Graham{0}}Učení přináší jedinečný přepis

Abstraktní:
Učení může vyvolat neurofyziologickou plasticitu ve sluchové kůře v několika časových měřítcích. Trvalé změny sluchové kortikální funkce, které přetrvávají dny, týdny nebo dokonce celý život, vyžadují genovou expresi indukovanou učením. De novo transkripce je skutečně molekulárním determinantem toho, zda se přechodné zážitky transformují na dlouhodobé vzpomínky s trvalým dopadem na chování.

S neustálým rozvojem vědy a techniky se v průběhu lidského života objevilo mnoho magických životních jevů, z nichž nejcennější pro výzkum je paměť. Paměť je důležitou součástí vyspělé lidské nervové aktivity a je také záznamem a hromaděním různých událostí, ke kterým došlo od evoluce člověka. Existuje tedy vztah mezi genovou expresí a pamětí? Odpověď je ano.

Za prvé, vliv genů na paměť je zřejmý. Může regulovat expresi různých molekul a proteinů souvisejících s pamětí prostřednictvím jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a dalších metod. To může ovlivnit efektivitu komunikace mezi neurony, a tím ovlivnit kognitivní, koncepční, emocionální a další vlastnosti člověka, což ukazuje na kvalitu paměti.

Za druhé, paměť může mít také určitý vliv na genovou expresi. V procesu našeho učení, paměti a myšlení se nejedná pouze o změny v nervové aktivitě mozku, ale také o regulaci a zásahy mnoha genů a molekul. Regulace těchto genů a molekul zaznamená stopy odpovídající pocitům a zkušenostem, které existují v naší dlouhodobé paměti, a nakonec se uloží do genů.

Konečně existuje vzájemná závislost mezi pozitivním přístupem a schopností dlouhodobé paměti. Šťastná nálada nám může pomoci více se soustředit a soustředit během procesu učení a myšlení, a tím pomáhá zlepšit schopnost paměti. Dlouhodobá záměrná paměť může také podporovat tvorbu nových nervových spojení a struktur v mozku, což je také velmi užitečné pro budoucí učení a paměť.

Proto můžeme dojít k závěru, že existuje korelace mezi genovou expresí a pamětí. Můžeme podporovat a zlepšovat naši paměťovou schopnost prostřednictvím záměrné paměti, optimismu a pozitivního myšlení, což nám také může pomoci dosáhnout lepšího fyzického a duševního zdraví. Jen tak můžeme lépe sloužit společnosti a lidskému rozvoji. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál, který má mnoho jedinečných účinků, jedním z nich je zlepšení paměti. Účinnost mletého masa vychází z různých účinných látek, které obsahuje, včetně kyselin, polysacharidů, flavonoidů atd. Tyto složky mohou různými způsoby podporovat zdraví mozku.

Klikněte na vědět doplňky pro zlepšení paměti

Sluchové kortikální geny, které podporují sluchové učení, paměť a získané zvukově specifické chování, jsou však velkou neznámou. Tato zpráva je první, která identifikuje změny v genomové expresi indukované učením v rámci sluchové kůry v celém genomu, o které se předpokládá, že je základem tvorby sluchové paměti. Bioinformatické analýzy profilů genového obohacení ze sekvenování RNA identifikovaly biologické dráhy, které zahrnují cholinergní synapse a interakce s neuroaktivními receptory.

Zjištění charakterizují klíčové kandidátní efektory, které jsou základem změn v kortikální funkci, které podporují tvorbu dlouhodobé sluchové paměti v dospělém mozku. Identifikované molekuly a mechanismy jsou potenciálními terapeutickými cíli pro usnadnění dlouhodobých a zvukově specifických změn sluchové funkce v dospělosti a jsou nyní primární pro budoucí výzkumy zaměřené na geny.

Rukopis:

Dobře přijímaný koncept v oblasti učení a paměti je, že vzpomínky jsou ukládány tam, kde jsou zpracovávány (Nadel & Hardt, 2011). Biologické události známé jako konsolidace paměti mohou stabilizovat přechodné neurální reprezentace vyvolané smyslovou zkušeností (Lechner, Squire & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Základními a evolučně konzervovanými mechanismy, které iniciují konsolidaci paměti, jsou transkripce a translace, definované jako aktivní exprese genů, respektive jejich následných proteinových produktů (Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Předpokládali jsme, že učení rozpoznávání zvuku indukuje de novo genovou expresi ve sluchové kůře. Vysoce specifické reprezentace zvukových podnětů mohou přetrvat pomíjivost zkušeností (sekundy a minuty) konsolidací do dlouhodobé paměti (hodiny až dny), která později řídí chování na základě zvuku. Zatímco se předpokládá, že za konsolidaci paměti jsou zodpovědné výrazné regionální transkriptomické profily (Katzman, et al., 2021), transkripční události vyvolané učením, které podporují tvorbu paměti v centrálním sluchovém systému, jsou velmi nedostatečně popsány.

Naproti tomu sluchová kůra byla výjimečně dobře popsána ve studiích sluchového učení a paměti na úrovni neurofyziologických změn zejména v receptivních polích a tonotopických mapách (Schreiner &Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), kortiko- kortikální andkortiko-fugální konektivita (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), včetně více časových měřítek (Froemke & Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David a Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Kromě toho jsou neurofyziologické změny spojeny s chováním, např. pro akci řízenou narážkou (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), pozornost (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) a paměť pro zvukové signály (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso a Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Desítky let důkazů o neurofyziologické plasticitě vyvolané učením ve sluchové kůře prokázaly sdílené behaviorální charakteristiky sluchové paměti (Weinberger 2007a; 2007b), což z ní činí hlavní kandidátskou oblast pro konsolidaci sluchové paměti. Bioinformatickým zkoumáním sluchové kůry také využíváme neobjektivní příležitost odhalit v celém mozku běžné nebo odlišné biologické vrátnice neuroplasticity, která je základem adaptivní sluchové funkce. Z širší perspektivy může regionální transkriptomické profilování vést k úplnějšímu pochopení toho, jak je smyslový systém modifikován zkušeností ve službách paměti.

Učením indukované transkriptomické profily identifikované ve sluchové kůře mohou potvrdit, rozšířit nebo vést k novým biologickým modelům procesů, které podporují nebo zhoršují adaptivní sluchové zpracování. Konsolidace sluchové paměti je pravděpodobně produktem zkušeností závislých změn v genové expresi, které ovlivňují buněčné funkce ve sluchové kůře, což zase podporuje trvalé změny zvukem vyvolané neurofyziologické odezvy, které mění chování vyvolané zvukem.

K identifikaci transkriptů vyvolaných učením byla provedena analýza profilování exprese pomocí RNAsequencing (RNAseq) na vzorcích anatomicky definovaného sluchového kortexu (Bregma -3.10 mm, Interaurální 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) od dospělých jedinců s omezeným přístupem k vodě, trénovaných na bar press až po čisté tóny za vodní odměny. Odezvy na cílovou čistou tónovou frekvenci (5,0 kHz; 65 dB SPL) vedly k odměně, zatímco reakce na necílovou (11,5 kHz; 65 dB SPL) byly bez odměny a zahájily časový limit, který prodloužil čas do dalšího pokusu.

Tato úloha dvoutónové diskriminace (2TD) není z hlediska vnímání obtížná; akustické frekvence jsou od sebe přes oktávu a hlodavci je snadno rozliší (Talwar & Gerstein, 1998). Výzva v chování byla spíše asociativní: výkon 2TD vyžaduje paměť, pro který tón je spojen s odměnou (vs. žádná odměna). Cvičené krysy (N=8) byly usmrceny po třech po sobě jdoucích denních 45-minutových 2TD tréninkových lekcích a porovnány se skupinou zvukem naivních krys (N=4). Toto je čas na začátku tréninku, kdy zvířata stále získávají úkol 2TD. Včasné získávání úkolů bylo zaměřeno na zachycení počátečních transkripčních událostí vyvolaných učením, které připravily půdu pro pozdější zvýšení výkonu 2TD pozorovaného během týdnů tréninku.

Například průměrný výkon byl nad šancí, ale pouze 66±7,81 % po 3 dnech, ve srovnání s Větším nebo rovným 90 % po prodlouženém tréninku (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). Abychom využili příležitosti identifikovat expresi genů relevantních pro úspěšnou zvukově specifickou asociativní paměť, využili jsme inhibitor HDAC, který se zaměřuje na sepigenetickou regulaci genové exprese závislé na aktivitě při učení a tvorbě paměti (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017; Malvaez, et al., 2012). Důležité je, že desetiletí práce ukázalo, že inhibice HDAC může usnadnit učením indukovanou neurofyziologickou plasticitu u zvukem vyvolaných sluchových kortikálních reakcí (ve vztahu k vehikulu) a zlepšit sluchové diskriminační chování (Bieszczad a kol., 2015; Phan a kol., 2017; Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) včetně nelidí (Gervain, et al., 2013).

Polovina trénovaných zvířat byla léčena inhibitorem HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, kat#A8803; sub. cu. injekce) , zatímco druhá polovina byla identicky trénovaná, ale byl jí podáván roztok vehikula (N=4; odpovídající objem, dílčí cu. injekce; obr. 1a). Mezi skupinami nebyly v době sběru mozků žádné rozdíly ve výkonu 2TD (RGFP966: 61±5,0 % vs. Vehikulum: 71±7,0 %; t(5,9166)=-1,21, p=0,272 ; Welchův t-test). Mozky byly okamžitě odebrány a bleskově zmraženy v čase odpovídajícím maximální koncentraci inhibitoru ve sluchové kůře, jednu hodinu po injekci buď inhibitoru HDAC nebo vehikula po sezení (Bieszczad et al., 2015).

Zde uvedená zjištění jsou první, která identifikuje transkriptomický profil asociativního učení v rámci sluchové kůry. Učení v úkolu dvoutónové diskriminace vyvolalo změny v úrovních transkripce stovek genů (ve srovnání se zvukem naivním) (obr. 1b). Hierarchický shlukovací algoritmus ukázal, že geny jsou jedinečně upregulovány nebo downregulovány, což odhalilo komplexní síť kortikálních genových expresí vyvolaných sluchovým učením (obr. 2a).

Analýzy obohacení (iPathwayGuideTM; metoda Impact Analysis) identifikovaly cholinergickou synapsi (diferenciálně exprimované geny (DEG) / všechny geny (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) jako nejvyšší biologickou dráhu (tabulka 1) . Tento výsledek je v souladu s výzkumem od 90. let 20. století zdůrazňujícím dostatek cholinergní signalizace ve sluchové kůře pro neurofyziologickou plasticitu a související sluchové chování (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Úrovně transkriptů indukované učením pod HDAC-inhibicí byly buď amplifikovány stejným směrem (dalším zvýšením nebo dalším snížením jedinečných genových transkriptových úrovní) (obr. 2b) nebo otupeny ve srovnání se samotným učením (obr. 2c). Jednou z nejlepších biologických cest za těchto podmínek byla interakce neuroaktivní ligand-receptor (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; tabulka 1), která zahrnovala efektory klíčové pro neurální aktivaci.

Další hlavní cestou byla interakce receptoru extracelulární matrice (ECM-receptor) (DEG/ALL: 14/69; p=0,04; tabulka 1). Komponenty ECM jsou kritické pro kortikální plasticitu a konsolidaci paměti (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Tyto dráhy nabízejí potenciální alternativy, možná doplňkové, k cholinergní signalizaci, které mohou usnadnit změny sluchové funkce závislé na trvalé zkušenosti (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Jiné geny, jejichž exprese se měnila se sluchovým učením, ale ne dále s inhibicí HDAC, pravděpodobně souvisely s procedurálními podmínkami úkolu, spíše než s asociativní pamětí specifickou pro zvuk. Například byla identifikována apelinová signální dráha (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), která je důležitá v mozku pro homeostatickou regulaci příjmu vody (Hu, et al., 2021). Přímé srovnání úrovní transkriptů mezi dvěma skupinami trénovaných krys (učení s inhibicí HDAC nebo bez ní) ukázalo velmi málo jedinečně diferenciálně exprimovaných genů (DEG).

Prahová hodnota znatelně použitá k identifikaci nejpravděpodobnějších stupňů (p =0,05) zjištěná pouze u Adamts13, U6, Rexo4 a Cabin1 byly odlišně vyjádřeny (obr. 2d). Zdá se tedy, že hlavní účinek inhibice HDAC modulovat expresi genů indukovanou sluchovým učením za normálních podmínek, spíše než nově získávat jedinečné geny pro zachování zvukově specifické paměti. Tyto nálezy společně ukazují, že ve sluchové kůře nastávají rozsáhlé transkriptomické změny na začátku tréninku, když se dospělá zvířata učí rozlišovat asociativní vztahy mezi zvukovými podněty. Spolu se zavedenými neurofyziologickými a behaviorálními zprávami o inhibici HDAC na podporu sluchové funkce tato zjištění podporují taktiku použití inhibitoru HDAC k rozlišení genů, jejichž exprese určuje úspěch tvorby sluchové paměti.

Několik zájmových genů (GOI) bylo vybráno z inbiologických cest analýzy obohacení, aby se potvrdilo sekvenování celého genomu s přístupem cíleným na gen. Vzorky byly shromážděny ze samostatných kohort, které replikovaly dvě skupiny trénovaných a léčených zvířat ve stejné rané fázi. tréninkový časový bod (tj. jednu hodinu po třetím 2TD tréninku) pro použití při analýze genové exprese pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT-PCR). V replikovaných kohortách nebyly žádné rozdíly ve výkonu 2TD (RGFP9661: 61±5.0% vs. RGFP9662: 67±6.0%; t(8,441)=-0,834, p {{20}},4274; a Vozidlo1:71±6.0% vs. Vozidlo2: 74±3,0%; t(4,0809)=-0,444, p {{ 34}}.6796; Welchův t-test).

První GOI byl Egr1, dobře prostudovaný, na aktivitě závislý „bezprostředně časný gen“, o kterém je známo, že vrcholí během prvních hodin učení a je kritický pro tvorbu paměti (Duclot & Kabbaj, 2017). Byl to gen indukovaný toplearningem s potvrzenou zvýšenou expresí, který byl rovněž amplifikován inhibicí HDAC v samostatné kohortě zvířat v genově cílené studii (obr. 3). Totéž platilo pro Per2, gen zapojený do regulace cirkadiánních rytmů a serotoninergních drah v mozku (Bae, a kol., 2001; Albrecht, a kol., 2001; Cuesta, a kol., 2009; Reh, a kol. ,2020). Per2 je součástí rodiny „hodinových genů“, která je spojena s modulací HDAC v jiných oblastech mozku (Kwapis, et al., 2018) a může mít roli i ve sluchové funkci (Reh et al., 2020). Naproti tomu některé GOI identifikované v celém genomu byly potvrzeny pouze částečně.

Chrna7 kóduje podjednotku dynamického nikotinového acetylcholinového receptoru (nAChR), u kterého bylo zjištěno, že je downregulována sluchovým učením, v souladu s neurofyziologickými důkazy (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Očekávali jsme tedy, že studie zaměřená na gen potvrdí down-regulaci Chrna7 u všech zvířat trénovaných 2TD, ale down-regulace byla zjevná pouze u zvířat ošetřených vehikulem, která se naučila 2TD bez inhibice HDAC. Další vybrané GOI pocházely z rodiny sirotčích jaderných receptorů Nr4a, Nr4a1 a Nr4a2, což jsou geny, o kterých se okamžitě zjistilo, že jsou nezbytné pro šíření následných účinků selektivního cíle HDAC RGFP966 v jiných oblastech mozku (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

V souladu s předchozími zprávami o regionálních rozdílech v genové expresi rodiny Nr4a závislých na úkolu (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, ale ne Nr4a2, byl up-regulován ve sluchové kůře po sluchovém učení. Jiné DEG, Htr1a nebo Adamts13, nebyly potvrzeny genově cílenou studií pravděpodobně kvůli rozdílům ve známých variantách transkriptů, které nebyly detekovány našimi speciálně navrženými sondami cílenými na gen, nebo kvůli chybě typu I, nebo kvůli jemným rozdílům v chování mezi trénovanými kohortami zvířat, která zůstal nezjištěn v měření výkonu 2TD. Také jsme zkoumali Lynx1, gen s dlouhou historií funkce pro znovuotevření plasticity podobné „kritickému období“ v senzorické kůře (Morishita et al., 2010), pravděpodobně díky jeho působení na cholinergní a serotonergní modulaci (Takesian, et al. , 2018). Jakkoli v souladu s předchozími zprávami o celém genomu, které selhaly při jeho detekci (Kalish, et al., 2020), nebyl detekován ani v našem souboru dat RNAseq, ani v genově cílené studii.

Ačkoli zůstává výzvou určit, zda lze nesrovnalosti vysvětlit skutečnou biologickou nebo individuální variabilitou mezi zvířaty nebo kvůli technické variabilitě s nízkou četností nebo transkripty exprimujícími specifický typ buňky, u některých GOI uvádíme výjimečně konzistentní výsledky. Vzhledem k tomu, že učením indukovaná exprese Chrna7, Egr1 a Per2 je konzistentní mezi genově cílenými a genomovými přístupy a mezi různými kohortami trénovaných zvířat, je logické, že tyto geny mohou být těmi nejzákladnějšími hráči pro trvalé změny. sluchové funkce a paměti a jsou nyní hlavní pro budoucí zkoumání.

Shrneme-li společně, zjištění odhalují dynamickou transkripční krajinu v kůře sluchového orgánu dospělých, která by mohla podporovat vznikající sluchovou funkci v neurofyziologii a chování. Vzhledem k rostoucím důkazům o epigenetických kontrolách funkce senzorického systému (srov. Shang & Bieszczad, 2022) je vzrušující zvážit jak epigenetické mechanismy hrají roli při vyvažování stability se zkušenostně závislou plasticitou sluchových kortikálních okruhů. Například aktuální soubor dat pro celý genom také identifikoval učením indukované snížení exprese arepresivní histondeacetylázy, Hdac9, které chybělo při inhibici HDAC.

Je lákavé stejně jako účinek snížené exprese HDAC9 k účinku farmakologické inhibice HDAC k podpoře transkripce indukované učením. Další důležitá třída epigenetických regulátorů mění DNA spíše než histony. Příklady jsou Tet1 a Gadd45b, které ovlivňují methylaci DNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) a bylo zjištěno, že jsou regulovány směrem dolů a nahoru s učením pod inhibicí HDAC. Dále se třída mikroRNA objevila jako top biologická dráha indukovaná učením s HDAC-inhibicí (viz tabulka 1), které získaly trakci v terénu jako klíčové epigenetické regulátory nervové transkripční kontroly (Saab & Mansuy, 2014). Pravděpodobné jsou také molekulární interakce vyššího řádu mezi epigenetickými hráči a proteinovými produkty exprimovaných genů. Například identifikovaný up-regulovaný Egr1 může rekrutovat Tet1 k odstranění represivních methylačních značek, aby se aktivovaly downstream geny (Sun, et al., 2019). Budou zapotřebí další molekulární studie, aby se zjistil význam interakcí mezi epigenetickými regulátory ve sluchovém systému během učení. Navíc tato zpráva představuje okamžitou příležitost k vytvoření spojení mezi vybranými sluchovými kortikálními geny a jejich následnými efektory.

Překlenutí mezery mezi těmito geny a molekulami k jejich vlivu na zvukem vyvolané neurofyziologické události je nezbytné pro pochopení toho, jak se dospělý sluchový systém přizpůsobuje zkušenostmi ke změně chování. Translace de novo transkriptů je skutečně nutná pro dlouhodobé změny behaviorální funkce, protože způsobují trvalé změny buněčné funkce. Klíčové cílové efektory transkripčních procesů indukovaných učením mohou například změnit dostupnost kanálů nebo receptorů (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) v obvodech, které určují zvuk architektura evokovaného prahu, citlivosti a receptivního pole ve sluchovém systému. Je rozumné předpokládat, že různé sluchové úkoly by rekrutovaly jedinečné genové sítě pro biologické dráhy relevantní pro konkrétní buněčné funkce, které by podporovaly učení se pro úkolově relevantní zvukovou vlastnost nebo strukturu úkolu.

Celkově tato zpráva slouží jako výchozí bod pro zpřístupnění datových souborů RNAseq z učení, dospělých a sluchové kůry (viz úložiště dat). Snaha o zmenšení mezery ve znalostech umocněná vážným nedostatkem studií, které se zaměřují na molekulárně genetické procesy ve sluchové kůře dospělých, je nyní vítána. Podporujeme studium za časoprostorovými omezeními hromadného sekvenování RNA, jehož citlivost je technicky omezena také hloubkou čtení (Li& Wang, 2021), zejména proto, že moderní technologie Omics se rychle vyvíjejí a zlepšují.

Zatímco výzkum ve sluchové kůře udělal v molekulární genetice několik počátečních kroků, které identifikovaly zásadní molekulární kaskády (Schicknick, et al., 2008), permisivní IEG profily (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018 Peter, et al., 2011) a dokonce i chromatindynamika (Peter, et al., 2021), existuje precedens ve sluchové periferii, kde je transkripční dynamika krásně studována (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al., 2020; Ebeid, et al., 2017). Stávající molekulární nástroje, jako je sekvenování jednobuněčné RNA (RNA-Seq) a fluorescenční hybridizace in situ s malými molekulami (smFISH), budou užitečné k tomu, aby poskytly pohled na variace mezi buňkami závislé na zkušenostech a molekulární interakce v rámci sluchových kortikálních buněk a okruhů. Na rozdíl od hromadného RNAseq tyto metody respektují hlubokou buněčnou diverzitu a organizaci vyššího řádu ve sluchové kůře, jako je její mikroobvod specifický pro vrstvu a lemniskální topografie.
Chytré přístupy k transkriptům značek a sekvencí z teprve nedávno aktivních sluchových kortikálních buněk (Cho, Huang, & Gray, 2016) mohou zvýšit citlivost natolik, aby se robustně získaly funkčně nejrelevantnější sady genů z funkčně nejrelevantnějších typů a populací buněk. Podobné přístupy by mohly být použity také subkortikálně k zachycení a kontrastu na aktivitě závislých regionálních transkriptomických profilů v kůře, které ctí neuvěřitelnou integraci kortikálu se subkortikální funkcí sluchového systému za různých podmínek poslechu nebo behaviorálních požadavků. Plná charakterizace buněčných a regionálních rozdílů v genetických a molekulárních mechanismech, které jsou základem sluchového učení v dospělém mozku, je prvořadá pro vývoj místně selektivních a na molekuly cílených přesných terapeutik, které umožňují robustní a trvalé funkční změny na podporu specifických sluchových a poslechových schopností po celou dobu života.

Metody

Subjekty: V behaviorálních a molekulárních experimentech bylo použito celkem 24 dospělých samců potkanů ​​Sprague-Dawley (250 – 300 g při příjezdu; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA). Všechna zvířata byla jednotlivě umístěna v místnosti s kolonií s řízenou teplotou (24 °C) v 12-hodinovém cyklu světlo/tma. Subjekty měly před tréninkem chování ad libitum přístup k potravě a vodě. Všechny postupy byly schváleny a prováděny v souladu s pokyny Institutional AnimalCare and Use Committee (IACUC) v Rutgers, State University of New Jersey (protokol č.:999900026 (KMB)).

Behaviorální aparát a zvukové podněty: Všechny behaviorální relace byly prováděny ve dvou identických přístrojových kondičních komorách (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) ve zvukově tlumeném boxu. Denní tréninky byly vyváženy tak, aby byla zajištěna stejná expozice oběma komorám. Každá komora (12" Š x 10" H x 12" V; podlaha z drátěného pletiva byla vybavena ovládací pákou (H21-03R), domovním světlem (H11-01R), reproduktorem (H{ {8}}R) a systém dodávky vody (H14-05R). Během tréninkových fází mohla zvířata stisknout páku odezvy („barpress“), což spustilo předložení šálku s vodou (~0,02 ccm) v portu pro odměnu (1,25" Š x 1,625" V). Ruční spínač (V21-01) byl během rané sezení použit k tvarování odezvy zvířete na stisk baru, aby se spustily prezentace pohárku s vodou, který umožňoval přístup k Behaviorální odezvy byly zaznamenány pomocí softwaru Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) pro offline analýzu.

Všechny sluchové podněty byly generovány pomocí softwaru Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) a RPvdsEx a prezentovány prostřednictvím nástěnného reproduktoru operantní komory. Whitenoise (během procedurálního tréninku; obr. 1a) byl prezentován po dobu 7 nebo 9 s (75 dB SPL). Čisté tóny (během dvoutónového rozlišovacího tréninku; obr. 1a) byly vždy prezentovány po dobu 8 s (70 dB SPL). Hladiny zvuku byly denně kalibrovány pomocí digitálního zvukoměru (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Trénink chování a farmakologická inhibice HDAC3: Po jednom dni aklimatizace na vivarium se s potkany manipulovalo denně po dobu minimálně 3 dnů. Před začátkem behaviorálního tréninku byly krysy umístěny do režimu omezeného množství vody, dokud nedosáhly 85 % neomezené hmotnosti kontrolních zvířat odpovídajícího věku. Krysy s omezeným přístupem k vodě byly poté tvarovány uvnitř zvukem tlumených komor k barpressu za vodní odměnu (obr. 1a). Tvarování barpressu a následný zvukový trénink byly, jak bylo popsáno dříve (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Stručně řečeno, všechna zvířata byla tvarována do barpressu po dobu 5 dnů a poté trénována v procedurální úloze, aby se naučila stlačit tak, aby zvuk, který v této fázi byl širokopásmový gaussovský šumový stimul (1-12,5 kHz pásmově filtrovaný bílý šum; 75 dB SPL), za účelem získání vodní odměny. Všechna zvířata se úspěšně naučila spojovat tento zvuk s odměnou, než pokračovala do další fáze výcviku. Procedurální trénink ukázal individuální variabilitu toho, jak rychle se zvířata dokázala úkolu naučit na vysokou úroveň výkonu. Nicméně všechna zvířata byla schopna dosáhnout úrovně výkonu vyšší nebo rovné 90 % po dva po sobě jdoucí dny (průměr=92,85 %, sem =0,01 %) po průměrně 12,67 dnech ( sd=2.85 dní). Výkon byl vypočítán pomocí 100 %.

Další fází tréninku byla úloha dvoutónové diskriminace (2TD) (obr. 1a), ve které byli potkani trénováni k rozlišení dvou spektrálně odlišných zvukových frekvencí. Stisk čáry na tón S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) by vedl k prezentaci vodní odměny, zatímco stisknutí čáry na kámen (11,5 kHz; 70 dB SPL) vedl k chybovému signálu (blikající dům světlo) a „time-out“ (dalších 6 s čekání na začátek dalšího pokusu). Zkoušky S+ a S-S byly randomizovány a trvaly 8 sekund. Intervaly mezi studiemi (ITI) byly v průměru 15 s (rozsah: 5-25 s, randomizováno). Barpressy během tiché ITI byly bezvýznamné (žádný časový limit, žádný chybový signál ani vodní odměna). Denní sezení trvala 45 minut. Všechna zvířata prováděla úkol 2TD celkem tři po sobě jdoucí dny. Krysy byly spárovány trénovaným pozorovatelem tak, že zvířatům s podobnou mírou osvojení procedurálního úkolu byly ve fázi 2TD přiřazeny různé podmínky léčby. Páry s odpovídajícím výkonem dostaly systémové injekce buď farmakologického inhibitoru HDAC3 třídy I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg; sc; N=12) nebo roztoku vehikula (N=9) bezprostředně po každé 2TD relace. Výkon úlohy 2TD byl vypočten tak, jak bylo popsáno dříve: 100 % (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 20).

Sběr tkání a izolace RNA: Jednu hodinu poté, co zvířata obdržela svou třetí a poslední injekci RGFP966 po třetím sezení 2TD, byly mozky rychle vypreparovány a bleskově zmraženy v kádince s 2-methylbutanem umístěné na suchém ledu. Bleskově zmrazené mozky byly poté uloženy při -80˚C až do budoucího zpracování. K přípravě mozků na kryosekci byly mozky zapouzdřeny směsí pro neoptimální teplotu řezání (OCT) a skladovány při -20˚C po dobu 12-24 hodin, aby se zajistilo, že mozková tkáň dosáhne -20˚C pro řezání. Mozky uzavřené v OCT by pak byly horizontálně nakrájeny na plátky v kryostatu (Leica CM 3050S) o tloušťce 250 µm. Pomocí 1 mm mikropropichovačky z kulaté tkáně byly odebrány vzorky 2 mm3 sluchové kortikální tkáně z každé hemisféry (sloučeny do jednoho vzorku pro celkem 4 mm3 na oblast mozku) pro extrakci RNA. Sluchová kortexlokace byla identifikována pomocí Paxinose a Watsona The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6. vydání) jako reference (přibližně A/P=-3,6 až -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 až -5,8 mm; a použití hippocampu jako orientačního bodu

Celková RNA z každého vzorku byla izolována pomocí PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) podle protokolu výrobce. Vzorky RNA byly poté purifikovány pomocí sady RNA Clean and ConcentratorTM -25 Kit (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), sekvenační knihovny byly vytvořeny pomocí Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit podle protokolů doporučených výrobcem. Knihovny byly sloučeny a sekvenování bylo provedeno na Illumina NovaSeq 6000 se 100 bp párovým koncem SBSchemistry. Čtení byla zpracována pomocí open-source informačního kanálu 'bcbio-nextgen.py' vyvinutého primárně v Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) běžícího na Argon HPCresource na University of Iowa. Tento kanál zahrnuje přístupy „osvědčených postupů“ pro kontrolu kvality čtení, zarovnání čtení a kvantifikaci. Potrubí 'bcbio-nextgen.py' bylo spuštěno v režimu "RNA-seq" s klíčem 'rn6' jako vybraným sestavením genomu (interně odkazující na sestavení Ensembl a genebuild 'Rnor_6.0'). Zarovnaný kanál čte do genomu Rnor_6.0 pomocí ultrarychlého zarovnávače hisat2 (2.2.1) s vědomím sestřihu a současně kvantifikuje čtení do transkriptomu pomocí zarovnávače „losos“ (1.4.0). Qualimap (2.2.2), výpočetní nástroj, který zkoumá soubory zarovnání hisat2 BAM, byl použit ke zkoumání načtených dat pro kontrolu kvality. Skóre kvality sekvencí prošlo základními kontrolami a míra duplikace sekvencí byla v přijatelných parametrech. Všechny vzorky prošly kontrolou kvality pro zarovnání čtení s exonickými oblastmi. Kvantifikace transkriptů odvozených z lososa (TPM nebo "transkripty na milion") byly importovány a shrnuty do odhadovaných počtů na úrovni genů pomocí tximport (1.12.3) v Rstudio, jak je popsáno v nejlepším praktikuje DESeq2 vinětu(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Geny s méně než 5 odhadovanými počty ve všech vzorcích byly předfiltrovány z následné analýzy podle doporučeného postupu. Analýza diferenciální genové exprese byla provedena s DESeq2 (v.1.24.0) na odhadovaných počtech na úrovni genů. FDR 5 % a X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Validace dat RNA-seq pomocí qRT-PCR: Data RNA-seq byla ověřena pomocí qRT-PCR na mRNA extrahované z různých kohort krys. Pět transkriptů bylo vybráno ze seznamu nových DEG nalezených obohacených v každé oblasti na začátku. Tři z genů byly řízeny hypotézami na základě sluchové kortikální fyziologické a behaviorální literatury, zatímco další tři geny byly nové geny identifikované z genové úrovně a analýz DEG ve srovnání mezi skupinami léků a vehikul. Všechny sekvence primerů byly vybrány buď z předchozí literatury o mozkové tkáni u krys (sekvence jsou uvedeny v tabulce níže) nebo navrženy pomocí NCBI Primer Blast a ověřena cílová specificita vyhodnocením křivek tání a sekvenováním produktu PCR amplikonu. qRT-PCR analýzy byly provedeny v QuantStudio 3 (Applied Biosystems) s SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Pro každý vzorek bylo amplifikováno 500 ng cDNA pomocí iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).

Poděkování

Autoři by rádi poděkovali Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur a Sooraz Bylipudi za jejich pomoc při behaviorálních procedurách a analýzách; Dr. Mimi L. Phan za pomoc s extrakcí RNA a protokoly odběru vzorků; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi a ChristopherO'Brien za jejich pomoc s analýzou purifikace vzorků RNA; a Alise Ray za technickou pomoc. Rádi bychom poděkovali všem současným i bývalým pracovníkům CLEF Lab za jejich pomoc a podporu.

Tato práce byla podpořena National Institutes of Health, National Institute of Deafness and Communication Disorders [R01-DC014753 to KMB]; škola umění a věd na Rutgers University; Aresty Foundation na Rutgers University s malým grantovým financováním pro vysokoškolský výzkum; a program Project SUPER na Rutgers University s malým grantovým financováním pro vysokoškolský výzkum.

Reference:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). Regulace transkripce při konsolidaci paměti. ColdSpring Harbour Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 a mper2 jsou nezbytné pro normální resetování cirkadiánních hodin. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Senzorický neokortex a asociativní paměť. BehavioralNeuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Diferenciální funkce mPer1, mPer2 a mPer3 v cirkadiánních hodinách SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Indukce fyziologické paměti v mozkové kůře stimulací nucleus basalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Perineuronální sítě ve smyslové kůře dospělých jsou nezbytné pro učení strachu. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . On, DZ (2018). RNA-seq transkriptomikanalýza vláskových buněk vnitřního ucha dospělých zebřiček. Vědecké údaje, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Role demetylace DNA závislé na aktivitě u dospělého mozku a neurologických poruch. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Inhibice histonové deacetylázy prostřednictvím RGFP966 uvolňuje brzdy senzorické kortikální plasticity a specifičnosti tvorby paměti. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.{2}}.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Modulace draslíkového kanálu a sluchové zpracování. Hearing Research, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN (2018). Lynx1 zabraňuje dlouhodobé blokádě potenciace a snížení exprese neuromodulátoru způsobené A 1-42 a aktivací JNK. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com