, jak bylo dříve uvedeno [31], ale nikoli u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 3c). Pokud jde o mozkovou infiltraci imunitních buněk, LPS způsobil akumulaci neutrofilů u myší WT, ale neměl žádný účinek u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 3d). Konečně podávání LPS nepodporovalo akumulaci lymfocytů v mozku ani u WT, ani u GSK3 Ser389 KI myší (obrázek 3e). Celkově tato pozorování naznačují, že inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 je nezbytná pro prevenci tonického zánětlivého stavu v mozku, ale přispívá k akutnímu zánětu mozku v reakci na podněty, jako je LPS.
Tabulka 1. Rozdíly v účincích LPS mezi WT a GSK3 Ser389 KI myšmi. Hodnoty představují počet buněk po ošetření LPS v každém genotypu a jsou vyjádřeny jako zvýšení s ohledem na kontroly ošetřené vehikulem (průměr ± SEM). Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly mezi účinky LPS u zvířat WT a GSK3 Ser389 KI. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389; LPS, lipopolysacharid. *, p < 0.{10}}5; **, p < 0,01.
Obrázek 3. Neuroimunitní buňky z myší GSK3 Ser389 KI nereagují na LPS. Dospělým myším WT a GSK3 Ser389 KI byl intraperitoneálně injikován LPS (0,5 mg/kg). O tři dny později mozkové populace (a) CD11b++CD45high aktivovaných mikroglií/makrofágů, (b) CD11b+CD45low klidových mikroglií, (c) ACSA-2+ astrocytů, (d) Ly6G+ neutrofilů a ( e) CD11b− lymfocyty byly hodnoceny průtokovou cytometrií. Histogramy ukazují účinky LPS na počet buněk v obou genotypech. Údaje jsou uvedeny jako procenta buněk CD45− (astrocyty) nebo CD45+ buněk (všechny ostatní populace) a hodnoty odpovídají průměru ± SEM (n=7–9). Studentův t-test byl použit k vyhodnocení významnosti změn indukovaných LPS v každém genotypu. ** p < 0.01. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389; LPS, lipopolysacharid.
Dále jsme zkoumali možný vliv hipokampální fosforylace GSK3 Ser389 na bazální gliální aktivaci a gliovou odpověď na zánětlivé podněty. Za tímto účelem bylo značení Iba-1 hodnoceno mikroskopicky v gyrus dentatus (obrázek 4a). Nejprve byly vyhodnoceny WT myši. Mikrofotografie ukazují nízkou bazální gliovou aktivaci, ale silné zvýšení gliové imunoreaktivity v reakci na injekci LPS (0,5 mg/kg, 3 dny) (obrázek 4b). Kvantifikace integrované hustoty pro imunologické barvení Iba-1 ukázala hodnoty, které byly u WT myší po léčbě o 53 % vyšší (obrázek 4d). Tyto změny byly statisticky významné a jsou v souladu s dříve uváděnou prominentní buněčnou hypertrofií způsobenou LPS v myším hipokampu [43,44].
Obrázek 4. Glióza v reakci na LPS je změněna u myší GSK3 Ser389 KI. Dospělým myším WT a GSK3 Ser389 KI byla intraperitoneálně injikována LPS nebo vehikulum (C). Po 3 dnech byly mozky zpracovány pro fluorescenční mikroskopii. (a) Sekce koronálního hipokampu upravená z atlasu myšího mozku [45] ukazuje lokalizaci snímků, které zahrnují gyrus dentatus. (b) Řezy mozku byly imunoznačeny na mikrogliové/makrofágové markery Iba-1. Grafy znázorňují integrovanou hustotu imunoreaktivity Iba{8}}, což je měření gliové reaktivity, která odráží jak intenzitu, tak rozsah gliálního barvení. c) Srovnání kontrolních zvířat WT a KI. (d) LPS odpověď v každém myším genotypu. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny se zvýšeným ohledem na kontroly WT ošetřené vehikulem (průměr ± SEM, n=4–5). Byl použit Studentský t-test. *, p < 0.05. Měřítko, 100 µm. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389; C, vozidlo; LPS, lipopolysacharid.
Analýza hippocampu Ser389 KI myší odhalila rozdíly v bazální mikrogliální aktivaci s ohledem na WT myši. I když tedy vizuální kontrola mikrosnímků ukázala mírnou aktivaci glií u mutantních zvířat (obrázek 4b), integrovaná měření hustoty ukázala, že zvýšení gliové imunoreaktivity bylo statisticky významné (obrázek 4c). Je zajímavé, že myši Ser389 KI nevykazovaly žádné známky další aktivace po léčbě LPS (obrázek 4b) a kvantitativní analýza potvrdila, že LPS nebyl schopen zvýšit imunobarvení Iba{5}} v hippocampu (obrázek 4d), což naznačuje, že aktivace gliových buněk LPS je narušen v nepřítomnosti fosforylace GSK3 Ser389.
výhody cistanche doplňku – protizánětlivé
2.5. Periferní imunitní odpověď na LPS nebyla u myší GSK3 Ser389 KI ovlivněna
Naše předchozí experimenty odhalují hluboké důsledky inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 na reakci mozku na LPS. Dále jsme se zabývali tím, zda jsou podobné účinky přítomny v systémové imunitě. Protože je známo, že LPS způsobuje aktivaci buněk vrozené imunity sleziny [46], populace slezinných buněk z myší WT i GSK3 Ser389 KI byly hodnoceny 3 dny po injekci LPS (0,5 mg/kg). počet Ly6G+ neutrofilů (obrázek 5a) a CD38++CD11b++Ly6G− monocytů/makrofágů (obrázek 5b) významně vzrostl u WT myší v reakci na léčbu LPS. Tyto účinky LPS, očekávané u myší WT, byly také pozorovány u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 5a, b). Ani při analýze populací lymfocytů ze sleziny nebyly získány žádné rozdíly mezi genotypy, protože procenta CD4+ buněk sleziny (obrázek 5c) a CD{21}} buněk (obrázek 5d) byla snížena LPS také v oba myší řetězce (snížení počtu mutantních myší bylo statisticky významné pouze pro CD4+ buňky); a B220+ B buňky nebyly ovlivněny LPS nezávisle na genotypu (obrázek 5e). Tato pozorování jsou v kontrastu s rozdílnými účinky LPS nalezenými v mozcích obou genotypů. Takže zatímco myši GSK3 Ser389 KI jsou odolné vůči neurozánětu spouštěnému LPS, tyto myši nejsou systémově desenzibilizované k LPS. Zdá se tedy, že účinky fosforylace GSK3 Ser389 jsou pro mozek selektivní.
Obrázek 5. Podobná periferní imunitní odpověď na LPS u myší GSK3 Ser389 KI a WT. Dospělým myším WT a GSK3 Ser389 KI byl ip injikován LPS. Po 3 dnech byly slezinné buňky extrahovány a zpracovány, aby se pomocí průtokové cytometrie vyhodnotil počet (a) Ly6G+ neutrofilů, (b) CD38+CD11b+ monocytů/makrofágů, (c) CD8+, (d) CD4+ a (e) B220+ buňky. Histogramy ukazují účinky LPS na počet buněk, včetně myší WT a KI. Studentův t-test byl použit k vyhodnocení významnosti změn indukovaných LPS v každém genotypu. Je zobrazen průměr ± SEM (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389; ip, intraperitoneální; C, vozidlo; LPS, lipopolysacharid.
2.6. LPS-indukovaná aktivace NF-KB dráhy v hippocampu je u myší GSK3 Ser389 KI zrušena
NF-κB je transkripční faktor nezbytný pro LPS k vyvolání zánětu [47]. Navíc se ukázalo, že NF-κB je v mozku regulován GSK3 [2,19,23]. Zkoumali jsme tedy aktivaci NF-kB v mozku v reakci na LPS analýzou fosforylace IKK, což je časný krok v dráze aktivace NF-kB. Myším WT a GSK3 Ser389 KI byl ip podáván LPS (0,5 mg/kg) a po 4 hodinách byl odebrán hipokampus. Extrakty celých buněk byly použity k vyšetření fosfo-IKK / a celkového IKK / pomocí Western blotu. Jak se očekávalo, LPS zvýšil fosforylaci IKK v hipokampu u WT myší (obrázek 6a, b). Na rozdíl od toho LPS nedokázal vyvolat fosforylaci IKK u myší GSK3 Ser389 KI (obrázek 6a, b). Aktivace STAT3 byla také spojena se zánětem indukovaným LPS [48]. Zkoumali jsme proto fosforylaci STAT3 analýzou Western blot. Na rozdíl od aktivace NF-kB byla fosforylace STAT3 silně indukována v hipokampu myší WT i GSK3 Ser389 KI v reakci na LPS (obrázek 6a, c). Prevence inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 tedy selektivně zhoršuje signalizaci NF-KB, což je v souladu s úlohou GSK3 jako upstream regulátoru dráhy NF-KB v hippocampu. Tyto výsledky naznačují, že dráha GSK3 ovlivňuje neurozánět řízením klíčových zánětlivých mediátorů, jako je NF-KB.
Obrázek 6. Selhání inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 odlišně ovlivňuje signalizaci NF-KB a STAT3 u myší léčených LPS. Aktivace drah NF-κB a STAT3 byla zkoumána v lyzátech celých buněk z hippocampu 4 hodiny po ip injekci LPS ({{10}},5 mg/kg) nebo vehikula (C) v obou případech WT a GSK3 Ser389 KI myši. Bloty ilustrují Western blot analýzu fosforu-IKK/, celkového IKK/, fosforu-STAT3 a celkového STAT3. (a) Detekce -tubulinu byla zahrnuta jako kontrola nanášení. Přidružené grafy odpovídají (b) poměrům fosfo-IKK / /IKK / a (c) fosfo-STAT3/STAT3, získaným z denzitometrické analýzy pásů Western blot. Studentský t-test byl použit pro porovnání neléčených kontrol (C) a zvířat ošetřených LPS v každém genotypu (průměr ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Data jsou reprezentativní pro čtyři nezávislé experimenty pro pIKK/IKK a tři nezávislé experimenty pro pSTAT3/STAT3. WT, divoký typ; KI, knockin GSK3 Ser389; ip, intraperitoneální; C, vozidlo; LPS, lipopolysacharid.
3. Diskuse
V mozku je dysregulace aktivity GSK3 spojena s četnými neuropatologiemi, u nichž je běžným znakem chronický zánět [25]. Vzhledem k tomu, že velká literatura podporuje, že inhibice GSK3 fosforylací Ser9 zvyšuje protizánětlivé mediátory a snižuje prozánětlivé cytokiny [23,28,30], mechanismus běžně navrhovaný k vysvětlení defektní inaktivace GSK3 u neurozánětlivých patologií je selhání fosforylace Ser9 [3]. V mozku však byly detekovány neobvykle vysoké hladiny fosfo-Ser389 GSK3 [4], což naznačuje, že tato alternativní cesta inaktivace GSK3 může také hrát významnou roli v mozku. Zde prezentované experimenty odhalují implikaci fosforylace GSK3 Ser389 v neurozánětu, což přispívá k předchozím důkazům naznačujícím zapojení této dráhy do opravy mozkové DNA a přežití neuronů [6,7]. Jedním z klíčových zjištění v této práci je, že mozek myší GSK3 Ser389 KI vykazuje trvalou gliózu a zvýšenou infiltraci imunitních buněk, což je v souladu s představou, že zabránění inaktivaci GSK3 prostřednictvím fosforylace Ser389 vede k neurozánětu. Údaje z našich experimentů průtokové cytometrie jasně ukazují na zvýšený neurozánět u těchto zvířat, protože počet aktivovaných mikroglií/makrofágů, ACSA 2+ astrocytů a infiltrovaných neutrofilů v mozku myší Ser389 GSK3 KI byl významně vyšší. Navzdory tomu, že mikroastroglióza byla jasně pozorována průtokovou cytometrií, analýza mikrosnímků hippocampu z mozkových řezů myší Ser389 GSK3 KI odhalila, že hypertrofie mikroglií/makrofágů byla pouze mírná. Podobné výsledky byly pozorovány, když byly analyzovány jiné oblasti mozku, aby se vyhodnotil rozsah a intenzita gliózy (neukázáno). Proto jsme dospěli k závěru, že v nepřítomnosti prozánětlivých stimulů vede nedostatek fosforylace GSK3 Ser389 k určitému stupni neurozánětu, který by měl být klasifikován jako nízký. Četné studie podporují souvislost mezi hyperaktivitou GSK3 a neurodegenerací u neurologických poruch [25]. V této souvislosti by zánětlivá reakce, kterou jsme pozorovali u myší Ser389 GSK3 KI, mohla být důsledkem neurodegenerace, protože předchozí studie detekovaly neuronální smrt v kůře a hipokampu těchto zvířat [6]. To je v souladu s pozorováním, že poškození DNA inaktivuje GSK3 prostřednictvím fosforylace Ser389 jako mechanismu k prevenci buněčné smrti a podpoře opravy DSB [7,8]. V důsledku toho není mozek KI myší, ve kterých je zabráněno fosforylaci Ser389, chráněn proti smrti neuronů indukované DSB. Spojení mezi expresí fosfor-Ser389 GSK3 a přežitím buněk bylo poprvé navrženo v lymfocytech jako mechanismus zapojený do adaptivní imunitní odpovědi. Bylo tedy zjištěno, že nepřítomnost fosforylace GSK3 Ser389 u KI myší indukuje nekroptózu v B buňkách během jejich pozdního zrání, což je vysoce zánětlivý typ buněčné smrti související s několika patologiemi [9]. Je také zajímavé poznamenat, že nejen fosforylace Ser389, ale také fosforylace Ser9 může být spuštěna k inaktivaci GSK3 v reakci na poškození DNA. Myši Ser389 GSK3 KI však vykazují neurodegenerativní fenotyp [6], který není přítomen u myší Ser9 GSK3 KI [49,50], což naznačuje, že fosforylace Ser389 hraje specifické role při kontrole aktivity GSK3 a že existují scénáře, ve kterých fosforylace Ser9 nemůže kompenzovat pro ztrátu fosforylace Ser389. V souladu s tím je třeba dále prozkoumat zajímavou souvislost mezi deregulací Ser389 GSK3, neurozánětem a neurodegenerací, která je zde odhalena, aby se objasnilo, zda změněná fosforylace GSK3 na Ser389 může být klíčovým faktorem v neuropatologiích, ve kterých je výrazný chronický zánět, jako je Alzheimerova choroba. Kromě toho mírná, ale přetrvávající aktivace neuroimunitních buněk pozorovaná u myší GSK3 Ser389 KI je v souladu s hypotézou, že selhání fosforylovat Ser389 může být spojeno s imunosenescencí. Jedná se o proces související s věkem charakterizovaný poklesem imunitních funkcí spolu se zvýšením exprese prozánětlivých mediátorů; což vede k chronickému zánětu nízkého stupně [1,51]. Několik autorů poukázalo na zapojení deregulace GSK3 do zánětu souvisejícího s věkem [1,52]. Bylo také navrženo, že abnormální funkce mikroglií pozorovaná v kontextu mozkové imunosenescence může nakonec způsobit neurodegeneraci [53]. Zrychlená imunosenescence u myší Ser389 GSK3 KI by tedy mohla přispět ke ztrátě neuronů dříve uváděných u těchto zvířat [6]. LPS se široce používá k vyvolání zánětu v modelech „in vivo" i „in vitro". Existují však důkazy, že podaná dávka LPS do značné míry určuje typ indukované zánětlivé odpovědi [54–56]. Vysoké dávky LPS vyvolávají reakce podobné septickému šoku; zatímco mírné dávky LPS spouštějí přetrvávající zánět nízkého stupně, který se blíží zánětu pozorovanému u mnoha chronických onemocnění [42]. V této souvislosti je důležité zdůraznit, že dávka LPS vybraná pro naše experimenty (0,5 mg/kg, ip) je mírná a zdaleka nedosahuje LD50 uváděné pro LPS u myší (10–25 mg/kg) [57,58 ]. Ve shodě s předchozími zprávami [40,59] jsme zjistili, že taková dávka LPS není letální a je dostatečná ke zvýšení gliózy a mozkové infiltrace neutrofilů u WT zvířat, zatímco infiltrace lymfocyty není ovlivněna. Je pozoruhodné, že taková mírná (ale významná) LPS odpověď byla zrušena v mozku KI myší se zhoršenou inaktivací GSK3 fosforylací Ser389. Podle tohoto pozorování může prodloužená hyperaktivace GSK3 v mozku nakonec snížit citlivost na prozánětlivé inzulty. Je pozoruhodné, že defektní odpověď na LPS u mutantních myší je kompatibilní s mechanismem imunotolerance nebo rezistence, což je běžný proces v CNS zaměřený na snížení aktivace gliových buněk a omezení poškození mozku nadměrným zánětem [60,61]. V souladu s touto myšlenkou předchozí studie ukázala, že aktivace GSK3 u myší může vyvolat imunotoleranci a potlačit odpovědi LPS [62].
Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému
Je také zajímavé zvážit, že účinky na mozek popsané v této studii vykazují vysokou specifitu. Na rozdíl od mozku tedy většina populací slezinných buněk hodnocených u zvířat WT a Ser389 GSK3 KI vykazovala stejný profil v nestimulovaných podmínkách, stejně jako podobnou odpověď na LPS. To naznačuje, že dráha inaktivace GSK3 závislá na fosforylaci Ser389 hraje specifické role v regulaci neurozánětu. V souladu s touto hypotézou vykazují mozkové buňky vysokou expresi fosfo-Ser389 GSK3 ve srovnání s jinými tkáněmi a tato exprese je během vývoje mozku přísně regulována [5]. Konečně, podle našich zjištění, regulace GSK3 fosforylací na Ser389 je specificky zprostředkována signální dráhou NF-kB, protože aktivace STAT3 nebyla v Ser389 GSK3 KI ovlivněna. Mnoho downstreamových zánětlivých mediátorů je regulováno aktivací NF-kB, včetně cytokinů, receptorů, transkripčních faktorů a enzymů. Identifikace toho, které z těchto cílů NF-kB jsou ovlivněny fosforylací Ser389 GSK3, je nad rámec naší práce, ale bude to vzrušující cíl pro budoucí studie, jejichž cílem je objasnit mechanismy neurozánětu.
4. Materiály a metody
4.1. Zvířata
Myši C57BL/6J divokého typu (WT) byly zakoupeny od Jackson Laboratories. Myši C57BL/6 GSK3 Ser389 KI, ve kterých byl zbytek Ser389 GSK3 nahrazen Ala, aby se zabránilo fosforylaci, byly vytvořeny, jak bylo popsáno dříve [8]. Všechny myši byly umístěny ve zvířecím zařízení spojeném s Albacete Medical School v 12-cyklu světlo/tma. Jídlo a voda byly poskytovány ad libitum. K experimentům byly použity dospělé myši ve věku čtyř až šesti měsíců.
4.2. Správa LPS
K vyvolání zánětlivé reakce byla myším podána jediná intraperitoneální (ip) injekce {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (sérotyp typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Španělsko) byla rozpuštěna ve sterilním 0,9% fyziologickém roztoku bez endotoxinu v koncentraci 10 mg/ml. Tři dny po léčbě byly myši usmrceny a mozek a slezina byly odebrány pro imunohistochemickou analýzu nebo analýzu průtokovou cytometrií gliových buněk a infiltrovaných imunitních buněk. Pro analýzu Western blotting byla zvířata usmrcena 4 hodiny po ip injekci 0,5 mg/kg LPS, protože již dříve bylo popsáno, že LPS zvyšuje regulaci zánětlivých proteinů v mozcích myší a potkanů 2–4 hodiny po ip podání [63,64].
4.3. Průtoková cytometrie
Pro analýzu mozkové tkáně a buněk sleziny průtokovou cytometrií byla zvířata anestetizována ip injekcí tribromethanolu, což bylo doporučeno pro akutní terminální studie. Použitá nízká dávka tribromethanolu (200 mg/kg) poskytuje lehkou anestezii bez závažných nežádoucích účinků nebo vlivu na expresi zánětlivých cytokinů [65]. Postupy na zvířatech byly provedeny po ověření nepřítomnosti reflexů.
4.3.1. Disociace mozkové tkáně a izolace nervových buněk Percollovým gradientem
Myši byly před odběrem tkáně intrakardiálně perfundovány 50 ml 0,9% NaCl, aby se odstranily cirkulující buňky z mozkových krevních cév. Po perfuzi byly mozky vyjmuty, meningy a choroidální plexus byly pečlivě odděleny a mozeček a čichové bulby byly vyřazeny. Zbývající tkáň byla umístěna do studeného Hankova vyváženého solného roztoku, který neobsahuje chlorid vápenatý a chlorid hořečnatý (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Španělsko, 14175). Vzorky tkání byly poté před trávením jemně nasekány skalpelem. Nakrájená tkáň byla poté umístěna do zkumavek MACS C (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Španělsko, 130-093-237) v celkovém objemu 5 ml a zpracována mechanickým disociátorem při 6 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Enzymatická disociace byla provedena podle našeho vlastního protokolu [31] s použitím papainu (100 U; Worthington, LK003178) a dispázy II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španělsko, D4963) v Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgS04;Gibco, Madrid, Španělsko, 24010). K roztoku byla přidána DNAáza I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španělsko, DN25), aby se odstranil DNA hlen, který nepříznivě ovlivňuje životaschopnost buněk [66]. Před použitím byl papain aktivován po dobu 30 minut při 37 ◦C v 5% CO2. Pro zastavení štěpení byly vzorky zředěny studeným HBSS a umístěny na led. Tento roztok byl poté 10krát pipetován pomocí 5ml pipet a přefiltrován přes 70 um buněčné síto (BD, 352350). Výsledná jednobuněčná suspenze byla centrifugována při 300 x g po dobu 10 minut při teplotě místnosti. K odstranění myelinu a obohacení homogenátu na životaschopné gliové buňky byl použit gradient 30 % PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Španělsko, 17-0891-01). Pro tento účel byl připraven zásobní roztok isotonického Percoll (SIP) (9:1 Percoll v 10x HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185) a buněčné pelety byly resuspendovány ve 30 % (v/ v) SIP (v 1× HBSS). Gradient 30 % Percoll byl proveden přidáním 3 ml SIP do 7 ml 1 x HBSS obsahujícího buněčnou suspenzi ve 14 ml polypropylenové zkumavce. Každý gradient byl centrifugován bez brzdění při 300 x g po dobu 30 minut při 18 °C. Po centrifugaci byly buňky ze spodní vrstvy shromážděny, promyty 1× HBSS, centrifugovány 10 min při 300× g a resuspendovány v 10 ml 1× pufru pro lýzu červených krvinek při 4 °C. Po lýze byla buněčná suspenze centrifugována při 300 x g po dobu 10 minut a výsledná buněčná peleta byla nakonec resuspendována v 50 ul blokovacího pufru před barvením pro průtokovou cytometrii.
4.3.2. Disociace slezinných buněk
Sleziny byly umístěny na Petriho misku obsahující RPMI 1640 a nakrájeny na malé kousky. Výsledná tkáň byla převedena do 70 um buněčného síta (BD, 352350) a rozbita kruhovým pohybem žebrovaným vrcholem pístu injekční stříkačky. RPMI 1640 pak prošel sítem. Dezintegrovaná tkáň byla přenesena do 50ml zkumavek (Sarstedt, Barcelona, Španělsko, 62.547.254) a centrifugována při 100 g po dobu 10 minut. Supernatant obsahující buněčnou suspenzi byl poté shromážděn a znovu centrifugován při 300 g po dobu 10 minut. Výsledný supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována v 10 ml fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) s 1% FBS, aby se spočítal počet buněk pod mikroskopem, a poté byla znovu centrifugována při 300 g po dobu 5 minut. Bylo použito pouze 500000 buněk na vzorek. Každý vzorek byl poté resuspendován v 50 ul blokovacího pufru před barvením pro průtokovou cytometrii.
4.3.3. Barvení extracelulární průtokovou cytometrií
Tabulka 2. Protilátky a činidla použitá pro analýzu průtokovou cytometrií.
4.4. Imunohistochemie
Myši byly hluboce anestetizovány a intrakardiálně perfundovány fyziologickým roztokem {{0}},9 % (w/v). Jejich mozky byly odebrány a následně fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 24 hodin. Po postfixaci byly kryoprotekovány 30% sacharózou a zmraženy při -20 ◦C až do nařezání. Tkáňové řezy (20 µm) byly nařezány pomocí kryostatu (ThermoFisher, Microm™ HM550), rozmrazené namontované na sklíčka Superfrost Plus (ThermoFisher, J1800AMNZ) a nakonec uloženy při -20 °C až do barvení. Imunohistochemické barvení tkáňových řezů bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [67]. Primární a sekundární roztoky protilátek byly zředěny v 1x PBS s 1% BSA. Řezy byly inkubovány s primární protilátkou anti-králičí Iba-1 (ředění 1:500; Wako Chemicals, Barcelona, Španělsko, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugovaný kozí anti-králičí IgG (ředění 1:2000; ThermoFisher, Madrid, Španělsko, A11031) byl použit jako sekundární protilátka. Byla zahrnuta vhodná tkáň pozitivní kontroly, stejně jako primární a sekundární negativní kontroly. Snímky fluorescenčního značení byly získány pomocí ZEISS Apotome. 2 mikroskop s mono digitální kamerou axiom 503 a ovládacím softwarem Zen Blue verze 2.3 (Carl Zeiss). K vizualizaci hipokampu byl použit 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR). Integrovaná hustota v oblastech zájmu byla vypočtena pomocí softwaru ImageJ. Tento parametr odpovídá součtu hodnot intenzity pro každý pixel ve vybrané oblasti. Proto se používá pro kvantifikaci počtu obarvených buněk v kombinaci s intenzitou barvení každé buňky.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
4.5. Analýza Western Blot
Myší mozky byly rychle odstraněny a hipokampy byly okamžitě vypreparovány a zmraženy. Tkáň byla připravena za použití hypertonického lyzačního pufru obsahujícího inhibitory proteázy, jak bylo popsáno dříve [68]. Primární použité protilátky byly anti-králičí fosfor-IKK / (ředění 1:1000; Cell Signaling, Alcobendas, Španělsko, 2861), anti-králičí IKK / (ředění 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Německo, sc{{ 9}}), antikráličí fosfor-STAT3 (1:1000 ředění; Cell Signaling, 9145) a anti-myší STAT3 (1:1000 ředění; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-myší tubulin (ředění 1:2000; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) byl použit jako kontrola nanášení. Jako sekundární protilátky byly použity anti-králičí HRP (1:5000 ředění; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA, 111-035-144) a anti-myší HRP (1:5000 ředění; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003). . Kvantifikace pásů proteinů byla provedena pásovou denzitometrickou analýzou pomocí softwaru NIH ImageJ (verze 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, přístupná 1. března 2022). Aby se zajistilo stejné zatížení, integrovaná hustota získaná pro každý pás byla vyjádřena jako relativní hodnota s ohledem na příslušnou kontrolu provozního zatížení.
4.6. Statistická analýza
Výsledky byly statisticky analyzovány pomocí softwaru GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM) obecně čtyř nezávislých experimentů (n {{0}}–9). Po potvrzení normální distribuce dat Shapiro-Wilkovým testem byla statistická významnost mezi oběma skupinami stanovena Studentovým t-testem pro parametrická data. Rozdíly byly považovány za statisticky významné, když hodnoty pravděpodobnosti (p) byly menší než 0.05 (*), 0,01 (**) nebo 0,001 (***). Obrázky ukazují reprezentativní experimenty.
5. Závěry
V souhrnu naše zjištění naznačují, že selhání inaktivace GSK3 fosforylací Ser389 vede k chronickému zánětu a toleranci endotoxinu a že inhibice GSK3 fosforylací Ser9 a Ser389 hraje v neuroimunitní odpovědi doplňkové a nikoli nadbytečné role. Proto by měly být prozkoumány specifické důsledky fosforylace GSK3 Ser389 pro neuropatologii a stárnutí mozku.
Reference
1. Souder, DC; Anderson, RM Rozšiřující se síť GSK3: Důsledky pro výzkum stárnutí. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Požadavek na glykogensyntázovou kinázu-3 při přežití buněk a aktivaci NF-κB. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Půvab a ponurost glykogensyntázy kinázy-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Dřevo, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; a kol. Fosforylace p38 MAPK jako alternativní cesta pro inaktivaci GSK3beta. Science 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regulace GSK3 fosforylací Ser 389 během neurálního vývoje. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Zajíc, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 by Ser 389-Phosphorylation vede k fokální neuronové smrti a prodloužené reakci na strach. Neuropsychofarmakologie 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Zajíc, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; král, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Dva týdny proměnlivého stresu zvyšují hladiny gama-H2AX v jádru myšího lůžka stria terminalis. Neurovědy 2018, 373, 137–144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; a kol. Inaktivace jaderného GSK3beta fosforylací Ser (389) podporuje způsobilost lymfocytů během reakce dvouřetězcového zlomu DNA. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Nekroptóza a její role při zánětu. Příroda 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stresovaný a zanícený, může být GSK3 obviňován? Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Vrozené imunitní snímání a jeho kořeny: Příběh endotoxinu. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dynamická modulace vrozené imunitní odpovědi měnícími se dávkami lipopolysacharidu (LPS) v lidských monocytárních buňkách. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Jo, WC; Ohashi, PS LPS/TLR4 signální transdukční dráha. Cytokin 2008, 42, 145–151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, inhibiční peptid SY GSK3 chrání myši před endotoxinovým šokem vyvolaným LPS. Immune Netw. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Revisiting the Role of GSK3, A Modulator of Innate Imunity, in Idiopathic Inclusion Body Myositis. Buňky 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Nová protizánětlivá úloha glykogensyntázy kinázy-3beta při inhibici exprese zánětlivého genu vyvolaného faktorem nekrotizujícím nádory-alfa- a interleukin{5}}beta. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: A Kinase Balancing Promotion and Resolution of Inflammation. Buňky 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, RS Produkce interleukinu-6 indukovaná lipopolysacharidy je řízena glykogensyntázou kinázou-3 a STAT3 v mozku. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Inaktivace kinázy glykogen syntázy-3 inhibuje produkci faktoru nekrózy nádorů v mikrogliích modulací nukleárního faktoru κB a signálních kaskád MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, N.; Valiente, M. Potenciál astrocytů jako imunitních modulátorů u nádorů mozku. Přední. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matějuk, S.; Matejuk, A. Zapojení mikroglií a astrocytů do neurodegenerace a rakoviny mozku. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Snížený jaderný beta-katenin, tau hyperfosforická lace a neurodegenerace u GSK-3beta podmíněných transgenních myší. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; a kol. Inhibice Gsk3b snižuje signalizaci Nfkb1 a zachraňuje synaptickou aktivitu pro zlepšení fenotypu Rettova syndromu u Mecp2-knockout myší. Buňka. Rep. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Řehání, K.; Jope, RS; Michalek, SM Produkce cytokinů zprostředkovaná Toll-like receptory je rozdílně regulována glykogensyntázou kinázou. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mechanismy a terapeutické důsledky GSK-3 při léčbě neurodegenerace. Buňky 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kináza Aktl řídí odpověď makrofágů na lipopolysacharid regulací mikroRNA. Imunita 2009, 31, 220–231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL-13 řídí řešení chronického střevního zánětu prostřednictvím fosforylace glykogensyntázy kinázy-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glykogensyntáza kináza-3beta je spojována s Parkinsonovou chorobou. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovský, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. Parametry GSK-3 v lymfocytech schizofrenních pacientů. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glykogensyntáza kináza-3 (GSK3): Zánět, nemoci a terapeutika. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernández, M.; Tranque, P. Disociace mozku neonatálních a dospělých myší pro současnou analýzu mikroglií, astrocytů a infiltrujících lymfocytů průtokovou cytometrií. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. Optimalizovaná metoda pro zpracování myšího CNS k současné analýze nervových buněk a leukocytů průtokovou cytometrií. J. Neurosci. Metody 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG Metoda založená na imunoafinitě pro izolaci ultračistých dospělých astrocytů založená na cílení ATP1B2 protilátkou ACSA-2. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Použití průtokové cytometrie k hodnocení časových změn v zánětlivých buňkách po fokální mozkové ischemii u myší. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovič, J.; a kol. Anti-ACSA-2 definuje novou monoklonální protilátku pro prospektivní izolaci živých neonatálních a dospělých astrocytů. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Analýza genové exprese endokanabinoidní signalizace astrocytů a mikroglií během autoimunitní demyelinizace. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh zralé a Ly6Gint nezralé neutrofily přispívají k eradikaci S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Chew, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; a kol. Imunohistochemické skórování CD38 v mikroprostředí nádoru předpovídá odpověď na imunoterapii anti-PD-1/PD-L1 u hepatocelulárního karcinomu. J. Immunother. Rak 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B potlačuje lipopolysacharidem (LPS) indukovaný zánět v mozku myši. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; a kol. Role neurozánětu v patologii mozkových amyloidů vyvolaných hypertenzí. Neurobiol. Stárnutí 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktivuje neurozánětlivé dráhy k vyvolání deprese u stavu podobného Parkinsonově chorobě. Přední. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Nervové a behaviorální reakce na zánět nízkého stupně. Chovej se. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysacharid indukuje aktivaci neuroglie a aktivaci NF-κB v mozkové kůře dospělých myší. Laboratoř. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Lithium zlepšuje neurotoxicitu vyvolanou lipopolysacharidy v kůře a hippocampu mozku dospělých potkanů. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2001. Dostupné online: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (přístup 1. března 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Slezina v lokální a systémové regulaci imunity. Imunita 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-κB signalizace při zánětu. Převod signálu. Cílová. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balic, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. Fosforylace serinu STAT3 je nutná pro metabolické přeprogramování TLR4 a expresi IL-1. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Wnt pool kinázy 3beta glykogensyntázy je kritický pro neuronální smrt vyvolanou trofickou deprivací. Mol. Buňka. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, T.; Jope, RS Blokovaná inhibiční serin-fosforylace kinázy glykogensyntázy-3/ narušuje in vivo proliferaci nervových prekurzorových buněk. Biol. Psychiatrie 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Chronický zánět (zánět) a jeho potenciální příspěvek k onemocněním souvisejícím s věkem. J. Gerontol. Ser. A Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Úloha nezralých myeloidních buněk v imunitní senescenci. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Diferenciální role mikroglií M1 a M2 u neurodegenerativních onemocnění. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Systémový zánět a aktivace mikroglií: Systematický přehled pokusů na zvířatech. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Heterogenita závislá na oblasti mozku a na dávce závislý rozdíl v přechodném zvýšení populace mikroglií během zánětu vyvolaného lipopolysacharidy. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]
56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Mikrogliální a astrocytární aktivace specifická pro oblast mozku v reakci na systémovou expozici lipopolysacharidům. Přední. Stárnutí Neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulovič, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injekce lipopolysacharidu myším k napodobení vstupu produktů odvozených od mikrobů po porušení střevní bariéry. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Zvířecí modely sepse. Virulence 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Role endoteliálního TLR4 pro nábor neutrofilů do mikrocév centrálního nervového systému při systémovém zánětu. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 reguluje LPS-toleranci v astrocytech. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Ochranné účinky tolerance endotoxinu na periferní lipopolysacharidy indukovaný neurozánět a dopaminergní neuronální poškození. Immunopharmacol. Imunotoxikol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Tumor nekrotizující faktor indukuje GSK3 kinázou zprostředkovanou zkříženou toleranci k endotoxinu v makrofázích. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Katalyticky neaktivní protein související s fosfolipázou C reguluje anorexii zprostředkovanou hypotalamickým zánětem vyvolaným lipopolysacharidem u myší. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimuluje signální dráhu SIRT 1/Nrf2, která působí proti oxidativnímu stresu indukovanému lipopolysacharidem (LPS) k záchraně postnatálního mozku potkana. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetika prozánětlivých cytokinů po intraperitoneální injekci tribromethanolu a kombinace tribromethanol/xylazin u myší ICR. Laboratoř. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Moller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Izolace a průtoková cytometrická analýza imunitních buněk z mozku ischemické myši. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Odpověď transkripčního faktoru NFATc3 na excitotoxické a traumatické mozkové inzulty: Identifikace subpopulace reaktivních astrocytů. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Exprese selenoproteinu S v reaktivních astrocytech po poranění mozku. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
