Fine Particulate Matter 2.5 upreguluje melanogenezi v buňkách lidského melanomu A375
Jul 19, 2023
Pro editora: Epidemiologické studie ukázaly, že expozice jemným částicím 2,5 (PM2,5) zvyšuje riziko hyperpigmentace kůže.[1] Nedávná studie prokázala, že PM2.5 může indukovat melanogenezi regulací exprese tyrosinázy (TYR) a exprese proteinu 1 a 2 (TYRP2) souvisejícího s tyrosinázou prostřednictvím aktivace signalizace arylhydrokarbonového receptoru (AhR)/mitogenem aktivované proteinkinázy.[ 2] AhR je rozšířený v kožních buňkách a jeho ligace řídí oxidaci/antioxidaci, funkci epidermální bariéry, fotoindukovanou reakci, vrozenou imunitu a melanogenezi. Může být aktivován dioxiny a polycyklickými aromatickými uhlovodíky (složky PM2.5) a jeho aktivace indukuje transkripci genů kódujících enzymy metabolismu xenobiotik fáze I i fáze II (cytochromy P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 a CYP1B1). [3,4] BaP a nebezpečné dioxiny aktivují AhR robustní tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS), která je alespoň částečně zprostředkována CYP1A1. Kromě toho je oxidační stres zprostředkovaný CYP1A{30}}odpovědný za produkci prozánětlivých cytokinů, jako je interleukin (IL)-1, IL-6 a IL-8 v prostředí lidské keratinocyty ošetřené kontaminanty.[3,5] Existuje však velmi málo studií o toxických účincích PM2,5 na melanogenetické buňky. Zde jsme ošetřili lidské melanomové buňky A375 různými koncentracemi PM2.5, abychom zjistili, zda PM2.5 může podporovat melanogenezi a její vztah se signalizací AhR, oxidačním stresem a zánětlivou reakcí.
Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.
Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa
【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】
PM2,5 byly shromážděny během zimy (od prosince do ledna) v Pekingu. HY-1000 inteligentní velkoprůtokový vzorkovač celkových suspendovaných částic (TSP) (volitelný řezák PM2,5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Čína) byl použit pro vzorkování na křemenném filtru. Křemenná membrána byla ponořena do 75% ethanolu s následným ultrazvukovým třepáním. Pro přípravu vysoce koncentrovaného zásobního roztoku byla použita sterilní voda. Lidské melanomové buňky A375 byly kultivovány v 5% CO2 při 37 stupních v běžném Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA) obsahujícím fetální hovězí sérum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Buňky A375 byly ošetřeny různými koncentracemi PM2.5 (0, 100, 200 a 400 ug/ml) po dobu 24 hodin a buňky byly použity pro následující studie. Pro statistickou analýzu byl použit nepárový Studentův t-test a jednosměrná analýza rozptylu a P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.
Ke zkoumání vlivu PM2.5 na buňky A375 byla detekována buněčná proliferace pomocí soupravy CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a buněčná apoptóza byla detekována pomocí Annexin V fluorescein isothiokyanate/ kit pro apoptózu propidium jodid (FITC/PI) (Multisciences, USA), na základě pokynů výrobce. Výsledky ukázaly, že PM2.5 vykazoval cytotoxicitu závislou na koncentraci pro buňky A375, ale neovlivnil apoptózu [doplňkový obrázek 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Ke stanovení obsahu melaninu byla použita metoda NaOH. Buňky A375 ošetřené PM2.{1}}byly promyty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) a lyžovány vodou. Lyzáty byly centrifugovány při 12, 000 r/min po dobu 5 minut, promyty 10procentní kyselinou trichloroctovou (500 ml) (Sigma, St. Louis , MO, USA) a 75% ethanolu (500 ml) a poté znovu vyčeřen. Poté bylo k peletám přidáno 50 ml 1 mol/l NaOH obsahujícího 10 procent dimethylsulfoxidu po dobu 1 hodiny při 80 stupních. Absorbance při 490 nm (OD 490) byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček. Protože TYR je nejdůležitější melanogenní enzym, dále jsme detekovali aktivitu TYR pomocí testu levodopy (L-DOPA). Šestijamkové destičky (Corning, USA) byly naočkovány buňkami A375 v hustotě 3105 buněk/jamku. Buňky byly poté promyty PBS a lyžovány 0,5% deoxycholátem sodným (Sigma). Lyzát byl rozdělen do tří skupin a do každého vzorku bylo přidáno 0,1 procenta L-DOPA (Sigma). Po 5 minutách bylo změřeno OD 490 a jako standard bylo použito 0,1 procenta L-DOPA. Také jsme měřili hladiny exprese mRNA a proteinu TYR. Celková RNA byla extrahována pomocí mini sady RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA). Reverzní transkripce byla provedena pomocí soupravy ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japonsko). Poté byla provedena kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR) na Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japonsko). Primery od Invitrogen jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1, http://links. lww.com/CM9/A917 a hladina exprese každé mRNA byla vypočtena pomocí metody 2*DDCT. Hladiny exprese proteinu byly analyzovány Western blotem. Buňky byly promyty PBS a lyžovány v RIPA pufru (Beyotime, Čína) obsahujícím fenylmethylsulfonylfluorid (směs inhibitorů proteázy, 20:1, Sigma-Aldrich). Koncentrace proteinu byly měřeny pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA (Beyotime, Čína). Celková bílkovina byla vařena při 70 stupních po dobu 10 minut, separována ve 4% – 12% gelu při 200 V po dobu 40 minut, přenesena na membránu při 4 stupních za použití 120 mA po dobu 75–100 minut a poté inkubována s 5% odtučněného mléka po dobu 1 hodiny. Membrány byly poté sondovány protilátkami anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 a anti-CYP1B1 (Abcam) přes noc při 4 stupních. Jako sekundární protilátka byla použita anti-myší IgG protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (Proteintech, USA). Výsledky ukázaly, že PM2,5 zvýšil obsah melaninu a aktivitu TYR v závislosti na dávce. Hladiny exprese mRNA i proteinu TYR byly upregulovány [doplňkový obrázek 2 A–D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2,5 může zvýšit aktivitu TYR aktivací dráhy AhR. Abychom určili, zda PM2.5 ovlivňuje signalizaci AhR, detekovali jsme hladiny transkripce AhR a jeho klasických downstream genů CYP1A1 a CYP1B1 pomocí qRT-PCR a western blottingu. Výsledky ukázaly, že PM2.5 upreguloval hladiny exprese mRNA AhR a CYP1A1, stejně jako proteinovou expresi CYP1A1 [doplňkový obrázek 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
Aktivace AhR způsobuje generování ROS, což může také zvýšit aktivitu TYR.[5] Proto jsme hodnotili produkci ROS pomocí 20,70 -dichlorfluorescein diacetátu (DCFHDA) a průtokové cytometrie. Po 24 hodinách působení PM2.5 byly buňky A375 inkubovány s DCFH-DA (5 mmol/l) po dobu 30 minut při 37 stupních ve tmě. Buňky byly dvakrát promyty v PBS a fluorescence byla měřena průtokovým cytometrem. Průměrná intenzita fluorescence byla kvantifikována pomocí softwaru FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, USA). Protože se předpokládá, že produkce ROS indukovaná CYP1A{14}} je zodpovědná za zánětlivou odpověď,[5] hladiny exprese mRNA prozánětlivých cytokinů (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} a tumor nekrotizující faktor [TNF]-a). Bylo zjištěno, že PM2.5 zvýšil produkci ROS, stejně jako hladiny IL-1a, IL-6 a IL-8 mRNA v buňkách A375 [doplňkový obrázek 2 H a I, http ://Odkazy. lww.com/CM9/A917].
Zjištění této studie naznačují, že PM2.5 podporuje melanogenezi a zvyšuje jak aktivitu, tak expresi TYR v buňkách A375. Kromě toho by PM2.5 mohl aktivovat signalizaci AhR a vyvolat oxidační stres a zánětlivou odpověď, což může být melanogenní signální kaskáda zodpovědná za hyperpigmentaci.
Poděkování
Vyjadřujeme naši upřímnou vděčnost: Prof. Dr. Masutaka Furue a Prof. Dr. Tsuji Gaku z univerzitní nemocnice Kyushu, kteří vylepšili rukopis a pomohli s informacemi týkajícími se AhR. Jsme také vděční za anglické úpravy poskytnuté Prof. Dr. Robertem Schwartzem z Rutgers New Jersey Medical School.
Financování
Tato studie byla podpořena grantem od National Natural Science Foundation of China (č. 2101000271).
Střet zájmů
Žádný.
Reference
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Expozice jemným částicím souvisejícím se senilním lentigem u čínských žen: průřezová studie. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q a kol. Částice podporují hyperpigmentaci prostřednictvím aktivace signalizace AhR/MAPK a zvýšením parakrinních hladin a-MSH v keratinocytech. Environ Pollut 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potenciální role PM2,5 v melanogenezi. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Aryl uhlovodíkový receptor (AhR) možný cíl pro léčbu kožních onemocnění. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M a kol. Vliv částic ve vzduchu na kůži: systematický přehled od epidemiologie po studie in vitro. Část Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-r.
【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】
