FOXO reguluje expresi antimikrobiálních peptidů a podporuje fagocytózu hemocytů u krevet antibakteriální imunity
Aug 31, 2023
Abstraktní
Bezobratlí se spoléhají na vrozenou imunitu, včetně humorální a buněčné imunity, aby odolali patogenní infekci. Předchozí studie ukázaly, že transkripční faktor O forkhead box (FOXO) se účastní slizničních imunitních odpovědí savců a střevní humorální imunitní regulace bezobratlých. Zda se však FOXO podílí na regulaci systémové a buněčné imunity u bezobratlých, zůstává neznámé. V této studii jsme identifikovali FOXO z krevet (Marsupenaeus japonicus) a zjistili jsme, že byla exprimována v relativně bazálních hladinách u normálních krevet, ale byla významně zvýšena u krevet napadených Vibrio anguillarum. FOXO hrálo klíčovou roli při udržování homeostázy hemolymfy a střevní mikrobioty podporou exprese Relish, transkripčního faktoru dráhy imunitní nedostatečnosti (IMD) pro expresi antimikrobiálních peptidů (AMP) v krevetách. Také jsme zjistili, že patogenní infekce aktivovala FOXO a indukovala jeho jadernou translokaci snížením aktivity serin/threonin kinázy AKT. V jádře aktivované FOXO přímo regulovalo expresi svých cílových genů Amp a Relish proti bakteriální infekci. Dále bylo zjištěno, že FOXO se podílí na buněčné imunitě podporou fagocytózy hemocytů prostřednictvím upregulace exprese fagocytárního receptoru scavenger receptoru C (Src) a dvou malých GTPáz, Rab5 a Rab7, které souvisejí s přenosem fagozomů do lysozomu. v cytoplazmě. Celkově naše výsledky ukázaly, že FOXO uplatňuje své účinky na homeostázu hemolymfy a střevní mikroflóry aktivací dráhy IMD u normálních krevet a přímo nebo nepřímo podporuje expresi AMP a zvyšuje fagocytózu hemocytů proti patogenům u krevet infikovaných bakteriemi. Tato studie odhalila různé funkce FOXO ve slizniční (lokální) a systémové antibakteriální imunitě bezobratlých.
Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Úvod
Proteiny rodiny forkhead box transkripčního faktoru O (FOXO) se podílejí na různých kritických biologických procesech organismů, včetně regulace buněčného cyklu, opravy poškozené DNA, protirakovinné imunity a regulace délky života [1,2]. Savci mají čtyři různé FOXO proteiny (FOXO1, FOXO3, FOXO4 a FOXO6); bezobratlí však mají pouze jedno FOXO, které je také známé jako Daf-16 v Caenorhabditis elegans [3]. Transkripční aktivita FOXO je regulována několika druhy posttranslačních modifikací, jako je fosforylace, acetylace, metylace a ubikvitinace [4]. Tyto modifikace ovlivňují jadernou translokaci FOXO nebo výstup z jádra a jeho interakci s korepresory a koaktivátory, které mohou podporovat nebo snižovat aktivitu FOXO a zprostředkovat jeho různé biologické funkce [5,6]. Po aktivaci se FOXO účastní mnoha fyziologických funkcí regulací transkripce různých cílových genů [7]. FOXO jsou aktivovány různými extracelulárními stimuly, včetně růstových faktorů, cytokinů a hormonů [8]. Růstové signály, jako je inzulín nebo inzulínu podobný růstový faktor 1 (IGF-1), interagují s receptory inzulínové dráhy a aktivují signalizaci fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K), což vede k fosforylaci FOXO serin/threonin kináza, protein kináza B (AKT) [9]. Fosforylované FOXO se translokuje z jádra do cytosolu nebo brání jeho translokaci z cytosolu do jádra, kde se stává ubikvitinací, což vede k jeho degradaci proteazomem [10]. Naproti tomu při absenci externích růstových signálů je signální dráha PI3K-AKT neaktivní a nefosforylovaný FOXO se translokuje do jádra, aby podpořil transkripci cílového genu [11]. FOXO se také podílí na antibakteriálních a antivirových vrozených imunitních odpovědích bezobratlých [12,13]. Chronická aktivace FOXO ve stárnoucích střevech Drosophila potlačuje expresi peptidoglykanového rozpoznávacího proteinu SC2 (negativní regulátor dráhy imunitní nedostatečnosti (IMD)) a narušuje střevní imunitní homeostázu [14]. FOXO přímo reguluje geny antimikrobiálního peptidu (AMP) v epiteliálních tkáních neinfikovaných drozofil v reakci na stres z hladovění, který je nezávislý na drahách přirozené imunity reagujících na patogeny [15]. Infekce patogenem však může také přimět enterocyt FOXO ke vstupu do jádra z cytoplazmy přímo ve střevech Drosophila [12]. FOXO-dependentní regulace AMP se také vyskytuje v savčích epiteliálních tkáních, což naznačuje, že je u zvířat evolučně konzervovaná [16]. Několik studií ukázalo, že FOXO jsou aktivovány patogeny nebo stimulací cytokinů ve slizničních imunitních odpovědích [17]. Jejich translokace do jádra a vazba na promotory jejich cílových genů je stimulována mitogenem aktivovanou proteinkinázovou (MAP) dráhou a inhibována dráhou PI3K/AKT. Mezi cílové geny FOXO patří prozánětlivé signální molekuly, adhezní molekuly a chemokinové receptory [17]. Zda se FOXO účastní systémových imunitních odpovědí proti patogenům, zůstává nejasné. Podpora exprese AMP proti patogenům je důležitým mechanismem humorální vrozené imunity u bezobratlých [18]. U vrozené imunity Drosophila se dráhy Toll a IMD podílejí na regulaci exprese AMP a AMP hrají důležitou roli při eliminaci invazních patogenů [19–21]. Podobně jako u hmyzí imunity se na regulaci exprese AMP u korýšů podílejí dráhy Toll, IMD a Janus kináza (JAK)/převodník signálu a aktivátor transkripce (STAT) [22,23]. Zda FOXO může regulovat expresi AMP nezávisle na Toll, IMD a JAK/STAT drahách proti infekci patogeny u korýšů, vyžaduje objasnění. Kromě humorální imunity se bezobratlí také spoléhají na buněčnou imunitu, aby plnily funkce přirozené imunity proti patogenní infekci. Fagocytóza hemocyty je jedním z důležitých mechanismů buněčné imunity proti patogenní infekci [24]. Předchozí studie zjistily, že FOXO1-zprostředkovaná autofagie je nezbytná pro vývoj buněk přirozených zabíječů (NK) [25]. Kromě toho se FOXO podílí na podpoře bakteriální fagocytózy neutrofily [26]. Ačkoli u korýšů nejsou žádné specializované imunitní buňky, jako jsou NK buňky nebo neutrofily, hemocyty krevet mohou uplatňovat systémovou vrozenou imunitu proti patogenní bakteriální infekci prostřednictvím fagocytózy [27]. Není však jasné, zda se FOXO účastní patogenní fagocytózy hemocytů u krevet. Akvakultura krevet je jedním z nejrychleji rostoucích odvětví výroby živočišných bílkovin na světě a významně přispěla k uspokojení celosvětové zvýšené poptávky po živočišných bílkovinách. V současné době je celosvětová produkce krevet přibližně 4,88 milionů tun v hodnotě kolem 39 miliard USD [28]. Společný chov velkého počtu zvířat však vede ke značnému stresu zvířat, který usnadňuje patogeny, včetně bakterií a virů, množení a klinická onemocnění, což má za následek velké ekonomické ztráty pro průmysl [29]. Studie imunitních mechanismů krevet by mohly poskytnout nové strategie prevence a kontroly onemocnění [30]. V této studii jsme identifikovali FOXO v krevetách kuruma (Marsupenaeus japonicus). Po knockdown Foxo expresi a následné expozici Vibrio anguillarum jsme zjistili, že schopnost bakteriální clearance a míra přežití krevet se významně snížily. Další studie ukázala, že FOXO přímo nebo nepřímo podporuje expresi AMP a zvyšuje fagocytózu bakterií v krevetách. Byly analyzovány možné mechanismy účinku FOXO proti patogenní infekci u krevet.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Výsledek
FOXO je exprimováno v bazálních hladinách u neinfikovaných krevet a je upregulováno u krevet vystavených V. anguillarum
Ze sekvenování hemocytového transkriptomu M. japonicus jsme získali kompletní cDNA sekvenci Foxo (GenBank přístupové číslo: MW080526). Porovnání domén ukázalo, že předpokládaný protein FOXO má doménu Forkhead (FH), která je podobná Homosapiens FOXO včetně FOXO1, FOXO3, FOXO4 a FOXO6 a nese podobnou fosforylaci AKT (obr. S1A). Výsledky fylogenetické analýzy ukázaly, že FOXO byly rozděleny do dvou shluků zahrnujících FOXO obratlovců a bezobratlých a krevety FOXO byly shluky ve větvi bezobratlých ve fylogenetickém stromě (obr. S1B). Podobně jako u lidských FOXO [31] má krevetka FOXO místa modifikace fosforylace extracelulárně regulované kinázy (ERK) a místa modifikace acetylačního proteinu CREB Binding Protein (CBP), ale nemá žádná místa pro deacetylaci sir tuin 1 (SIRT1) a N-konec c-JUN místa fosforylace kinázy (JNK) (obr. S2). Polyklonální protilátky rozpoznávající krevety FOXO byly připraveny s použitím rekombinantní FH domény FOXO exprimované v Escherichia coli (obr. 1A). Analýza tkáňové distribuce FOXO na úrovni mRNA a proteinu odhalila, že byl exprimován ve všech testovaných tkáních (obr. 1B). Časový průběh exprese FOXO v hemocytech a střevech krevet vystavených V. anguillarum byl analyzován pomocí qPCR a western blottingu. Výsledky ukázaly, že FOXO byl upregulován v hemocytech a střevech na úrovni mRNA (obr. 1C a 1D) a na úrovni proteinu (obr. 1E a 1F). Tyto výsledky naznačují, že FOXO se podílí na reakci na infekci V. anguillarum a přiměly nás prozkoumat funkci FOXO v imunitě krevet.
FOXO se podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a střevní mikroflóry u zdravých krevet
Pro prozkoumání funkce FOXO v hemolymfě a homeostáze střevní mikroflóry u krevet byla provedena interference RNA a analyzována bakteriální zátěž. Výsledky ukázaly, že exprese Foxo významně poklesla u krevet Foxo-RNAi (obr. 2A a 2B). Mimocílové účinky Foxo RNAi byly také analyzovány detekcí exprese jiných genů rodiny Fox (včetně Foxk2 a Foxn3). Výsledky ukázaly, že knockdown Foxo nesnížil hladiny exprese Foxk2 nebo Foxn3 (obr. S3A–S3C). Pomocí Western blotting a fluorescenčních imunocytochemických testů jsme dále pozorovali subcelulární distribuci FOXO ve střevech a hemocytech krevet napadených bakteriemi po umlčení Foxo. Výsledky ukázaly, že ve srovnání se skupinou dsGfp se hladina FOXO v jádře významně snížila u krevet Foxo-RNAi, i když byly krevety infikovány V. anguillarum (obr. S3D–S4E'). Všechny výše uvedené výsledky naznačují, že náš test Foxo RNAi by mohl specificky umlčet Foxo v hemocytech a střevech (včetně cytoplazmy a jádra). Dále jsme analyzovali bakteriální zátěž v hemolymfě a střevech po sražení Foxo u krevet za normálních podmínek (bez bakteriální expozice). Výsledky ukázaly, že počet bakterií v hemolymfě a střevech významně vzrostl poté, co byla exprese Foxo úspěšně sražena (obr. 2C a 2D). Dále jsme analyzovali míru přežití krevet Foxo-RNAi bez bakteriální expozice a výsledky ukázaly, že míra přežití krevety Foxo-knockdown se významně snížila ve srovnání s kontrolou (obr. 2E). K dalšímu ověření těchto výsledků jsme analyzovali míru přežití krevet Foxo-RNAi léčených antibiotiky a výsledky ukázaly, že ve srovnání se skupinou dsGfp nebyla míra přežití bezmikrobních krevet významně snížena (obr. 2F). Všechny výsledky naznačují, že FOXO hraje roli v homeostáze in vivo mikrobioty (včetně hemolymfy a střevní mikroflóry) u krevet za normálních podmínek.
cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu
FOXO se podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a střevní mikroflóry podporou exprese Relish a Amp u zdravých krevet
Předchozí studie ukazují, že zdravé krevety obsahují nízký, ale stabilní počet bakterií v cirkulující hemolymfě a vysoké, i když konstantní množství bakterií v gastrointestinálním traktu a imunitní efektory, jako jsou antimikrobiální peptidy (AMP) regulované nukleárním faktorem kappa B (NF -κB) a reaktivní formy kyslíku (ROS) regulované duální oxidázovou (DUOX) dráhou hrají zásadní roli v homeostáze hemolymfy a střevní mikrobioty [32–34]. Abychom prozkoumali mechanismus zapojení FOXO do regulace hemolymfy a homeostázy střevní mikroflóry za normálních podmínek, nejprve jsme detekovali subcelulární distribuci FOXO v hemocytech a střevech za normálních podmínek. Výsledky ukázaly slabý signál FOXO v jádrech hemocytů krevet a střevních buňkách za normálních podmínek (obr. 3A a 3B), což naznačuje, že za normálních podmínek bylo in vivo aktivováno malé množství FOXO u krevet. Exprese AMP je regulována cestou IMD ve střevech Drosophila [35]. Proto jsme předpokládali, že transkripční faktor Relish může být cílovým genem FOXO. Zjistili jsme expresi mRNA Relish, transkripčního faktoru dráhy IMD, v hemocytech krevet a střevech po knockdownu Foxo. Výsledky ukázaly, že exprese Relish se významně snížila u krevet Foxo-knockdown (obr. 3C a 3D) a podobné výsledky byly získány na úrovni proteinu (obr. 3E a 3E'). Výsledky naznačují, že FOXO by mohlo podporovat expresi Relish a aktivovat dráhu IMD. Aby se potvrdilo, že FOXO se podílí na homeostáze hemo lymfy a gastrointestinálního traktu prostřednictvím IMD signalizace, byly získány bezmikrobní krevety (obr. 3F) a byla detekována aktivace RELISH a exprese AMP. Ve srovnání s kontrolou se množství FOXO a RELISH v jádrech střevních buněk a hemocytů významně snížilo (obr. 3G a 3H). Mezitím byla v zárodku testována exprese AMP, včetně Crustins (CrusI-2 až 5) a anti-lipopolysacharidových faktorů (Alf A1, B1, C1, D1 a E1), možná regulovaných FOXO a/nebo RELISH -bez krevet a výsledky ukázaly, že exprese CrusI-3, Alf-B1 a Alf-C1 se významně snížila v hemocytech a střevech krevet (obr. 3I a 3J). Vzhledem k tomu, že exprese Alf-B1 a Alf C1 byla regulována dráhou IMD [36], tyto výsledky naznačují, že FOXO se za normálních podmínek podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a gastrointestinálního traktu prostřednictvím dráhy IMD k podpoře exprese AMP.
Obr. 1. FOXO byla upregulována u krevet vystavených V. anguillarum. (A) Rekombinantní exprese FH domény FOXO v E. coli a western blotting pro detekci FOXO pomocí polyklonálních protilátek proti FOXO připravených na králících. Dráha 1, celkové proteiny E. coli s Foxo-pGEX4T-1. Dráha 2, celkové proteiny bakterií po indukci IPTG. Dráha 3, purifikovaný rekombinantní FOXO. Dráha 4, FOXO ve střevech neošetřených krevet byla detekována pomocí westernového přenosu. M, markery molekulové hmotnosti proteinů. (B) Distribuce Foxo v tkáních na úrovni mRNA (horní panel) a proteinu (spodní panel) byla detekována pomocí RT-PCR a western blotting, v daném pořadí. ACTB je zkratka -actin. (C, D) Vzorce exprese mRNA Foxo v hemocytech (C) a střevech (D) byly analyzovány pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (E, F) Vzory proteinové exprese FOXO v hemocytech (E) a střevech (F) byly detekovány westernovým přenosem. Výsledky statistické analýzy tří replikátů byly ukázány ve spodních panelech. Pásy na Western blotu byly digitalizovány pomocí softwaru ImageJ skenováním pásů ze tří nezávislých opakování. Relativní úrovně exprese FOXO/-aktinu byly vyjádřeny jako průměr ± SD a hodnota kontrolních krevet byla nastavena jako jedna. Chybové úsečky na obrázku označují SD (tři replikáty).
FOXO je u krevet aktivováno výzvou V. anguillarum a podílí se na odstraňování patogenů z hemolymfy a střev
Uvádí se, že FOXO může být aktivován bakteriální nebo cytokinovou stimulací a je translokován do jádra, aby reguloval expresi určitých cílových genů u savců [17]. Aby se zjistilo, zda byl FOXO aktivován v krevetách napadených bakteriemi, byla pomocí western blottingu analyzována subcelulární distribuce FOXO ve střevech krevet. Výsledky ukázaly, že množství FOXO v cytoplazmě střevních buněk postupně klesalo od 2 do 4 hodin po čelenži V. anguillarum (obr. 4A). Naproti tomu množství FOXO v jádře střevních buněk se významně zvýšilo po infekci V. anguillarum (obr. 4B). K analýze role FOXO v systémové imunitě byl použit fluorescenční imunocytochemický test k pozorování jaderné translokace FOXO v hemocytech krevet 2 hodiny po V. roční stimulaci larum. Zjistili jsme, že translokace FOXO do jádra vyvolaná bakteriální výzvou se významně zvýšila, ale u krevet infikovaných PBS nedošlo k žádné zjevné změně (obr. 4C a 4C'). Abychom prozkoumali, zda se nukleární translokovaný FOXO podílí na odstraňování patogenů, analyzovali jsme bakteriální zátěž v hemolymfě a střevech u krevet Foxo-knockdown 6 hodin po bakteriální expozici. Zjistili jsme, že po knockdownu Foxo se zátěž bakterií v hemolymfě a střevech významně zvýšila ve srovnání s kontrolními skupinami (obr. 4D). Kromě toho se míra přežití krevet Foxo-knockdown infikovaných V. anguillarum významně snížila ve srovnání s kontrolou (obr. 4E). Tyto výsledky ukázaly, že FOXO byl aktivován v enterálních buňkách a hemocytech, a naznačovaly, že FOXO se účastní lokálních a systémových imunitních reakcí proti bakteriální infekci.
Obr. 2. FOXO se účastní střevních (lokálních) a systémových antibakteriálních imunitních odpovědí. (A, B) Účinnost Foxo-RNAi v hemocytech (A) a střevech (B) krevet, jak bylo stanoveno pomocí qPCR (A) a western blotting (B). Analýza data qPCR pomocí geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. Chybové úsečky zobrazují SD. (C) Detekce hemolymfických bakterií krevetek Foxo-knockdown pomocí pevné LB kultury (tři opakování); Jako kontrola byla použita injekce dsGfp. Poměr ředění byl 1:10. (D). Počet bakterií v hemolymfě a střevech u garnátů Foxo knockdown a dsGfp-injekce krevet bez bakteriální výzvy. (E). Míra přežití krevet Foxo-RNAi bez bakteriální expozice. Jako kontrola byla použita injekce dsGfp. (F). Míra přežití krevet Foxo-RNAi léčených antibiotiky. Jako kontrola byla použita injekce dsGfp. Normální: krevety divokého typu, které nejsou léčeny antibiotiky.
Obr. 3. Bazální množství FOXO se translokuje do jader hemocytů a střevních buněk podporuje expresi Relish a následně aktivuje dráhu IMD k regulaci homeostázy hemolymfy a střevní mikrobioty za normálních podmínek. (A) Imunocytochemie byla použita k detekci subcelulární distribuce FOXO v hemocytech normálních krevet. Měřítko=20 μm. Cy: cytoplazma; Nu: Jádro. (B) Western blotting byl použit k detekci subcelulární distribuce FOXO ve střevních buňkách z normálních krevet a krevet infikovaných V. anguillarum. (C) Exprese Relish na úrovni mRNA byla detekována v hemocytech krevet po knockdownu Foxo pomocí qPCR pomocí geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (D) Exprese Relish na úrovni mRNA ve střevech krevet po knockdownu Foxo byla detekována pomocí qPCR pomocí geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (E) Hladina RELISH byla detekována pomocí westernového přenosu u krevet po sražení Foxa. (E') Tři replikáty panelu E byly digitalizovány pomocí softwaru ImageJ. (F) Bakteriální zátěž hemolymfy a střev u krevet 24 hodin po léčbě antibiotiky. (G) FOXO v jádře bylo detekováno pomocí western blottingu v hemocytech a střevech krevet 24 hodin po léčbě antibiotiky. (H) RELISH v jádře byla detekována pomocí western blottingu v hemocytech krevet a ve střevech 24 hodin po léčbě antibiotiky. (I, J) Exprese Amps v hemocytech (I) a střevech (J) bezmikrobních krevet byla stanovena pomocí qPCR s použitím -actinu a Ef-1 jako vnitřních referenčních genů. Jako kontrola byly použity normální krevety (injekce H2O).
Předchozí studie ukázaly, že transkripční aktivita FOXO je regulována fosforylační modifikací a že serin/threonin kináza AKT reguluje aktivitu Forkhead transkripčních faktorů jejich fosforylací a inhibicí jejich nejasné translokace [9,37]. Abychom prozkoumali, zda je zvýšení FOXO v jádře po infekci patogenními bakteriemi ovlivněno AKT, nejprve jsme detekovali obsah FOXO v cytoplazmě a jádře westernovým přenosem po knockdownu Akt krevet. Výsledky ukázaly, že množství FOXO v jádře hemocytů a střevních buňkách se významně zvýšilo po snížení exprese Akt (obr. 5A a 5B) u krevet 2 hodiny po infekci V. anguillarum (obr. 5C a 5C'). K ověření experimentálních výsledků jsme také použili imunocytochemický test k pozorování subcelulární distribuce FOXO v hemocytech krevet po knockdownu Akt. Výsledky ukázaly, že FOXO bylo významně zvýšeno v jádře hemocytů, když Akt srazil 2 hodiny po infekci V. anguillarum (obr. 5D a 5D'). Abychom prozkoumali, zda infekce patogenem ovlivňuje aktivitu AKT, detekovali jsme změnu fosforylace AKT po infekci patogenem pomocí lidské protilátky p-AKT (Ser473) (místo fosforylace krevet AKT je Ser486) a zjistili jsme, že hladina fosforylovaného AKT se významně snížila v hemocyty a střeva krevet po 30 minutách infekce V. anguillarum (obr. 5E a 5F). Tyto výsledky naznačují, že infekce patogenem může snížit hladinu fosforylovaného AKT, který inhibuje aktivitu enzymu a snižuje schopnost AKT fosforylovat FOXO. Nefosforylované FOXO vstupuje do jádra a indukuje expresi svých cílových genů. obrázek označuje SD.
extrakt z cistanche
Patogenní infekce snižuje aktivitu AKT a indukuje jadernou translokaci FOXO
FOXO uplatňuje imunitní obranu proti napadajícím bakteriím regulací exprese antimikrobiálních peptidů v krevetách infikovaných bakteriemi
Abychom prozkoumali mechanismus, kterým FOXO ovlivňuje reakci na bakteriální infekci u krevet, nejprve jsme identifikovali imunitní efektorové geny regulované FOXO. Po úspěšném poražení Foxo v hemocytech a střevech krevet s nebo bez V. anguillarum nebo bez, se hladiny exprese CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 a Alf-E1 významně snížily u umlčených krevet ve srovnání s těmi v kontrolní skupině (obr. 6A a 6B). Pro další ověření výsledků jsme také detekovali expresi čtyř AMP po knockdown Akt. Výsledky ukázaly, že exprese čtyř AMP se významně zvýšila 6 hodin po infekci V. anguil larum ve srovnání s expresí v kontrolní skupině (obr. 6C a 6D). Ve srovnání s upregulovanými AMP (včetně Alf-B1 a Alf-C1) za normálních podmínek (obr. 3I a 3J) byl další gen AMP (CrusI-3, Alf-E1) upregulován také u krevet infikovaných V anguillarum (obr. 6A a 6B). Naše předchozí studie ukázala, že RELISH podporuje expresi Alf-B1 a Alf-C1 v krevetách [36]. Tyto výsledky naznačují, že FOXO může přímo regulovat expresi AMP, jako je CrusI-3 a Alf-E1, nezávisle na cestě signální dráhy IMD. Pro potvrzení hypotézy byl proveden test ChIP, aby se zjistilo, zda se FOXO může vázat na promotor Alf-E1. Byla získána promotorová sekvence Alf-E1 (obr. S4) a byla předpovězena vazebná místa FOXO (obr. 6E). Výsledek ChIP ukázal, že FOXO se může vázat na promotor Alf-E1 (obr. 6F). Tyto výsledky naznačují, že FOXO se také podílí na antibakteriální imunitě přímou regulací exprese AMP v krevetách.
Obr. 4. FOXO translokované do jádra u krevet vystavených V. anguillarum. (A, B) Distribuční vzorce FOXO v cytoplazmě (A) a jádře (B) střevních buněk krevet napadených bakteriemi, jak byly analyzovány pomocí western blottingu (spodní panely A a B). Pásy westernového přenosu byly digitalizovány pomocí softwaru ImageJ skenováním pásů ze tří opakování. Relativní úrovně exprese FOXO/-aktinu nebo FOXO/Histonu 3 byly vyjádřeny jako průměr ± SD a hodnota kontrolní krevety byla nastavena jako jedna. (C) Nukleární translokace FOXO v hemocytech krevet 2 hodiny po V. anguillarum provokace byla detekována pomocí fluorescenčních imunocytochemických testů. Injekce PBS byla použita jako kontrola. Měřítko=20 μm. (C') Statistická analýza panelu C Kolokalizace FOXO a DAPI obarvených jader v hemocytech byla analyzována softwarem WCIF ImageJ. (D) Počet bakterií v hemolymfě a střevech krevet Foxo-knockdown po injekci V. anguillarum; Jako kontrola byla použita injekce dsGfp do krevet po bakteriální injekci. (E) Míra přežití krevet Foxo-RNAi infikovaných V. anguillarum. Jako kontrola byla použita injekce dsGfp.
FOXO podporuje fagocytózu hemocytů proti bakteriím podporou exprese SRC
Předchozí studie uvádějí, že FOXO interaguje přímo s promotorovými oblastmi CXCR2 a CD11b za účelem regulace fagocytózy neutrofilů u savců [26]. Abychom otestovali, zda je FOXO spojeno s fagocytózou hemocytů v antibakteriální imunitě krevet, zkoumali jsme míru fagocytů po interferenci s Foxo pomocí různých metod. Po knockdown Foxo byly fagocytární rychlost a fagocytární index u Foxo-knockdown skupiny významně nižší než u kontrolní skupiny (dsGfp) (obr. 7A a 7A'). Také jsme použili průtokovou cytometrii ke kvantifikaci fagocytární rychlosti hemocytů po umlčení Foxo. Výsledky ukázaly, že rychlost fágové cytózy u skupiny Foxo-RNAi se také významně snížila ve srovnání s rychlostí u skupiny dsGfp (obr. 7B a 7B'). Pro další ověření těchto výsledků jsme také zkoumali fagocytární rychlost po knockdown Akt. Výsledky ukázaly, že ve srovnání s výsledky kontrolní skupiny se významně zvýšila fagocytární rychlost a fagocytární index (obr. 7C a 7C'). Tyto výsledky naznačují, že FOXO podporuje fagocytózu hemocytů u krevet. Abychom prozkoumali, jak FOXO zvyšuje hemocytovou fagocytózu u krevet, detekovali jsme expresi dříve hlášených genů zapojených do fagocytózy krevet. Uvádí se, že scavenger receptor třídy B (SRB) a třídy C (SRC) se účastní fagocytózy hemocytů [38,39]. Zjistili jsme, že hladina exprese mRNA Src, spíše než Srb, se významně snížila po umlčení Foxo v hemocytech a střevech (obr. 7D a 7E), zatímco exprese Src se významně zvýšila po knockdownu Akt u krevet (obr. 7F). Podobné výsledky byly získány na úrovni proteinu (obr. 7G a 7G'). Tyto výsledky naznačují, že FOXO podporuje hemocytovou fagocytózu patogenů v krevetách podporou exprese SRC.
FOXO podporuje expresi RAB5 a RAB7 během fagocytózy u krevet
Předchozí studie ukázaly, že malé GTPázy, RAB5 a RAB7, jsou klíčovými regulátory transportu nově endocytovaných vezikul do časných a pozdních endozomů [40]. RAB5 je klíčovým regulátorem počátečních fúzních událostí a je markerem časných endozomů [41,42]. RAB7 je potřebný pro pozdní fúzi fagozom-lysozom a je markerem pozdních endozomů [43]. Abychom prozkoumali, zda se RAB5 a RAB7 podílejí na odstraňování patogenů u krevet, nejprve jsme analyzovali expresní vzorce Rab5 a Rab7 a zjistili jsme, že dvě malé GTPázy byly upregulovány u krevet vystavených bakteriím (obr. S5A–S5D). Dále jsme analyzovali míru přežití Rab5-RNAi a Rab{16}}RNAi krevet po bakteriální expozici a výsledky ukázaly, že míra přežití Rab5 a Rab7 knockdown krevet se významně snížila ve srovnání s kontrolou ( S5E a S5F Obr). Tyto výsledky naznačují, že RAB5 a RAB7 hrají důležitou funkci v odolnosti proti bakteriálním patogenům. Abychom prozkoumali, zda se RAB5 a RAB7 podílejí na fagocytóze zprostředkované FOXO, zkoumali jsme hladiny exprese mRNA Rab5 a Rab7 po interferenci s expresí Foxo u krevet. Výsledky ukázaly, že hladiny exprese Rab5 a Rab7 významně poklesly v hemocytech a střevech (obr. 8A a S6A). zatímco exprese Rab5 a Rab7 se významně zvýšila po knockdownu Akt u krevet (obr. 8B). K dalšímu potvrzení výše uvedených výsledků byly také detekovány hladiny proteinů RAB5 a RAB7 v krevetách Foxo nebo Akt knockdown. Ve srovnání se skupinou s injekcí dsGfp se hladiny RAB5 a RAB7 také významně snížily v hemocytech a střevech u krevet Foxo-knockdown, ale významně se zvýšily u krevet s knockdownem Akt 2 hodiny po stimulaci V. anguillarum (obr. 8C–8D'; S6B a S6B'). Tyto výsledky naznačují, že RAB5 a RAB7 se účastní FOXO-zprostředkované fágové cytózy hemocytů u krevet. Dále jsme detekovali, že RAB5 a RAB7 byly spolulokalizovány s V. anguillarum v hemocytech krevet (obr. 9). Celkově vzato výsledky naznačují, že RAB5 a RAB7 se podílejí na fagocytóze zprostředkované FOXO u krevet.
Obr. 5. Patogenní infekce snížila aktivitu AKT, což podporovalo jadernou translokaci FOXO v hemocytech a enterálních buňkách krevet. (A, B) Účinnost Akt-RNAi v hemocytech a střevech krevet, jak byla stanovena pomocí qPCR pomocí geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů (A) a western blotting (B). (C) Množství FOXO v cytoplazmě a jádru střev z Akt-knockdown krevet bylo analyzováno westernovým přenosem. Jako kontrola byl použit dsGfp. (C') Statistická analýza panelu (C). Software ImageJ byl použit k digitalizaci pásem skenováním tří opakujících se obrázků. (D) Nukleární translokace FOXO v hemocytech Akt-knockdown krevet byla detekována 2 hodiny po čelenži V. anguillarum pomocí fluorescenčního imunocytochemického testu. Jako kontrola byl použit dsGfp. Měřítko=20 μm. (D') Statistická analýza (D). Software WCIF ImageJ byl použit k analýze společné lokalizace poměrem intenzity fluorescence anti-FOXO (zelená) a DAPI obarveného jádra (modrá) v hemocytech po fixaci hodnoty expozice. (E, F) Změna obsahu fosforylovaného AKT (p-AKT) v hemocytech (E) a střevech (F) krevet napadených V. anguillarum. Spodní panely jsou digitalizovaná čísla (E) a (F) na základě pásem western blottingu a statistické analýzy.
Čaj Cistanche
Diskuse
FOXO se jako velmi důležitý transkripční faktor podílí na mnoha fyziologických a metabolických funkcích [44,45]. V této studii jsme identifikovali FOXO z krevet (M. japonicus) a zjistili jsme, že se podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a střevní mikroflóry regulací exprese AMP za normálních podmínek. FOXO může být aktivován bakteriální infekcí v krevetách a translokován do jádra, kde reguluje přímo a nepřímo (cestou IMD) expresi AMP. FOXO upreguloval expresi genů souvisejících s fagocytózou, jako jsou SRC a malé GTPázy, RAB5 a RAB7, aby podpořil fagocytózu hemocytů proti patogenům. Krevety FOXO proto hrají různé role v systémových a lokálních (enterických) imunitních odpovědích proti patogenům (obr. 10). Ve srovnání s lidskými FOXO má kreveta FOXO relativně konzervovanou aminokyselinovou sekvenci a fosforylační místa AKT; avšak druhým místem fosforylace AKT krevet FOXO je threonin místo serinu. AKT fosforylace FOXO řídí nukleární a cytoplazmatický transport FOXO [9]. V této studii jsme zjistili, že AKT souvisí s kontrolou vstupu FOXO do jádra. Po infekci V. anguillarum byla hladina fosforylovaného AKT významně snížena, což naznačovalo, že aktivita AKT byla snížena u krevet infikovaných patogenem, čímž se zvýšila jaderná retence nebo jaderná translokace FOXO a následně indukovala expresi cílových genů, jako Relish a Amp, aby odolávaly patogenní infekci. Předchozí studie zjistily, že FOXO se podílí na homeostáze střevní mikroflóry Drosophila tím, že potlačuje expresi peptidoglykanového rozpoznávacího proteinu SC2 (negativní regulátor dráhy IMD), aby aktivoval dráhu pro expresi AMP [14]. RELISH byl popsán jako klíčový cílový gen FOXO při kontrole tolerance k hypoxii u Drosophila [46]. Stejně jako ostatní zvířata obsahuje gastrointestinální trakt krevet relativně vysokou a konstantní mikroflóru. Stále více důkazů také ukazuje, že hemolymfa některých zdravých vodních bezobratlých, včetně krevet, také ukrývá stabilní množství bakterií [47]. Naše předchozí studie zjistila, že lektin typu C se podílí na regulaci homeostázy mikrobioty hemolymfy udržováním exprese AMP [34], ale nevíme, jaké signální dráhy se účastní regulace exprese AMP. Zde naše výsledky naznačují, že FOXO se za normálních podmínek podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a enterické mikroflóry prostřednictvím signalizace IMD. U neinfikovaných krevet vedlo vyřazení Foxo k významně snížené expresi Relish a míra přežití krevet se významně snížila, a to i bez bakteriální infekce. Také jsme našli malé množství FOXO v jádře normálních krevetových buněk. Proto si myslíme, že FOXO se za normálních podmínek podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a střevní flóry podporou exprese Relish a poté zvýšením exprese AMP cestou IMD. Tyto výsledky naznačují, že FOXO se podílí na lokální a systémové imunitě k podpoře homeostázy mikrobioty hemolymfy a gastrointestinálního traktu u krevet. Humorální imunita hraje kritickou roli v odolnosti vůči patogenní infekci v opačném poměru prostřednictvím produkce řady AMP [21,48]. Humorální odpověď zahrnuje indukovatelnou syntézu a sekreci AMP, které se uvolňují do hemolymfy jako systémová odpověď nebo se uvolňují na epidermální povrch nebo do dutiny gastrointestinálního traktu jako lokální odpověď [19]. Exprese AMP je u ovocných mušek regulována hlavně signálními cestami Toll/Dif a IMD/Relish [49]. V současné době bylo v krevetách identifikováno několik rodin AMP, včetně crustinů, anti-lipopolysacharidových faktorů (Alfs) a penaeidinů [50]. Tato studie ukázala, že FOXO může přímo nebo nepřímo (prostřednictvím signalizace IMD/Relish) regulovat expresi AMP, včetně CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 a Alf-E1. Domnívali jsme se, že nízká aktivace FOXO v hemocytech a střevech krevet za normálních podmínek by mohla regulovat klíčový cílový gen Foxo, tj. Relish, k udržení homeostázy in vivo mikrobioty. Během infekce invazní patogeny aktivují FOXO, z nichž většina je translokována do jádra, kde kromě Relish reguluje více cílových genů, včetně některých AMP, jako jsou Alf-E1 a CrusI-3. Celkově vzato se FOXO podílí na regulaci homeostázy hemolymfy a střevní mikrobioty u zdravých krevet prostřednictvím aktivace IMD signalizace na bazální úrovni v hemolymfě a gastrointestinálním traktu. Patogenní infekce aktivuje FOXO snížením aktivity AKT a podporuje expresi AMP přímo i nepřímo v systémové imunitě a lokální (střevní) imunitě. Fagocytóza je jev zprostředkovaný receptory, závislý na aktinu a ATP, který je spouštěn vazbou částic nebo patogenů na specifické cytomembránové receptory a představuje důležitý imunitní proces, jehož prostřednictvím se hostitel může chránit před patogeny [24]. Malé GTPázy, jako je RAB5 a RAB7, se podílejí na pokračující membránové remodelaci a provozu vezikul při fagocytóze. Naše předchozí studie uvedla, že scavenger receptory SRB a SRC se podílejí na fagocytóze hemocytů jako receptory u krevet [38,39]. V této studii jsme zjistili, že po knockdownu Foxo se exprese Src výrazně snížila a rychlost fagocytózy hemocytů se významně snížila, což naznačuje, že Src je cílovým genem FOXO a že FOXO se podílí na fagocytóze patogenních bakterií zprostředkované SRC. FOXO by také mohlo podporovat expresi dvou malých GTPáz, RAB5 a RAB7. Tyto malé GTPázy se účastní sekvenčního transportu a jsou klíčovými determinanty časných a pozdních fagozomů [51]. Fagozomy migrují z periferie buňky do intracelulární oblasti, přičemž RAB5 je během transportu nahrazen RAB7 a konečné zboží je transportováno do lysozomu k degradaci [52,53]. Zjistili jsme také, že RAB5 a RAB7 se mohou společně lokalizovat s patogeny v hemocytech, což naznačuje, že patogeny byly fagocytovány hemocyty v krevetách průchodem přes časné a pozdní fagozomy, než byly nakonec degradovány v lysozomech. Proto se FOXO podílí na buněčné imunitní odpovědi podporou fagocytózy hemocytů. Závěrem lze říci, že naše výsledky naznačují, že FOXO se nejen podílí na regulaci homeostázy mikrobioty za normálních podmínek, ale také na odstraňování patogenních bakterií v infikovaných krevetách podporou exprese AMP a fagocytózy hemocytů.
Obr. 6. FOXO plní svou antibakteriální roli u krevet regulací exprese AMP. (A, B) Exprese Amps v hemocytech (A) a střevech (B) krevet Foxo-knockdown, jak bylo stanoveno pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů; Injekce dsGfp v krevetách byla použita jako kontrola. Data byla analyzována statisticky pomocí Mann-Whitenyho U testu. (C, D) Exprese Amps v hemocytech (C) a střevech (D) Akt knockdown krevet byla analyzována pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů; Injekce dsGfp v krevetách byla použita jako kontrola. Významné rozdíly byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA. (E) Schematický diagram předpokládaných vazebných míst FOXO na promotoru Alf-E1. (F) ChIP a RT-PCR byly použity k detekci vazby FOXO na sekvenci promotoru Alf-E1 pomocí primerů (Alf-E1-F a Alf-E1-R, tabulka 1). RT-PCR byla také použita k amplifikaci kódující oblasti Alf-E1 s RT-PCR primery (Alf-E1-RT-F a Alf-E1-RT-R. Tabulka 1) pomocí ChIP získal DNA jako templát. IgG protilátka byla použita jako kontrola a pro potvrzení cílového pásu byl použit amplifikovaný fragment normální genomové DNA.
Obr. 7. FOXO zvyšuje hemocytovou fagocytózu patogenů v krevetách podporou exprese SRC. (A) Fagocytóza hemocytů V. anguillarum pozorovaná pomocí fluorescenčního imunocytochemického testu pod fluorescenčním mikroskopem. V. anguillarum byla označena FITC (zelená) a buněčná jádra byla obarvena DAPI (modrá). Červená šipka označuje fagocytární hemocyty. Měřítko=20 μm. (A') Statistická analýza fagocytární rychlosti a fagocytárního indexu u garnátů Foxo-knockdown. Jako kontrola byla použita skupina s injekcí dsGfp. V každém experimentu bylo pod fluorescenčním mikroskopem spočítáno pět set hemocytů. Data byla analyzována statisticky pomocí Studentova t-testu. (B) Bakteriální fagocytóza hemocyty analyzovaná pomocí průtokové cytometrie. Fagocytované hemocyty obsahující bakterie (R2) byly odděleny od nefagocytovaných hemocytů (R3) na základě fluorescenčního signálu značených bakterií v hemocytech pomocí softwaru IDEAS Application v6.0. (B') Fagocytární rychlost hemocytů na základě dat průtokové cytometrie. Pro každou analýzu bylo spočítáno tři tisíce hemocytů a byla provedena tři opakování. Jako kontrola byla použita skupina dsGfp. (C) Hemocytární fagocytóza V. anguillarum u Akt knockdown krevet pozorována pod fluorescenčním mikroskopem. Měřítko=10 μm. (C') Statistická analýza fagocytární rychlosti a fagocytárního indexu na základě dat v panelu (C). (D) Úroveň exprese mRNA Srb a Src v hemocytech z Foxo knockdown krevet analyzovaná pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. Jako kontrola byla použita injekce dsGfp. (E) Exprese mRNA Srb a Src ve střevech krevet Foxo-RNAi analyzovaná pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (F) Exprese mRNA Src v hemocytech krevet Akt-RNAi analyzovaná pomocí qPCR s použitím geometrického průměru exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (G) Hladina proteinu SRC v hemocytech krevet Foxo-RNAi nebo Akt-RNAi, jak byla analyzována pomocí western blottingu. Injekce dsGfp použitá jako kontrola. (G') Statistická analýza založená na datech tří replikací panelu (G).
Materiály a metody
Etické prohlášení
Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s čínskými národními směrnicemi (GB 14922.2–2011 a GB 14925–2010). Pokusy na králících pro přípravu protilátek ve studii byly prováděny v souladu s protokoly schválenými Výborem pro péči o zvířata a welfare na Shandong University School of Life Sciences (SYDWLL-2021-54). Schválení podle předpisů o používání krevet v naší studii nebylo nutné, protože náš výzkum používal omezený počet běžných krevet často konzumovaných širší komunitou.
Zvířata
Zdravé krevety (Marsupenaeus japonicus), každá o hmotnosti asi 6–10 g, byly získány z trhu s produkty pro vodní organismy v Qingdao, provincie Shandong, Čína. Před experimentem byly krevety kultivovány po dobu alespoň 1 dne v systému pro kultivaci krevet s provzdušněnou mořskou vodou při 23–25 °C, aby se aklimatizovaly na nové prostředí.
Obr. 8. RAB5 a RAB7 se účastní FOXO-zprostředkované fagocytózy hemocytů u krevet. (A, B) qPCR byla použita k analýze úrovní exprese mRNA Rab5 a Rab7 v hemocytech Foxo-knockdown shrimp (A) a Akt-knockdown shrimp (B) s a bez bakteriální infekce. qPCR použila geometrický průměr exprese -aktinu a Ef-1 jako endogenních kontrolních genů. (C) Hladiny proteinu RAB5 a RAB7 v hemocytech krevet Foxo-knockdown 2 hodiny po čelenži V. anguillarum byly stanoveny pomocí western blottingu. (C') Statistická analýza založená na datech tří opakování panelu (C). (D) Hladiny proteinu RAB5 a RAB7 v hemocytech krevet s knockdownem Akt 2 hodiny po čelenži V. anguillarum byly stanoveny pomocí western blotu. (D') Statistická analýza založená na datech tří replikací panelu (D).
Bioinformatická analýza
Kompletní cDNA sekvence Foxo byla získána ze sekvenování hemocytů a intestinálních transkripčních tomémů M. japonicus (BGI, Shenzhen, Čína). Otevřený čtecí rámec (ORF) Foxo byl amplifikován pomocí páru primerů (Foxo-EX-F a Foxo-EX-R; tabulka 1) pro potvrzení sekvence. Odpovídající cDNA byla koncepčně přeložena, aby se získala odvozená proteinová sekvence pomocí nástroje ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). Analýza podobnosti byla provedena pomocí BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) a predikce architektury domény byla provedena pomocí SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Fylogenetický strom FOXO z různých druhů byl zkonstruován pomocí programu MEGA 6.0 [54].
Obr. 9. RAB5 a RAB7 se společně lokalizují s V. anguillarum. Společná lokalizace RAB5 a RAB7 s FITC označeným-V. anguillarum v hemocytech krevet, jak bylo analyzováno pomocí fluorescenčního imunocytochemického testu. Bakterie byly označeny FITC (zelená) a injikovány do krevet. Hemocyty byly odebrány z pěti krevet 30 minut a 1 h po bakteriální injekci a inkubovány s protilátkami anti-RAB5 nebo anti RAB7. Sekundární protilátkou byla antikráličí IgG Alexa-546 (červená). Jádra byla obarvena DAPI (modrá). Společná lokalizace v hemocytech je označena bílými šipkami. Měřítko=10 μm.
Obr. 10. Schematické znázornění zapojení FOXO do lokální a systémové vrozené imunity u krevet. (A) V neinfikovaných podmínkách FOXO udržuje homeostázu hemolymfy a střevní mikrobioty podporou exprese Relish a následně AMP. (B) V infikovaných podmínkách je fosforylace AKT snížena infekcí patogenem, což vede ke zvýšení obsahu FOXO v jádře. FOXO přímo podporuje expresi Relish a AMP k eliminaci invazivních patogenů; na druhé straně FOXO podporuje fagocytózu patogenů cestou fagocytózy zprostředkované SRC.
Bakteriální provokace a odběr vzorků
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) získané z Marine College, Shandong University (Wei hai, Čína) a nyní konzervované v naší laboratoři. V. anguillarum byla kultivována přes noc při 37 °C v LB médiu a znovu kultivována po dobu 4 hodin při inokulaci 1:100 druhého dne. Bakterie v logaritmické růstové fázi byly shromážděny centrifugací při 5000 x g po dobu 5 minut při teplotě 4 °C a dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS: 10 mM Na2HP04, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl a 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). V. anguillarum resuspendovaný ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku pro provokaci krevet. Přibližně 2 x 107 jednotek tvořících kolonie (CFU) / krevety byly injikovány do břicha každé krevety pomocí mikrostříkačky. Kontrolní skupině byl injikován stejný objem PBS. Hemocyty, srdce, hepatopankreas, žábry, žaludek a střeva byly odebrány od alespoň tří krevet pro extrakci RNA a proteinu. Pro odběr hemocytů byla hemolymfa extrahována z ventrálního sinu pomocí injekční stříkačky předem naplněné 0,8 ml antikoagulačního pufru (10% citrát sodný) a poté rychle centrifugována při 700 x g po dobu 8 minut při 4 °C pro izolaci hemocytů.
Extrakce RNA a proteinů a syntéza cDNA
Celková RNA byla extrahována z hemocytů a různých orgánů krevet pomocí TRIzol (ET101, Transgen, Peking, Čína). Proteiny z různých orgánů byly extrahovány pomocí radioimunoprecipitačního testu (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Čína). Syntéza prvního vlákna cDNA byla provedena pomocí cDNA Synthesis Kit (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), podle instrukcí výrobce.
Tabulka 1. Sekvence primerů použitých v této studii.
MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), podle pokynů výrobce.
Rekombinantní exprese a příprava protilátek
cDNA sekvence Foxo byla amplifikována reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR) s použitím primerů Foxo-EX-F a Foxo-EX-R (tabulka 1). Purifikované produkty PCR byly poté štěpeny pomocí restrikčních enzymů a ligovány do plazmidu pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). a zkonstruované plazmidy byly transformovány do buněk Escher ichia coli Rosseta (DE3). Exprese proteinu byla indukována pomocí 1 mM isopropyl- -D-thiogalaktopyranosidu při 37 °C. Rekombinantní proteiny byly podrobeny afinitní chromatografii s použitím glutathionové (GST) pryskyřice (C600031, BBI, Shanghai, Čína), podle instrukcí výrobce. Králičí antiséra proti FOXO byla připravena podle dříve popsané metody [55].
Západní blotting
Proteiny extrahované z různých orgánů nebo hemocytů byly separovány pomocí 10% dodecylsulfátu sodného polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE). Proteiny v gelech SDS-PAGE byly přeneseny na membránu z nitrátu celulózy pomocí přenosového pufru (25 mM Tris-HCl, 20 mM glycin, 0,037 % mM SDS a 20 % ethanol) a inkubovány v 5% odstředěném mléce nebo 3% bovinním sérovém albuminu (BSA) v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) po dobu 1 hodiny za mírného třepání při teplotě místnosti. Membrány byly poté inkubovány s primárním antisérem: Anti-FOXO v ředění 1:100, anti-RAB5 v 1:25, anti Rab7 v 1:25, anti-beta aktin (ACTB) v 1:250 (připraveno v naší laboratoři ); Histone-3 polyklonální protilátky (A2348, ABClonal, Wuhan, Čína, 1:2500); anti-fosforylované (p)-AKT polyklonální protilátky (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Čína, 1:500) a jemně protřepávejte přes noc při 4 °C. Po trojím promytí TBST (0,1 % Tween-20 přidané k TBS) byly membrány inkubovány se sekundární protilátkou (ZB2308 ZSGB-Bio, Peking, Čína, 1:5,000) nebo ( ZB2301 ZSGB-Bio, Peking, Čína, 1:5,000) po dobu 3 hodin při pokojové teplotě za mírného protřepávání. Imunoreaktivní proteinové pásy byly vyvinuty za použití roztoku chloridu nitrotetrazoliové modři (A610379, BBI) a soli P-toluidinu (A610072, BBI) za tmavých podmínek nebo za použití zesílené chemiluminiscence (ECL). -actin nebo Histone{57}} byly použity jako references.
Distribuce tkání a vzorce exprese u krevet napadených bakteriemi
Tkáňová distribuce Foxo/FOXO v hemocytech, srdci, žábrách, sputu, žaludku a střevech byla analyzována pomocí RT-PCR s primery Foxo-F a Foxo-R (tabulka 1) a westernovým přenosem s anti-FOXO protilátkami, respektive. Postup PCR sestával z počáteční inkubace při 94 °C po dobu 3 minut; následuje 35 cyklů 94 °C po dobu 30 s, 50 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 30 s; poté 72 °C po dobu 10 minut. Produkty PCR byly analyzovány elektroforézou na agarózovém gelu (1,5% agaróza). Gen pro -aktin (-aktin-F a -aktin-R; tabulka 1) byl použit jako vnitřní kontrola. Časový průběh exprese Foxo/FOXO na úrovni RNA a proteinu u krevet exponovaných V. anguillarum byl analyzován pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) v termálním cykléru (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Německo) a pomocí west ern blotting, resp. Postup qPCR zahrnoval: 95 °C po dobu 10 minut; 40 cyklů při 95 °C po dobu 10 s a 60 °C po dobu 50 s; a poté dobu tání od 65 °C do 95 °C. Expresní profily Foxo byly vytvořeny pomocí 2-metody ΔΔCT [56] s použitím geometrického průměru dvou vnitřních kontrolních genů -aktinu a Ef-1 pro normalizaci. Účinnost páru primerů v qPCR byla analyzována metodou MIQE [57] s 10-násobným logaritmickým ředěním směsi cDNA za účelem vytvoření lineární standardní křivky.
Izolace jaderných a cytoplazmatických proteinů
Tkáň střeva byla vyříznuta z krevet a třikrát promyta v PBS. Extrakce proteinu byla provedena pomocí soupravy pro extrakci jaderných a cytoplazmatických proteinů (R0050, Solarbio, Peking, Čína) podle pokynů výrobce. Pro eliminaci individuálních rozdílů byly pro extrakci bílkovin použity alespoň tři krevety.
Test RNA interference
Pro analýzu funkce genu jsme provedli testy RNA interference (RNAi). Několik párů primerů obsahujících promotorovou sekvenci T7 (Foxo-RI-F a Foxo-RI-R; Rab5-RI-F a Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F a Rab7 -RI-R; Akt-RI-F a Akt-RI-R. Tabulka 1) byly navrženy pro amplifikaci templátů pro syntézu dsRNA. Pomocí T7 RNA polymerázy (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a templátu cDNA jsme syntetizovali fragmenty dsRNA. Dvouvláknový zelený fluorescenční protein dsGfp RNA sloužil jako kontrola, která byla amplifikována pomocí Gfp-RI-F a Gfp-RI-R (tabulka 1) jako primerů pro syntézu dsGfp. Poté byly fragmenty dsRNA (50 ug/každý) injikovány do abdominálního segmentu M. japonicus pomocí mikrostříkačky a druhá injekce byla provedena o 12 hodin později za použití stejné dávky. Účinnost interference RNA byla analyzována pomocí kvantitativní reverzní transkripční PCR v reálném čase (qRT-PCR, zahrnující reverzní transkripci RNA za vzniku cDNA, která byla poté použita jako templát v testu qPCR) nebo western blotting 24 hodin po druhé injekci. -aktin byl použit jako vnitřní reference.
Reference
1. Calnan DR, Brunet A. Kód FoxO. Onkogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Dráha opravy DNA stimulovaná forkhead transkripčním faktorem FOXO3a prostřednictvím proteinu Gadd45. Věda. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Ať žije FOXO: Odhalení role proteinů FOXO při stárnutí a dlouhé těhotnosti. Stárnoucí buňka. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Třívrstvá kontrola-fosforylace, acetylace a ubikvitinace proteinů FOXO. Buněčný cyklus. 2005; 4(7):908-913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulace transkripčních faktorů FoxO acetylací a interakcemi protein-protein. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813 (11): 1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Transkripční faktory FOXO: jejich klinický význam a regulace. Biomed Res Int. 2014; 2014: 1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Geny, které působí po proudu od DAF-16 a ovlivňují délku života Caenorhabditis elegans. Příroda. 2003; 424(6946):277–284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Cesty inzulinu/IGF-1R, SIRT1 a FOXO – zajímavá interakční platforma pro kost a osteosarkom. Přední endokrinol (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS a kol. Akt podporuje přežití buněk fosforylací a inhibicí forkhead transkripčního faktoru. Buňka. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA a kol. Skp2 inhibuje FOX01 při supresi nádoru prostřednictvím degradace zprostředkované ubikvitinem. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649–1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA a kol. Transkripční faktor hlavy vidlice DAF-16 přenáší u C. elegans metabolické signály podobné inzulínu a signály dlouhověkosti. Příroda. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. K přežití orální infekce u Drosophila je nutná intestinální signalizace FoxO. Mucosal Immunol. 2016; 9(4):927-936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO reguluje interferenci RNA u Drosophila a chrání před infekcí RNA virem. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 podporuje střevní imunitní homeostázu k omezení běžné dysbiózy a prodloužení životnosti. Buňka. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P a kol. FOXO-dependentní regulace přirozené imunitní homeostázy. Příroda. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Transkripční faktory FOXO regulují vrozené imunitní mechanismy v respiračních epiteliálních buňkách. J Immunol. 2013; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Hroby DT, Milovanova TN. Slizniční imunita a transkripční faktory FOXO1. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Antimikrobiální peptidy: od bezobratlých k obratlovcům. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Imunita u Drosophila melanogaster — od mikrobiálního rozpoznávání k fyziologii celého organismu. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796-810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Vrozená imunita Drosophila: evoluční perspektiva. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Imunita Drosophila: cesty a vzorce. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Nedávné pokroky ve výzkumech vrozené imunity krevet v Číně. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Vazba coiled-coil domény lektinu typu C na Domeless receptor přímo aktivuje dráhu JAK/STAT v imunitní odpovědi krevet na bakteriální infekci. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagocytóza: imunobiologický proces. Imunita. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ a kol. Pro vývoj NK buněk a vrozenou imunitu je nutná autofagie zprostředkovaná FoxO1-. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J a kol. FOXO1 reguluje aktivitu neutrofilů vyvolanou bakteriemi. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lektin typu C se váže na beta-Integrin a podporuje hemocytární fagocytózu u bezobratlých. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Výuka krevet sebeobraně v boji proti infekcím. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Historický výskyt, dopad a současný stav patogenů krevet v Asii. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Antivirová obrana u krevet: Od vrozené imunity po virovou infekci. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilová V. Struktura/funkční vztahy podmiňující regulaci transkripčních faktorů FOXO. Onkogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.
