Abstraktní

K dosažení vysoce hodnotného využití polysacharidů zCistanche deserticolazbytků, tato studie použila zbytek zbývající po extrakci fenylethanoidových glykosidů (průmyslový proces založený na patentované technologii membránové separace,Patent č. ZL200710102756.7, held by Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd., https://www.xjcistanche.com/about-us) as the raw material. We systematically investigated the differences in chemical structural characteristics and antioxidant activities among various polysaccharide fractions obtained through membrane separation. The results indicated significant variations in chemical composition and activity among polysaccharide fractions with different molecular weights. Utilising ultrafiltration membranes of varying molecular weight cutoffs (300 kDa, 50 kDa, 10 kDa) combined with alcohol precipitation, four distinct polysaccharide fractions were successfully prepared: >300 kDa (pojmenovaný CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) a<10 kDa (CTP 4). Monosaccharide composition analysis indicated that all four fractions primarily contained mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, and arabinose, but their proportional ratios differed. Fourier-transform infrared spectroscopy confirmed that all fractions exhibited typical characteristic polysaccharide absorption peaks. Scanning electron microscopy results demonstrated that ultrafiltration membranes with different pore sizes significantly altered the aggregation state and surface roughness of the polysaccharides by retaining components of varying molecular weights. This morphological difference may be related to intermolecular interactions and the sieving effect during ultrafiltration. In antioxidant activity assays, CTP 1 showed the optimal performance, achieving DPPH radical scavenging rates exceeding 61% and ABTS⁺ radical scavenging rates surpassing 95% at 8 mg/mL. All four fractions demonstrated appreciable antioxidant activity. This study confirms that membrane separation technology can effectively fractionate polysaccharides from Cistanche deserticolazbytek. Výzkum poskytuje teoretický základ a data podporující recyklaci zdrojů zbytků rostlinné medicíny a vysoce hodnotný vývoj polysacharidových složek.

Klíčová slova: Cistanche deserticola; polysacharidy; antioxidační aktivita; technologie membránové separace; strukturální analýza

 

Patent na technologii oddělování membrán drží centrála Wecistanche

 

 

 

 

 

 

Zavedení

Cistanches Herba(Cistanche), sušený masitý stonek s listy šupinyCistanche deserticolaYC Ma (pouštní cistanche) popřCistanche tubulosa(Schenk) Wight (CTP), je poprvé zaznamenán vShennong Bencao Jing (Shennongova klasika Materia Medica). Jako typický představitel tradičních tonických čínských léčiv v Číně a látka homologní pro potraviny a léčiva se vyrábí především v severozápadních pouštních a pouštních oblastech, jako je Sin-ťiang a Vnitřní Mongolsko, čímž si vysloužil pověst „pouštního ženšenu“. Má účinky tonizujícího jangu ledvin, vyživuje jin ledvin, prospívá esenci a krvi a zvlhčuje střeva ke zmírnění zácpy [2-3]. V něm obsažené fenylethanoidové glykosidy mají významné biologické aktivity a jsou hlavními látkami extrahovanými v současné průmyslové výrobě. Velké množství využitelných látek však zůstává po těžbě ve zbytku, který se likviduje jako odpad, což nejen způsobuje plýtvání zdroji, ale také potenciálně představuje zátěž pro životní prostředí. Proto dosažení vysoce hodnotné recyklace zbytku má velký význam pro efektivní rozvoj čínských léčivých zdrojů a rozvoj šetrný k životnímu prostředí.

Polysacharidy jako hlavní aktivní složky vCistanchevykazují různé farmakologické aktivity, jako jsou antioxidační, anti-aging, hepatoprotektivní, protizánětlivé, imunomodulační a protinádorové účinky [4-7], a mohou být široce používány při vývoji léků, stejně jako v potravinách a zdravotnických produktech. Předchozí studie rozsáhle optimalizovaly proces extrakce a provedly předběžné hodnocení aktivityCistanchepolysacharidů, ale systematický výzkum polysacharidů ve zbytku po extrakci fenylethanoidových glykosidů zůstává vzácný, zejména postrádá hloubkovou analýzu účinných separačních a frakcionačních technologií pro zbytkové polysacharidy a rozdíly v aktivitě mezi různými frakcemi, což značně omezuje zlepšení celkové hodnoty využitíCistanchezdroje.

V oblasti výzkumu polysacharidů mají netříděné surové polysacharidy problémy, jako jsou smíšené složky, nejasné příspěvky k aktivitě a nejednoznačné cíle, takže je obtížné přesně odhalit materiálový základ pro jejich antioxidační, imunomodulační a další funkce. Mezitím nečistoty, jako jsou proteiny, pigmenty a anorganické soli v surových polysacharidech, také narušují hodnocení jejich aktivity a vývoj aplikací. Tradiční metody, jako je sloupcová chromatografie, mají vysoké rozlišení, ale je obtížné je zvětšit, zatímco frakcionace srážením alkoholem je drsná a představuje rizika pro životní prostředí. Technologie membránové separace se svými výhodami vysoké účinnosti, šetrnosti k životnímu prostředí a přesné frakcionace vykazuje velký potenciál v separaci a čištění polysacharidů. Umožňuje přesnou frakcionaci polysacharidových složek přes membrány s různými limity molekulové hmotnosti, což poskytuje ideální technickou podporu pro odhalení vztahu mezi strukturou a aktivitou polysacharidů „molekulární hmotnost-aktivita“ [8]. Tang a kol. [9] úspěšně purifikovali tři polysacharidové složky přímo zLentinus edodesvodní extrakty s použitím kombinace 2,5 kDa, 5 kDa a 10 kDa ultrafiltračních membrán. Technologie membránové separace použitá v této studii je chráněna patentem na vynález (Patent č. ZL200710102756.7) v držení Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (https://www.xjcistanche.com/about-us), která se zaměřuje na výrobu surovin obsahujících fenylethanoidní glykosidy zCistanchepomocí membránové separace, která poskytuje robustní průmyslový základ pro náš výzkum. Produkty vyvinuté naší výzkumnou skupinou na základě systematických studií fenylethanoidových glykosidů zCistanche tubulosa [10] have entered the pilot production stage. Based on this, this study uses the residue of Cistanchepo extrakci fenylethanoidových glykosidů jako suroviny využívá ultrafiltrační membrány kombinované s alkoholovým srážením k frakcionaci a čištění polysacharidů ve zbytku a systematicky analyzuje rozdíly v chemických strukturních charakteristikách a antioxidačních aktivitách polysacharidových frakcí s různými molekulovými hmotnostmi. Cílem je otevřít nové cesty pro recyklaci zdrojůCistanchezbytky, zlepšit průmyslový řetězec a položit teoretický a experimentální základ pro vývoj nových funkčních potravin nebo antioxidantů na bázi přírodních polysacharidů.

 

50 % echinakosid 10 % akteosidový extrakt Cistanche doplňky extrahované technologií membránové separace

Zkontrolujte výpis

Supporting Service Of Wecistanche-Pro více podrobností o spolupráci
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

1 Materiály a metody

1.1 Materiály a nástroje

Cistanche deserticolazbytek poskytlHotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (Hotan, Čína), vytvořený průmyslovou extrakcí fenylethanoidových glykosidů prostřednictvím patentované technologie membránové separace (Patent č. ZL200710102756.7; https://www.xjcistanche.com/about-us). Glukózový standard byl zakoupen od Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute. m-Hydroxybifenyl (98 %), Coomassie Brilliant Blue G-250, dialyzační vaky (MD44), souprava pro stanovení kapacity vychytávání radikálů DPPH, souprava pro stanovení kapacity pohlcování radikálů ABTS, souprava pro stanovení kapacity vychytávání superoxidových aniontů a souprava pro stanovení celkové antioxidační kapacity (celková antioxidační kapacita) byly zakoupeny od společnosti Beijing Solarbio Science & Technology serumonic acid8% album, bovi%), album 8%). (98 %) a kyselina askorbová (Vc) byly zakoupeny od Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Další chemická činidla byla analytické čistoty.

UV-19001 UV-Vis spektrofotometr (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); elektronické váhy YP10002 (Shanghai Hengji Scientific Instruments Co., Ltd.); elektronické váhy SQP (Sartorius Scientific Instruments Co., Ltd.); vodní lázeň EYELA (SB-1200); CA-1111 zařízení pro cirkulaci chladicí vody (Shanghai Ailang Instruments Co., Ltd.); SHZ-D cirkulační vodní vývěva (Shanghai Jinfu Experimental Instrument Equipment Co., Ltd.); N-1100 rotační výparník; XCLD-10FE vymrazovací sušička (Shanghai Xingchuang Scientific Instrument Equipment Co., Ltd.); BONA-GM-18C experimentální stroj pro separaci organických membrán; 300 kDa, 50 kDa, 10 kDa ultrafiltrační membrány (polyethersulfon, Jinan Bona Co., Ltd., Shandong); TGL-16A centrifuga (Changsha Pingfan Instruments); analytická váha BT25S (Sartorius Scientific Instruments); Vysoce výkonný kapalinový chromatograf Dionex U3000 (Thermo Fisher Scientific, USA); LC-DCY-12GK dusíkové dmychadlo (Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.); systém ultračisté vody UPH-I-10T (Chengdu Ultra Pure Technology Co., Ltd.); DF-101S infračervený spektrometr (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); Rastrovací elektronový mikroskop Zeiss Supra55VP (Carl Zeiss (Shanghai) Management Co., Ltd.).

 

Specifikace Cistanche

1.2 Experimentální metody

1.2.1 Těžba ropyCistanchePolysacharidy

Podle extrakčního procesu získaného z předběžných zkoušek bylo získáno 150 gCistanche deserticolazbytek byl zvážen, extrahován při 100 stupních po dobu 3 hodin s poměrem pevná látka-kapalina 1:20 g/ml, odstřeďován při 4000 ot./min po dobu 10 minut a supernatant (obsah polysacharidu: 4,4 mg/ml) byl shromážděn, aby se získal polysacharidový extrakt.

1.2.2 Frakcionace a separaceCistanchePolysacharidy

Vodný extrakt zCistanchePolysacharidy byly podrobeny ultrafiltrační frakcionaci za použití 300 kDa, 50 kDa a 10 kDa ultrafiltračních membrán za podmínek tlaku 0,18 MPa a teplotě 40 stupňů. Retentáty a permeáty byly shromážděny odděleně, zakoncentrovány rotačním odpařováním a byl přidán 95% ethanol pro dosažení konečné koncentrace ethanolu 80%. Směs byla umístěna na 4 stupně po dobu 24 hodin, poté centrifugována při 4000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a supernatant byl odstraněn, aby se získala sraženina. Sraženina byla znovu rozpuštěna ve vodě, dialyzována proti 3500 Da dialyzačnímu vaku po dobu 48 hodin a lyofilizována.Cistanche polysaccharides. Four fractions were obtained by collecting retentates and permeates: >300 kDa (pojmenovaný CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) a<10 kDa (CTP 4).

1.2.3 Stanovení chemických složek polysacharidů

1.2.3.1 Stanovení celkového obsahu cukru

Ke stanovení obsahu polysacharidů ve vzorcích byla použita metoda fenol-kyselina sírová [11]. Standardní křivka byla připravena za použití glukózy se standardním roztokem glukózy 0,1 mg/ml. Přesné objemy 0,4 ml, 0,8 ml, 1,2 ml, 1,6 ml a 2,0 ml standardního roztoku byly převedeny do 10 ml uzavřených zkumavek a byla přidána voda na celkový objem 2,0 ml. Poté byl přidán 1,0 ml čerstvě připraveného 6% roztoku fenolu, dobře promíchán a podél stěny zkumavky bylo rychle přidáno 5,0 ml koncentrované kyseliny sírové. Směs byla třepána, zahřívána ve vodní lázni o teplotě 90 stupňů po dobu 15 minut, poté byla odstraněna a ochlazena na teplotu místnosti. S použitím destilované vody jako slepého pokusu byla měřena absorbance při 490 nm UV-Vis spektrofotometrem. Získaná standardní křivka byla y=16.196x+0.0834, s R2=0.999. Byl připraven roztok polysacharidu 0,1 mg/ml a absorbance každé polysacharidové frakce byla měřena za použití stejné metody. Celkový obsah cukru v každé frakci byl vypočten dosazením do standardní křivky.

1.2.3.2 Stanovení obsahu bílkovin

Pro stanovení obsahu bílkovin ve vzorcích byla použita metoda Coomassie Brilliant Blue [12]. Standardní křivka byla připravena za použití hovězího sérového albuminu s 0,1 mg/ml standardního proteinového roztoku. Standardní proteinový roztok byl zředěn na koncentrace 0,02, 0,03, 0,05, 0,07 a 0,09 mg/ml. Poté byl do zkumavek přidán 1 ml každé koncentrace standardního proteinového roztoku, následně 5,0 ml chromogenního činidla Coomassie Brilliant Blue a promícháno třepáním. Za použití destilované vody jako slepého pokusu byla absorbance měřena při 595 nm po 10 minutách reakce. Získaná standardní křivka byla y=0.0034x+0.7673, s R2=0.996.. Absorbance každé polysacharidové frakce byla měřena za použití stejné metody a obsah proteinu v každé frakci byl vypočten dosazením do standardní křivky.

1.2.3.3 Stanovení obsahu kyseliny uronové

Ke stanovení obsahu kyseliny uronové ve vzorcích byla použita metoda m-hydroxybifenyl [13]. Standardní křivka byla připravena za použití kyseliny galakturonové se standardním roztokem kyseliny galakturonové o koncentraci 0,1 mg/ml. Standardní roztok byl zředěn na koncentrace 0,01, 0,02, 0,03, 0,05 a 0,1 mg/ml. Poté byl do zkumavek přidán 1 ml každé koncentrace standardního roztoku a 6 ml roztoku tetraboritanu sodného a kyseliny sírové bylo přidáno za podmínek lázně led-voda, promícháno třepáním, zahříváno ve vroucí vodě po dobu 5 minut, ochlazeno na teplotu místnosti a bylo přidáno 0,1 ml m-hydroxybifenylového činidla, důkladně promícháno a ponecháno stát při teplotě místnosti 30 minut. Za použití destilované vody jako slepého pokusu byla měřena absorbance při 525 nm. Získaná standardní křivka byla y=7.5339x+0.0494, s R2=0.995. Byl připraven roztok polysacharidu 0,1 mg/ml a absorbance každé polysacharidové frakce byla měřena pomocí stejné metody. Obsah uronové kyseliny v každé frakci byl vypočten dosazením do standardní křivky.

 

Wecistanche Munufacturer

1.2.4 Stanovení složení monosacharidů

Chromatografické podmínky: Systém kapalinové chromatografie Thermo U3000 vybavený kolonou Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Mobilní fází byl acetonitril:fosfátový pufr (12 g/l dihydrogenfosforečnan draselný, pH upraveno na 6,8 pomocí 2 mol/l NaOH) v objemovém poměru 17:83, s izokratickou elucí. Průtok byl 0,8 ml/min, teplota kolony byla 30 stupňů, detekční vlnová délka byla 250 nm a objem nástřiku byl 10 ul.

Příprava standardního roztoku: 5 mg rhamnózy, arabinózy, galaktózy, glukózy, xylózy, manózy, kyseliny galakturonové, kyseliny glukuronové, glukosamin hydrochloridu a galaktosamin hydrochloridu a 10 mg fukózy bylo postupně zváženo, rozpuštěno a doplněno na 10 ml pro přípravu standardního zásobního roztoku.

Příprava roztoku vzorku: 5 mg každé ze čtyř polysacharidových frakcí bylo zváženo, přidáno k 1 ml 2 mol/l roztoku TFA a zahříváno na 121 stupňů po dobu 2 hodin. Pro vysušení roztoku byl propláchnut dusík. Poté byly přidány 3 ml methanolu pro promytí a roztok byl znovu vysušen; tento krok promývání methanolem byl opakován 2–3krát. Zbytek byl rozpuštěn v 1 ml sterilní vody a přenesen do chromatografické lahvičky pro testování. Poté bylo 0,2 ml polysacharidového hydrolyzátu přidáno do zazátkované kónické centrifugační zkumavky, následně 0,2 ml 0,5 mol/l roztoku hydroxidu sodného a 0,5 ml 0,5 mol/l roztoku PMP v methanolu. Směs byla vortexována a ponechána reagovat v 70stupňové vodní lázni po dobu 1 hodiny. Po reakci se přidalo 0,2 ml 0,5 mol/l kyseliny chlorovodíkové k neutralizaci hydroxidu sodného, ​​přidal se 1 ml chloroformu a směs se třikrát třepala pro extrakci, aby se odstranil přebytek PMP. Chloroformová vrstva byla odstraněna, bylo odebráno 0,3 ml vodné vrstvy a byla přidána voda do objemu 1 ml. Poté bylo 0,2 ml každého z 11 monosacharidových standardů derivatizováno za použití stejné metody [14-15].

1.2.5 Analýza infračervenou spektroskopií s Fourierovou transformací (FT-IR).

Příslušné množství každé ze čtyř polysacharidových frakcí bylo umístěno na vzorkový podstavec příslušenství ATR infračerveného spektrometru a měření FT-IR byla provedena pomocí infračerveného spektrofotometru s Fourierovou transformací ve frekvenčním rozsahu 4000–400 cm⁻1 [16].

1.2.6 Analýza rastrovací elektronovou mikroskopií (SEM).

Morfologie čtyř polysacharidových frakcí byla analyzována pomocí SEM [17]. Malé množství každé polysacharidové frakce bylo rovnoměrně fixováno na tenké měděné desce a vrstva zlatého prášku byla odpařena na povrchu vzorku pomocí iontového rozprašování. Morfologie povrchu byla pozorována při 5,00 kV.

1.2.7 Stanovení antioxidační aktivity in vitro

1.2.7.1 Stanovení DPPH· Kapacita pohlcování radikálů

Koncentrace čtyř polysacharidových frakcí byly nastaveny na 1, 2, 3, 4 a 8 mg/ml a pozitivní kontrolní skupina (Vc) byla také nastavena na stejné koncentrace. Stanovení bylo provedeno podle instrukcí soupravy pro stanovení kapacity vychytávání radikálů DPPH·.

1.2.7.2 Stanovení kapacity vychytávání superoxidového aniontu

Koncentrace čtyř polysacharidových frakcí byly nastaveny na 0,5, 1, 2, 4 a 8 mg/ml a pozitivní kontrolní skupina (Vc) byla také nastavena na stejné koncentrace. Stanovení bylo provedeno podle instrukcí soupravy pro stanovení kapacity vychytávání superoxidových aniontů.

1.2.7.3 Stanovení celkové antioxidační kapacity

Koncentrace čtyř polysacharidových frakcí byly nastaveny na 0,5, 1, 2, 4 a 8 mg/ml a pozitivní kontrolní skupina (Vc) byla také nastavena na stejné koncentrace. Stanovení bylo provedeno podle pokynů soupravy pro stanovení celkové antioxidační kapacity.

1.2.7.4 Stanovení kapacity ABTS⁺ zachycování radikálů

Koncentrace čtyř polysacharidových frakcí byly nastaveny na 0,5, 1, 2, 4 a 8 mg/ml a pozitivní kontrolní skupina (Vc) byla také nastavena na stejné koncentrace. Stanovení bylo provedeno podle instrukcí soupravy ABTS pro stanovení kapacity zachycování radikálů.

1.3 Zpracování údajů

Každý experiment byl opakován třikrát za stejných podmínek a výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Pro analýzu významnosti byl použit software SPSS 21.0 s jednocestnou ANOVA pro jednofaktorovou analýzu; P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné. Pro grafy byly použity Origin 2024 a GraphPad Prism 10.1.2.

 

Vysoce kvalitní suroviny

Reference

[1] Státní lékopisná komise.Lékopis Čínské lidové republiky, svazek I[M]. Peking: China Pharmaceutical Technology Press, 2020.

[2] GUO Y, CAO L, ZHAO Q, et al. Předběžná charakteristika, antioxidační a hepatoprotektivní aktivita polysacharidu zCistanche deserticola [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 678-685.

[3] ZHANG XY, JIANG QW, YANG SH a kol. Chemometrická analýza a integrovaný farmakologický přístup k dešifrování účinku a mechanismu mezi surovým a zpracovanýmCistanche tubulosa [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2024, 328.

[4] CHENG N, WANG H, HAO H a kol. Pokrok ve výzkumu polysacharidových složekCistanche deserticolajako potenciální farmaceutická činidla [J].European Journal of Medicinal Chemistry, 2023, 245.

[5] TAO J, ZHONG X, LIN H a kol. Potenciál, výzvy a vyhlídky polysacharidů z roduCistanchejako terapeutická činidla pro onemocnění související se stárnutím: Přehled [J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 312.

[6] ZHOU S, FENG D, ZHOU Y, a kol. Analýza účinných látek a zdravotních aplikacíCistanche [J]. Hranice ve výživě, 2023, 10.

[7] ZHANG X, LIU Z, LI Z a kol. Ferroptózní dráhy: Odhalení neuroprotektivní sílyCistanche deserticolafenylethanoidové glykosidy [J].Journal of Ethnopharmacology, 2024, 333.

[8] CAI M, XING H, TIAN B a kol. Charakteristika a protiúnavová aktivita tříděných polysacharidů zGanoderma lucidumoddělené technologií kaskádové membrány [J].Sacharidové polymery, 2021, 269: 118329.

[9] TANG W, LIU C, LIU J a kol. Purifikace polysacharidu zLentinus edodesvodní extrakt membránovou separací a jeho chemické složení a charakterizace struktury [J].Potravinové hydrokoloidy, 2020, 105.

[10] Ainur Memetiturxun, GAO L, HUO SX a kol. Optimalizace procesu odstředivé extrakce pro verbascosid pomocí metodologie Box-Behnken Response Surface [J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2022, 39(23): 3086-3091.

[11] JIN W, ZHOU H, ZHAO H, et al. Izolace, in vitro antioxidační kapacita, hypoglykemická aktivita a imunoaktivita hodnocení polysacharidů zCoriandrum sativumL [J/OL].Antioxidanty, 2025, 14(2): 149. https://doi.org/10.3390/antiox14020149

[12] SPLITTGERBER AG, SOHL J. Nelinearita v proteinových testech metodou vázání barviva Coomassie blue [J].Analytická biochemie, 1989, 179(1): 198-201.

[13] CAI M, XING HY, XU J, et al. Stupňovaná separaceGanoderma lucidumSurové polysacharidy s využitím membránové technologie a srovnání jejich antioxidačních aktivit [J].Věda a technologie potravinářského průmyslu, 2021, 42(10): 29-35.

[14] GUO Y, WANG L, LIU K, et al. Rychlá a přesná UHPLC metoda pro stanovení monosacharidů v polysacharidech různých zdrojůRadix Astragalia analýza jeho imunitní aktivity [J/OL].Molekuly, 2024, 29(10): 2287. https://doi.org/10.3390/molecules29102287

[15] DU C, LIU X, ALGADI H, a kol. Optimalizace extrakce polysacharidů, složení monosacharidů a analýza antioxidační aktivity různých odrůdGastrodia elataBl. části antény [J].Konverze biomasy a biorafinérie, 2023, 14(23): 29353-29365.[16] HONG T, YIN JY, NIE SP, a kol. Aplikace infračervené spektroskopie ve strukturní analýze polysacharidů: Pokrok, výzva a perspektiva [J].Chemie potravin: X, 2021, 12.[17] ZHOU S, HUANG G. Extrakce, charakterizace struktury a biologická aktivita polysacharidu z kokosové kůry [J].Chemické a biologické technologie v zemědělství, 2023, 10(1).