GRP78 spouští nadměrnou expresi RŮŽOVÁ1-Neuroprotektivní mitofágie zprostředkovaná IP3R, část 2

2.5. Western Blot

Potkany jsme hluboce anestetizovali pomocí Dolethala (n=4) při 7 dpi, abychom získali segmenty míchy L4–L5 (délka 5- mm) pro analýzu western blot. Vzorky jsme rychle zmrazili v kapalném dusíku.

V posledních letech stále více výsledků výzkumů ukazuje, že mezi proteinovým blottingem a pamětí existuje úzký vztah. Protein blotting je analytická technika pro detekci exprese proteinů, která je široce používána v neurovědním výzkumu.

Spojení mezi neurony úzce souvisí s ukládáním paměti. Protein blotting může detekovat stav spojení mezi neurony a expresi pre- a postsynaptických proteinů, což dále odhaluje důležitou roli proteinů při tvorbě a ukládání paměti.

Studie zjistily, že exprese presynaptických neuronových proteinů úzce souvisí s tvorbou a ukládáním paměti. Například během procesu učení a paměti mění neurony expresi presynaptických proteinů a tato změna souvisí s tvorbou a ukládáním nových vzpomínek. Některé studie navíc také zjistily, že změny v expresi některých proteinů souvisejí s neurodegenerativními onemocněními, jako je Alzheimerova choroba.

Proto může protein blotting poskytnout hloubkové pochopení stavu spojení mezi neurony a změn v expresi příbuzných proteinů a odhalit molekulární mechanismus neuronů. To má velký význam pro studium mechanismu tvorby paměti a neurodegenerativních onemocnění.

Stručně řečeno, vztah mezi přenosem proteinů a pamětí ukazuje roli proteinů ve spojení mezi neurony a ukládáním paměti. To poskytuje nové nápady a směry pro studium mechanismu tvorby paměti a neurodegenerativních onemocnění. Aktivně propagujme neurovědní výzkum a přispějme ke zdraví a dlouhověkosti! Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche dokáže výrazně zlepšit paměť, protože má antioxidační, protizánětlivé a anti-aging účinky, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví nervové systém. Kromě toho může Cistanche také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, schopnost učení a rychlost myšlení a mohou také zabránit výskytu kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit funkci mozku

Vzorky byly skladovány nebo dále zpracovány homogenizací v lyzačním pufru (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM sacharóza, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA a koktejl proteáz (Sigma-Aldrich) a inhibitorů fosfatázy (Roche, Basilej, Švýcarsko) ) s Potterovým homogenizátorem na ledu.

Po centrifugaci lyzátů při 800 x g po dobu 20 minut při 4 °C jsme shromáždili supernatant jako postnukleární frakci a kvantifikovali proteiny pomocí BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Pro western blotting jsme nanesli 30 µg postnukleárních frakcí segmentů L4–L5 z každého zvířete na 12% SDS-polyakrylamidové gely, abychom provedli elektroforetickou separaci proteinů s následným přenosem na membránu PVDF v systému BioRadcuvette v 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glycin, 20% (v/v) methanol.

Membrány jsme zablokovali 5% BSA v PBS plus 0,1% Tween-20 po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a poté jsme inkubovali při 4 ◦C přes noc s primární protilátkou: myší anti- -aktin ( 1:10000), myší anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), myší anti-CV (1:1000, Invitrogen), králičí anti-HSP60 (1:500, protilátky-online), myší anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen),myší anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), králičí antiparkin (1:500, Abcam, Cambridge, UK), myší anti-PINK1 (1:500, Abcam), králičí anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), králičí anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Po několika promytích byly membrány inkubovány po dobu 2 hodin s vhodnou sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (1:50}00, vektor). Membrána byla vizualizována pomocí chemiluminiscenční směsi 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM kyselina p-kumarová, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) a (8,8 M peroxid vodíku, 1 M Tris-HCl; pH 8,5). snímky byly pořízeny přístrojem Gene Genome a analyzovány softwarem Gene Snap a Gene Tools (Syngene).

2.6. Model in vitro

Buňky NSC34 byly kultivovány v modifikovaném Eaglově médiu s vysokým obsahem glukózy (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Sigma-Aldrich), 100 jednotek/ml penicilinu a 0,5X roztokem penicilin/streptomycin (Sigma-Aldrich) a udržovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37 ◦C pod 5 % CO2, v podstatě jak bylo popsáno dříve [26].

Po 4 dnech kultivace buněk bez výměny média měly buňky NSC34 fenotyp podobný diferenciaci charakterizovaný přítomností dlouhých neuritů. 4. den byly do buněk přidány léky. Roztoky Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) a EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) byly připraveny v koncentraci 10X a rozpuštěny v DMEM.

Po 24 hodinách byla životaschopnost buněk vyhodnocena inkubací buněk s roztokem 4 mg/ml MTT po dobu 3 hodin. Vzniklé modré krystaly formazanu byly rozpuštěny v DMSO a absorbance při 570 nm byla měřena čtečkou mikrodestiček (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofekce

Transfekovali jsme milion buněk 2 ug plazmidu pro expresi GFP, GRP78, HAPARK, myší sh-eGFP, myší sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), myší sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) a /nebo myší sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) s použitím Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Švýcarsko) a sady Nucleofactor V (Lonza) podle doporučení výrobce.

Pro statickou cytometrickou analýzu jsme buňky naočkovali do {{0}}jamkových destiček potažených 10% kolagenem. Po kultivaci jsme buňky fixovali 4% PFA, dvakrát promyli PBS a skladovali nebo následně přidali blokující pufr obsahující PBS 0,3% (v/v) Triton X-100 a 10% fetálního bovinního séra. Po 3 dnech kultivace buněk byly přidány léky rozpuštěné v DMEM.

Pro tyto experimenty jsme použili 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) nebo 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Po 5 hodinách po ošetření jsme buňky buď fixovali pro imunocytochemii pomocí 4% PFA nebo je homogenizovali v modifikovaném RIPA pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1 % NP-40, 0,5 % deoxycholát sodný, 0,1 % SDS, koktejly proteázy a fosfatázy) pro imunoblotování. Imunohistochemie byla provedena dvojnásobným propláchnutím vzorků PBS a inkubací s blokovacím pufrem obsahujícím PBS plus 0,3 % (v/v) Triton X-100 a 10% fetální bovinní sérum.

Inkubovali jsme s následujícími primárními protilátkami: králičí anti-IP3R (1:200, Abcam), myší anti-HA (1:2000, Abcam), myší anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) a králičí anti-HSP60 (1:500, Protilátky-online). Pro posouzení životaschopnosti pomocí MTT, jak je popsáno výše, jsme léčbu nechali 24 hodin.

2.8. Měření produkce mitochondriálního superoxidu a ∆ψM

Buňky byly inkubovány s 2,5 uM MitoSOX pro analýzu superoxidu nebo s 2,5 uMTMRM pro analýzu ∆ψM, jak od Molecular Probes, tak Invitrogen během posledních 30 minut ošetření. Fluorescence byla detekována mikroskopem IX81 Olympus a kvantifikována pomocí softwaru statické cytometrie.

2.9. Elektrochemické měření spotřeby kyslíku

Buňky (1 x 106 na 1 ml v HBSS) byly míchány v plynotěsné komoře při 37 °C. Měření byla provedena pomocí O2 elektrody Clarkova typu (Rank Brothers, Cambridge, UK) a zaznamenána pomocí dat Dup.18 akviziční zařízení (WPI) bezprostředně po 5-ošetření pomocí vozidla nebo Tun.

2.10. Mitochondriální a cytosolická frakcionace

Buňky byly homogenizovány v lyzačním pufru (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM sacharóza a koktejl proteáz (Sigma-Aldrich) a inhibitorů fosfatázy (Roche)) pomocí Potter homogenizéru na ledu.

Po odstředění lyzátů při 2000xg po dobu 5 minut byl supernatant odstřeďován při 10 000 x g po dobu 12 minut. Supernatant byl považován za rozpustnou frakci (S2) a obsahuje cytosolové proteiny a mikrosomy.

Peleta (P2) byla obohacená mitochondriální frakce, která byla resuspendována v modifikovaném RIPA pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 % NP{{8 }}, 0,5 % deoxycholátu sodného, ​​0,1 % SDS, koktejly proteázy a fosfatázy) a koncentrace proteinu byla stanovena testem BCA. Vzorky byly poté zpracovány pro Western blot.

2.11. Transmisní elektronová mikroskopie

Ponořili jsme segmenty L{{0}}L5 míchy (1-mm plátky) do fixačního roztoku 2% (w/v) PFA a 2,5% (v/v) glutaraldehydu (EM grade) v 0,1 M PBS, pH 7,4 a umístěte je na 2 hodiny na houpací plošinu, poté fixujte v 1% (w/v) PFA a následně dodatečně fixujte 1% (w/v) oxidem osmičelým (TAAB Lab ) obsahující 0,08 % (hmotn./obj.) hexakyanoželezitan draselný (Sigma-Aldrich) v PBS po dobu 2 hodin.

Provedli jsme čtyři promytí deionizovanou vodou a sekvenční dehydrataci v acetonu. Všechny postupy byly prováděny při 4 ◦C, jak bylo popsáno výše [33]. Vzorky jsme zalili do EPON pryskyřice a polymerovali při 60 ◦C po dobu 48 hodin.

Vzorky byly zpracovány tak, aby se získaly polotenké řezy (1 um) pomocí mikrotomu Leicaultracut UCT, obarveny 1% (w/v) vodným roztokem toluidinové modři a vyšetřeny světelným mikroskopem pro identifikaci oblastí ventrálních rohů obohacených o MN.

Ultratenké řezy (70 nm) byly nařezány diamantovým nožem, umístěny na potažené mřížky a kontrastovány s konvenčním roztokem octanu uranylu a Reynoldsových roztoků citrátu olovnatého.

Nakonec jsme řezy pozorovali transmisním elektronovým mikroskopem (Jeol 1400) vybaveným kamerou GatanUltrascan ES1000CCD. Vybrali jsme tři řezy na stav, analyzovali jsme tři MN na řez a měřili jsme plochy jader ve srovnání s celkovou plochou MN pomocí nástrojů ImageJ.

2.12. Bioinformatika a statistika

Použili jsme analýzy rozptylu (ANOVA) k porovnání hodnot mezi různými experimentálními skupinami pro data, která splnila předpoklad normality. Rozdíly mezi skupinami byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA, následované Tukeyho post hoc vícerozsahovým testem nebo pomocí Studentova t-testu. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0,05 pro významnost).

3. Výsledky

3.1. Text

3.1.1. Proteomická analýza nadměrné exprese GRP78 odhalila mitochondrie jako hlavní cíl

Abychom identifikovali molekulární mechanismy vedoucí k neuroprotekci zprostředkované nadměrnou expresí GRP78, provedli jsme srovnávací proteomickou analýzu bez značení, abychom identifikovali kvantitativní i kvalitativní rozdíly mezi zvířaty s poraněním RA infikovanými adenoviry kvůli nadměrné expresi GRP78 (Ad-GRP78), u nichž bylo dříve zjištěno, že jsou neuroprotektivní. MN nebo beta-galaktosidáza (Ad-ß-Gal) jako kontrola [20].

Podle předchozích studií provedených v naší laboratoři byl pro analýzu zvolen časový bod sedm dní po poranění (dpi) [20,25]. V předchozím srovnání mezi modelem regenerace po distální axotomii a sutuře sedacího nervu oproti našemu modelu degenerativní RA jsme pozorovali, že signální události byly podobné až do 7 dpi, kdy se po RA objevily divergentní prodegenerativní události [20,25].

Analýza LC-MS/MS bez označení postnukleárních frakcí z L4-L5 míšních segmentů vedla k identifikaci 1420 proteinů s alespoň dvěma peptidy na protein, jak bylo dříve uvedeno u jiných vzorků a studií [25] .

Celkem 566 a 732 proteinů nebo peptidů bylo významně změněno v důsledku nadměrné exprese Ad-GRP78 nebo Ad-ß-Gal u zvířat s poraněním RA ve srovnání se zvířaty s poraněním RA, která nebyla infikována virem (p < 0 .05) (tabulky S1 a S2).

Porovnali jsme oba seznamy a zjistili jsme, že 220 bylo jedinečně změněno v důsledku nadměrné exprese Ad-GRP78 (tabulka S3). Funkční anotace těchto proteinů pomocí nástroje Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) nám umožnila identifikovat nejvýznamnější biologické funkce v souboru dat (FDR < 0,05) [34,35].

Nadměrná exprese GRP78 vedla k rozdílům v hladinách proteinů zapojených do mitochondriálních procesů, funkcí a komponent (tabulka S4A–C, obrázek S1A–C). Termíny genové ontologie (GO) a analýza obohacení KEGG dráhy těchto dat odhalila, že u zvířat infikovaných Ad-GRP78 došlo k významnému poklesu hladin mnoha proteinů s mitochondriálními funkcemi, včetně proteinů z vnější a vnitřní mitochondriální plochy, proteinů respiračního komplexu, a matricové proteiny.

Potvrdili jsme rozdíly v hladinách proteinů odhalených v proteomickém seznamu, jako je GRP75, který byl upregulován (p < 0,05) a podjednotka komplexu V (CV ), downregulovaný (p=0,03) ve skupinách GRP78 podle očekávání (obrázek 1A).

V celém seznamu nejvíce downregulované byly 2-oxoglutarát/malatenosičový protein OGC (SCL25A11), MT-ND3 (nádorový supresor, který se účastní themalát-aspartátové kyvadlové dopravy a regeneruje NADH pool v mitochondriální matrix, aby umožnil komplex I), podjednotka 3 NADH dehydrogenázy komplexu I, aminotransferáza kyseliny gamaaminomáselné ABAT a podjednotka reduktázy ubichinol-cytochrom C komplexu III. Naproti tomu velmi málo proteinů bylo upregulováno (obrázek 1B).

Jedním upregulovaným proteinem byl GRP78, jak se očekávalo, a dalšími upregulovanými proteiny byl aminokyselinový transportér EAAT2, který se primárně nachází v plazmatické membráně a někdy v mitochondriích na excitačních synapsích, a hydroxyacyl-CoA dehydrogenáza HADHA, která katalyzuje poslední tři kroky mitochondriální beta - oxidace mastných kyselin s dlouhým řetězcem.

Rozšířili jsme analýzu, abychom zjistili, zda byly jiné proteiny v mitochondriích nebo proteinech souvisejících s funkcí mitochondrií modifikovány z proteomického seznamu, abychom potvrdili funkční ovlivnění mitochondrií (obrázek 1C).

Pozorovali jsme, že mitochondriálně konzervovaná dynaminem související optická atrofie 1 GTPázy (OPA1), která se účastní fúze [36], byla downregulována (p < 0.1); LONP1, ATP-dependentní proteáza, která zprostředkovává selektivní degradaci chybně složených polypeptidů, vykazovala tendenci ke zvýšení, ale nebyly pozorovány žádné rozdíly v hladinách ubichinonu NDUFA9, transkripčního faktoru NRF2, který reguluje geny, které obsahují prvky antioxidační odezvy, nebo jiný dynamin. GTPáza související s infuzí, jako je mitofusin 2 (MFN2) [36].

Komplexní shrnutí změn nalezených v mitochondriích je znázorněno ve schématu na obrázku 1D. Dynamika mitochondrií je důležitá pro stresové reakce, protože poškozené mitochondrie fúzují pro výměnu materiálu a mitochondriální štěpení umožňuje segregaci poškozených mitochondrií a následnou mitofágii [37].

Vzhledem k tomu, že hlavní počet downregulovaných proteinů se lokalizuje v mitochondriích a nebyly pozorovány žádné zjevné změny týkající se fúzní aktivity mitochondrií analýzou MFN2 a poměru forem L/S OPA1 (obrázek 1C), zkoumali jsme markery související s mitofágií.

Klasicky k autofagii závislé degradaci mitochondrií dochází po depolarizaci a je obvykle spuštěna zvýšenou akumulací fosfatázy a tensinhomologem (PTEN) indukované domnělé kinázy 1 (PINK1) v plné délce na vnější mitochondriální membráně.

Následně je rekrutována E3 ubikvitin-protein ligáza Parkin mezi kruhy k označení mitochondriálního proteinu vnější membrány depolarizované mitochondrie ubikvitylací [38–41]. Horní část obrázku 2A ukazuje žádné změny v hladinách Parkina, ale významné snížení plné délky PINK1 způsobené RA-zraněním v ipsilaterálním L4-L5 míšním segmentu s ohledem na kontrolu při 7 dpi. Naproti tomu nadměrná exprese GRP78 snížila Parkin, ale zdvojnásobila hladiny PINK1 po RA ve srovnání s kontrolní expresí nepříbuzného proteinu -Gal (obrázek 2A, dole).

Upregulace PINK1 plné délky je konzistentní s indukcí mitofágie [42] a Parkinova redukce může souviset s pokročilým stavem rozpadu organel, jak bylo pozorováno u ostatních mitochondriálních proteinů.

Dále zkoumáme společnou lokalizaci mitochondrií a proteinů asociovaných s mikrotubuly 1A/1B lehkého řetězce 3 (LC3)-pozitivních bodů, které jsou klíčovou složkou základního makroautofagického aparátu a jsou nezbytné pro proces mitofágie [43].

Pomocí konfokální mikroskopie jsme pozorovali významný nárůst společné lokalizace mitochondrií, značených pomocí anti-COX IV, s LC3-pozitivním bodem po RA pouze u poškozených MN nadměrně exprimujících GRP78 při 7 dpi (obrázek 2B).

Existenci mitofágie u avulzovaných MN jsme potvrdili pouze při nadměrné expresi GRP78 analýzou vzorků pomocí transmisní elektronické mikroskopie.

Pozorovali jsme hojné vakuoly s pohlcenými mitochondriemi, charakteristickým znakem mitofágie [37], připomínající mitofagozomy, a několik ERcisternae v těsném spojení s mitochondriemi v MN od zvířat Ad-GRP78, ale nezjistili jsme je u Ad{3}}Gal RA-zraněných vzorky krys při 5 dpi (obrázek 2C).

Obrázek 1. Nadměrná exprese GRP78 u zvířat s poraněním RA se zaměřuje na mitochondriální proteiny. (A) Imunoblot a sloupcové grafy ukazující průměrné násobné změny (± SEM) hladin GRP78, GRP75 a CV proteinů v segmentech míchy L4-L5 v GRP78 vs.

-Gal nadměrně exprimující RA-zraněné krysy o 7 dpi. Hladiny byly normalizovány na hodnoty aktinu (n=4; * p < 0,05 vs. Ad- -Gal, Studentův t-test). (B) Histogram změn záhybu mitochondriálního proteinu získaný proteomickou analýzou segmentů míchy L4-L5 u zvířat s poraněním RA, která nadměrně exprimují GRP78 ve srovnání se skupinou Ad- -Gal o 7 dpi. (C) Imunoblot a sloupcové grafy ukazující průměrné násobky změn (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 normalizované na aktin. (Žádné významné rozdíly mezi skupinami. Studentův t-test). (D) Schematické mitochondrie s proteiny změněnými nadměrnou expresí GRP78 v segmentech míchy L4-L5 od zvířat s poraněním RA zvýrazněné žlutě (snížení) nebo modře (zvýšené) při 7 dpi.

Obrázek 2. Mitofagie je modulována in vivo po RA u potkanů, kteří nadměrně exprimují GRP78. (A) Imunobloty a odpovídající sloupcové grafy pro analýzu PINK1 a PARK násobné změny hladin proteinů (průměr ± SEM) normalizovaných na hladiny aktinu v segmentech L4-L5 míchy RA-zraněných vs.

ovládání (nahoře) nebo ze skupin Ad{{0}}Gal a Ad-GRP78 (dole) o 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, Studentův t-test). (B) Vlevo, mikrofotografie reprezentativních MN v ipsilaterálním místě od zvířat zraněných RA, která dostala intratekální injekci skupin AAVrh10-GFP nebo AAVrh10-GRP78 při 7 dpi. Vzorky byly barveny na COX IV (červená) a LC3 (zelená) a kontrastně barveny fluorescenční Nissl (modrá).

Měřítko=10 µm a digitální přiblížení 10X.

Všimněte si, že společná lokalizace je pozorována pouze ve skupině AAVrh10-GRP78. Vpravo, sloupcový graf ukazující analýzu % ko-lokalizačních bodů COX IV a LC3. Průměr ± SEM společné lokalizace COX IV a LC3 (n=4; ** p < 0,01,Studentův t-test). (C) Reprezentativní snímky transmisní elektronové mikroskopie, kde jsou mitochondrie rozlišeny v MN míchy: a, snímek MN cytoplazmy ukazující mitochondrie nekontrolovaného zvířete; b, snímek MN cytoplazmy z RA-zraněné krysy ze skupiny Ad- -gal; c, obrázek MN cytoplazmy z RA-zraněné krysy ze skupiny Ad-GRP78 s některými pohlcenými mitochondriemi označenými červenými hvězdičkami; d, obrázek s větším zvětšením je zobrazen na (C) s poukazem na velkou mitochondrii a kontakt ER. Na obrázcích jsou vyznačeny měřítka.

Celkově tyto výsledky naznačují, že nadměrná exprese GRP78 může indukovat MN odpojené od mitofagyinu po RA a mohla by podporovat neuroprotekci.

3.1.2. Nadměrná exprese GRP78 obnovuje poškozenou mitochondriální funkci

Poté jsme dále zkoumali účinek nadměrné exprese GRP78 na mitochondrie pomocí in vitro modelu stresu ER, protože tento inzult se objevuje brzy po dříve popsaném poškození RA in vivo [20,26] a je to spolehlivá metoda pro screening nových neuroprotektivních činidel [2,44 ].

Tento model využívá tunicamycin (Tun), což je induktor ER-stresu, který způsobuje tvorbu N-acetylglukosamin-lipidových meziproduktů, čímž zabraňuje glykosylaci nově syntetizovaných proteinů a vede k chybnému skládání proteinů. Použili jsme to, protože zastavená sekreční dráha byla také hlášena jako klíčová v neurodegenerativním procesu po RA [26].

Nejprve jsme ověřili, že nukleofekce buněk podobných motoneuronu NSC34 vhodným vektorem vedla k produkci GRP78 (obrázek 3A). V těchto buňkách exprese GRP78 významně zvýšila přežití v médiu obsahujícím Tun (obrázek 3B).

Ačkoli léčba Tunem normálně indukuje samotný GRP78, tato endogenní nadměrná exprese je poměrně pozdní (o 24 hodin) (obrázek S2). Také jsme přemýšleli, zda bychom mohli určit, zda má nadměrná exprese GRP78 neuroprotektivní účinky v jiném modelu in vitro, o kterém jsme dříve informovali, že reprodukuje několik charakteristik smrti MN po poranění RA [26].

Tento model je založen na poškození cytoskeletu indukovaném nokodazolem, který interferuje s polymerací mikrotubulů. Exprese GRP78 také zvýšila životaschopnost buněk kultivovaných v přítomnosti nokodazolu (obrázek 3B).

Poté jsme hodnotili mitochondriální funkci měřením tvorby druhů reaktivního kyslíku (ROS) v mitochondriích pomocí MitoSOX, potenciálu mitochondriální membrány (∆ψm) pomocí tetramethylrhodamin methylesteru (TMRM) a spotřeby O2 v našich buňkách NSC34 vystavených stresu ER. s nadměrnou expresí GRP78 nebo bez ní.

Jako pozitivní kontrolu jsme použili efavirenz (EFV), mitotoxickou látku, která mění všechny tři parametry [45]. Pozorovali jsme, že hladiny MitoSOX se po přidání Tun progresivně zvyšovaly a dosáhly statistické významnosti za 24 hodin a že tvorba ROS byla významně zvýšena v buňkách ošetřených EFV od první hodiny po ošetření s ohledem na kontroly ošetřené vehikulem (obrázek S3A).

Nadměrná exprese GRP78 vedla k významně nižším hladinám mitochondrií ROSin s ohledem na buňky exprimující GFP 24 hodin po ošetření Tun nebo EFV (obrázek 3C). ∆ψm se zhroutil po 5 a 24 hodinách léčby Tunem a po 24 hodinách léčby EFV (obrázek S3B). Obnovení tohoto parametru bylo dosaženo nadměrnou expresí GRP78 v buňkách ošetřených Tun nebo EFV (obrázek 3D).

Rychlost spotřeby O2 byla snížena během 80 min analýzy po přidání Tun v buňkách, které exprimují GFP (sklon −0.063,R2=0.98), ale spotřeba O2 byla stabilní v buňkách nadměrně exprimujících GRP78- navzdory přítomnosti Tun (sklon −0,221, R2=0,99) (obrázek 3E, vlevo).

Po 5 hodinách bylo dýchání normální u buněk nadměrně exprimujících GRP{1}} a vážně narušeno u buněk exprimujících GFP (obrázek 3E, vpravo). Celkově tyto výsledky naznačují, že GRP78 zeslabuje mitochondriadysfunkci způsobenou ER stresem nebo mitotoxicitou.

For more information:1950477648nn@gmail.com