Extracelulární vezikuly jako noví hráči v onemocnění ledvin

"Moč nám může poskytnout den za dnem, měsíc za měsícem a rok za rokem sériový příběh hlavních událostí v ledvinách." Dr. Thomas Addis, průkopník renální fyziologie, dospěl k tomuto závěru v roce 1948. Objev močových extracelulárních váčků (uEV) jako molekulárních napodobenin ledvinových buněk posunul jeho pohled na novou úroveň (obrázek 1). uEV zahrnují vezikuly nano velikosti, které vyčnívají z buněčné plazmatické membrány zdravých nebo umírajících buněk (mikrovezikuly nebo apoptotická tělíska) nebo jsou vylučovány prostřednictvím multivezikulárních tělísek v regulovaném procesu (exozomy). V souladu s názorem Dr. Addise obsahují uEV specifické pro onemocnění a místně specifické markery z buněk lemujících ledvinové tubuly a močové cesty1, což z nich činí neocenitelný doplněk k markerům dysfunkce ledvin, jako je sérový kreatinin a proteinurie, které jsou nespecifické a pozdní. projevit se. Vyvíjející se důkazy prokazují potenciál uEV předpovídat onemocnění dříve než konvenční markery. První biomarker založený na uEV byl nedávno schválen Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv v oblasti urologie, kde podpis uEV RNA slouží jako neinvazivní metoda screeningu rakoviny prostaty. Kromě jejich role v diagnostice a prognóze jsou uEV stále více studovány jako noví poslové v mechanismech onemocnění ledvin a v kontextu regenerativní medicíny. Nedávno bylo zveřejněno prohlášení o pozici Urine Task Force Mezinárodní společnosti pro extracelulární vezikuly s cílem posunout přísnost a standardizaci analýzy uEV a urychlit klinickou aplikaci uEV.

Klikněte pro fyziologický roztok pro ledviny

1 uEV PRO DIAGNOSTIKU A PROGNÓZU

Použití uEV pro diagnostiku a prognózu v tekutých biopsiích závisí na skutečnosti, že extracelulární vezikuly (EV) si zachovávají vlastnosti buňky, ze které jsou vytvořeny. Diagnostické studie uEV lze obecně rozdělit na dva přístupy: (1) přístupy zaměřené na analýzu jednotlivých EV (například analýzou sledování nanočástic nebo průtokovou cytometrií) a (2) přístupy zaměřené na hromadnou analýzu EV, jako je proteomika nebo profilování RNA . Těžištěm přístupů s jedním EV je obecně výčet uEV a cílené fenotypování, jako je detekce původní buňky EV a specifického nákladu z glomerulárních a tubulárních buněk. Dřívější studie naznačovaly, že zvýšení hladin uEV může naznačovat základní onemocnění. Například EV podocytů v moči byly zvýšeny u diabetického onemocnění ledvin před albuminurií2 a zvýšení subpopulací uEV bylo hlášeno u preeklampsie.3 Mnoho raných studií se vyznačuje heterogenitou v metodologii a následnými problémy s externí validací. Některé z nich používají suboptimální instrumentaci, postrádají vhodné kontroly nebo validaci protilátek a nezahrnují ortogonální přístupy k potvrzení izolace vezikul. Nedávná studie ukazuje moderní přístup k hodnocení uEV pomocí průtokové cytometrie, který bude nezbytný pro přechod od výzkumného nástroje ke klinickému testu.4

Využívá se komplexní validace izolace vezikul včetně více proteinových markerů. Autoři také zavedli klíčové kontroly: pufr, pufr plus reagencie, uEV bez reagencií a přípravek lyzovaných vezikul pro snížení falešně pozitivních výsledků a také „molekuly ekvivalentního rozpustného fluorochromu“ pro standardizaci jednotek intenzity fluorescence. Tyto klíčové kroky umožní mezilaboratorní porovnání výsledků bez ohledu na přístroj nebo software. Druhým přístupem k diagnostice uEV je hromadné posouzení obsahu uEV. Klíčová studie Pisitkuna et al.5 z roku 2004 prokázala proveditelnost proteomického hodnocení uEV a identifikovala zásadní problémy, jako je interference Tamm-Horsfallova proteinu. Podobné přístupy k hodnocení EV nákladu byly popsány pro EV vázané nukleové kyseliny, lipidy a metabolity. Klíčovým předpokladem při odvozování změn ledvin z těch pozorovaných u uEV je, že molekulární složení uEV zrcadlí složení ledvin. Zdá se, že nedávná práce Wu et al.6 to podporuje. Pomocí proteomického přístupu autoři prokázali silné korelace mezi proteiny uEV a proteiny nalezenými v celých ledvinách. Změny exprese proteinů v celých ledvinách po fyziologické stimulaci (vysoká K1) se odrazily v uEV poskytujících silnou podporu pro použití uEV jako náhradních měřítek patologie ledvin.

UEV PRO FUNKCI A REGENERACI

Roste zájem o funkční a regenerační roli UEV. Buňky jsou schopny komunikovat uvolňováním EV, které modulují procesy v recipientních buňkách.7–9 V ledvinách byly popsány tři typy takové komunikace: (1) intranefronová komunikace, která může vysvětlit, jak glomerulární (např. poškození podocytů s proteinurií) a tubulární poškození (např. hypoxie) způsobuje intersticiální fibrózu,9 (2) intratubulární komunikaci (mezi tubulárními segmenty),7 a (3) komunikaci cirkulace do ledvin, což bylo prokázáno u pacientů s aktivní vaskulitidou a bylo prokázáno, že nesou B{{7} }kininové receptory.8 Pochopení signálních drah odvozených od uEV by nakonec mohlo vést k novým terapeutickým cílům u onemocnění ledvin. Pro funkční studie je však důležité studovat čisté přípravky EV a porovnávat tyto frakce s izolovaným materiálem, který není EV ("EV korona" nebo eluát bez EV).1

Výzkumník začíná převádět poznatky in vitro do modelů in vivo, včetně použití značených nebo označených EV, a ověřovat nálezy v lidských kohortách. Například Lv et al.10 použili kultivační systém transwell k prokázání, že tubulární epiteliální buňky stimulované albuminem produkují EV obsahující zánětlivé cytokiny CC Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2). EV z těchto tubulárních epiteliálních buněk ošetřených albuminem byly injikovány myším a indukovaly tubulární poškození v modelu in vivo. Kromě toho byla u pacientů s proteinurickou IgA nefropatií nalezena CCL2 messenger RNA v uEV, což podporuje translační potenciál.10 Terapeutická role EV odvozených z kmenových buněk byla dlouho studována u akutního onemocnění ledvin a CKD. Velmi nedávno byla regenerační role uEV od zdravých dárců prokázána na modelu AKI indukovaném glycerolem.11 uEV zlepšila obnovu ledvin, stimulovala proliferaci tubulárních buněk a snížila expresi zánětlivých a poranění markerů, čímž obnovila endogenní ztrátu Klotho. Autoři provedli další purifikační kroky k získání čistých EV, důkladnou EV charakterizaci EV (CD81, CD63) a proteinů nesouvisejících s EV (kalretikulin). Autoři také zahrnuli několik klíčových kontrol, včetně frakcí bez EV a EV z nerenálních zdrojů.

BUDOUCÍ POKYNY

UEV byly studovány již 0,17 let od vydání puncovní publikace Pisitkuna et al.5 v roce 2004. Proč se zájem o uEV jako nové hráče v oblasti onemocnění ledvin neustále zvyšuje? Rok 2004 ve skutečnosti zahájil éru rostoucí přísnosti ve studiích uEV, kde tato oblast postupně překonávala klíčové překážky ke klinickému použití. Byla stanovena biologie a nákladní nakládání elektromobilů; byly vyvinuty nové izolační metody, které vedly k čistším izolátům EV.1 Byly vyvinuty ukazatele kvality, byly prozkoumány a ověřeny normalizační metody uEV a byly zavedeny minimální požadavky na podávání zpráv (přehled v odkazu 1). Mezitím se výzkum uEV stále rozrůstal kvůli slibům, které uEV drží. Nejdůležitější je, že uEV jsou obohacené „koše“ informací o molekulárních procesech a cestách, které lze vysledovat zpět k jednomu typu buňky. Jsou tedy potenciálně citlivější než vylučované proteiny nebo RNA v moči a mohou být také specifičtější. Ve skutečnosti bylo učiněno několik pokusů studovat EV specifické pro určité segmenty tubulů. To však zůstává náročné, protože mnoho proteinových markerů rozpoznává pouze intracelulární epitopy, což může vyžadovat permeabilizaci uEV detergenty.12 Seznam proteinů, které lze pro tento účel použít, jak je uvedeno v nedávno publikovaném pozičním dokumentu uEV.1 Ačkoli izolace UEV je stále velmi časově a pracně náročné, vyvíjejí se a charakterizují vysoce výkonné metody charakterizace uEV12 s potenciálem urychlit proces klinicky použitelných biomarkerů ledvin, jako jsou markery odmítnutí transplantátu, které by mohly obejít potřebu biopsie ledviny.13 Mnoho z těchto pokroků zvýšilo složitost informací, které lze získat z UEV. Současné výzvy se proto přesunuly od nalezení metod izolace a charakterizace dostatečně citlivých pro studium těchto nových poslů ke zlepšení specifičnosti (další) optimalizací normalizačních metod, kontroly kvality a důkladného hlášení. Zde rozšiřujeme doporučení z dokumentu o uEV1 o vybraný soubor zdrojů pro výzkum uEV (tabulka 1). Řešení těchto výzev nakonec povede k rychlým a přesným metodám s malými odchylkami nezbytnými pro klinickou aplikaci. Tyto další kroky by mohly umožnit, aby přístupy založené na uEV nahradily biopsie ledvin během příštího desetiletí.

další informace:ali.ma@wecistanche.com