Extravirová DNA v adeno-asociovaných virových vektorových preparátech indukuje TLR9-dependentní vrozené imunitní odpovědi v lidských plazmocytoidních dendritických buňkách
Oct 11, 2023
Suspenze adeno-asociovaných virových (AAV) vektorů produkované buď v buňkách HEK odvozených od člověka nebo v hmyzích buňkách Spodoptera frugiperda (Sf9) se liší z hlediska reziduálních složek hostitelské buňky a také druhově specifických posttranslačních modifikací zobrazených na kapsidových proteinech AAV . Zde jsme analyzovali dopad těchto rozdílů na imunogenní vlastnosti vektoru. Stimulovali jsme lidské plazmacytoidní dendritické buňky různými šaržemi AAVCMV-eGFP vektorů produkovaných buňkami HEK a Sf9 odvozenými od různých výrobců. Zjistili jsme, že AAV8-CMV-eGFP stejně jako AAV2-CMV-eGFP vektory indukovaly zánětlivé cytokinové reakce specifické pro šarži, ale ne specifické pro produkční platformu nebo výrobce. Ty by mohly být sníženy nebo zrušeny blokováním signalizace Toll-like receptoru 9 nebo enzymatickou redukcí DNA v šaržích vektorů pomocí DNázy. Úspěšná transdukce buněk HEK pomocí šarží AAV ošetřených DNázou a analýzy DNA ukázaly, že DNáza neovlivnila integritu vektoru, ale degradovala extravirovou DNA. Došli jsme k závěru, že přípravky AAV odvozené z HEK a Sf{21}}buněk mohou obsahovat imunogenní extravirové složky DNA, které mohou spouštět zánětlivé imunitní reakce specifické pro šarže. To naznačuje, že zlepšené strategie pro odstranění extravirových nečistot DNA mohou být nástrojem pro snížení imunogenních vlastností AAV vektorových přípravků.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Poslední dekáda byla svědkem enormního zájmu o vývoj nových strategií založených na rekombinantním adenoasociovaném viru (AAV) pro základní výzkum i pro klinické aplikace1–3. Hlavní důvod spočívá ve skutečnosti, že AAV vektory byly extrémně všestrannými nástroji v oblasti genové terapie vzhledem k jejich schopnosti účinně a bezpečně dodávat terapeutické geny do cílových tkání4. Rostoucí počet výzkumníků však nezávisle hlásí zjištění naznačující lokální a systémové imunitní reakce po podání AAV v preklinických a klinických studiích5–8.
Ukázalo se, že AAV vektory aktivují receptory rozpoznávající vrozené imunitní vzorce, jako je toll-like receptor (TLR)2 a TLR9, což vede k uvolňování zánětlivých cytokinů a interferonů typu I (IFN)9,10. Imunogenní složky AAV, které mohou stimulovat tyto reakce, zahrnují kapsidové proteiny a vektorový genom9,10. Imunitní reakce po aplikaci AAV mohou být také spuštěny nečistotami ve vektorové suspenzi5,11. Tyto nečistoty byly definovány jako jakákoli složka přítomná v purifikované suspenzi AAV vektoru jiná než požadovaný produkt12 a jsou výsledkem procesu produkce vektoru. Dvě z hlavních metod produkce klinických rekombinantních AAV vektorů zahrnují transfekci plazmidové DNA do buněk HEK a infekci hmyzích buněk Spodoptera frugiperda (Sf9) bakoluvirem13. V souladu s tím by potenciálně imunogenní nečistoty obsažené v suspenzích vektorů AAV mohly zahrnovat endotoxiny, složky buněčného kultivačního média, činidla, která se používají pro purifikaci AAV, proteiny a DNA odvozené z hostitelských buněk a zbytkovou bakulovirovou DNA nebo plazmidovou DNA5. Další faktory, které by mohly ovlivnit imunogenicitu suspenzí vektorů AAV, jsou posttranslační modifikace (PTM) vtisknuté do kapsidy různými platformami pro produkci vektorů5. Důležité je, že vektory AAV z buněk HEK a Sf9 se velmi liší, pokud jde o jejich PTM, jejich reziduální nečistoty proteinů hostitelské buňky11 a potenciálně také v jejich nečistotách DNA (HEK buněčná DNA vs. Sf9 buněčná DNA, stejně jako reziduální plazmidová DNA vs. bakulovirová DNA)14. Plazmocytoidní dendritické buňky (pCD) jsou specializovaným typem vrozených imunitních buněk, které secernují velká množství IFN typu I a prozánětlivých cytokinů po virových infekcích9,15 a hrají hlavní roli ve snímání AAV vektorů9. Abychom analyzovali, zda rozdíly mezi vektory AAV produkovanými buňkami HEK a vektory AAV produkovanými buňkami Sf{26}} vedou k rozdílům v jejich imunogenních vlastnostech, stimulovali jsme lidské pDC různými šaržemi stejného vektoru AAV získaného ze dvou produkčních systémů. a různých výrobců. Zjistili jsme, že polovina zkoumaných šarží vektorů vyvolala prozánětlivé imunitní reakce specifické pro šarži, které nesouvisely ani se systémem produkce vektorů, ani s výrobcem. Tyto reakce byly zprostředkovány signalizací TLR9 a byly citlivé na ošetření šarží vektorů DNázou. Úspěšná transdukce HEK buněk jak neošetřenými, tak DNázou ošetřenými AAV vektory a DNA analýzy AAV přípravků naznačovaly, že DNáza neovlivnila integritu AAV částic, ale spíše cílila na nezapouzdřenou extravirovou DNA. Souhrnně to naznačuje, že AAV vektorové přípravky mohou obsahovat nezapouzdřenou extravirovou DNA, která může ovlivnit imunogenní vlastnosti AAV vektorových přípravků v lidských pDC.
Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému
Výsledek
AAV indukuje vrozené imunitní reakce specifické pro šarži v lidských pDC.
Studie prokázaly, že vektory AAV odvozené z buněk HEK a odvozené z buněk Sf9 se liší, pokud jde o jejich PTM a nečistoty obsažené ve virových suspenzích11. Předpokládali jsme, že tyto faktory by mohly vést k rozdílům v imunogenních vlastnostech mezi šaržemi vektorů odvozených z buněk HEK a buněk Sf9. Abychom tuto hypotézu otestovali, analyzovali jsme celkem osm šarží vektorů AAV sérotyp 8 (AAV8) obsahujících identickou sekvenci DNA promotoru cytomegaloviru (CMV) a identický transgen pro protein zesílené zelené fluorescence (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; pět šarží odvozených z buněk HEK a tři šarže Sf9) a čtyři šarže AAV2-CMV-eGFP (dvě šarže odvozené z buněk HEK a dvě šarže Sf9) od tří různých výrobců [výrobce A; Viral Vector Core Facility University of Iowa (Iowa, USA), výrobce B; Virovek (CA, USA) a výrobce C; Vigene Biosciences (MD, USA)]. Aby se maximalizovaly podobnosti mezi šaržemi, bylo sedm šarží AAV8 od výrobce A a výrobce B (tabulka 1) produkováno za použití stejného původního plazmidu. Kromě toho byla provedena kapičková digitální PCR (ddPCR) registrace vektorových genomů (vg) šarží vektorů AAV při měření vedle sebe pomocí dvou různých cílů: jeden v sekvenci CMV a druhý v sekvenci eGFP vektory. Výsledky získané kvantifikací cíle CMV byly použity pro titraci šarží vektoru AAV v následujících experimentech (tabulka 1). pDC jsou specializované virové senzory, které masivně produkují IFN typu I po virové infekci15, včetně AAV vektorů9. Abychom prozkoumali, zda se AAV vektory produkované buňkami HEK a vektory produkované Sf{28}}buňkami liší ve své schopnosti vyvolat vrozené imunitní reakce v imunokompetentních buňkách, stimulovali jsme lidské pDC pomocí výše uvedených šarží vektorů AAV. Za tímto účelem byly pDC purifikovány z mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) jednotlivých zdravých lidských dárců negativní selekcí za použití magneticky aktivovaného třídění buněk (MACS). Analýza průtokovou cytometrií potvrdila čistotu izolovaných pDC přes 90 % (obr. S1). Deset pDC jednotlivého dárce bylo naočkováno a stimulováno šaržemi vektorů AAV8 a AAV2 při MOI 1:1 x 106 vg/buňku po dobu 18 hodin. MOI 1:106 vg/buňku aplikovaný na celkem 12 500 buněk v 50 ul/jamku se převádí na titr 2,5 x 1011 vg/ml. Tento titr jsme použili, protože je v rozmezí toho, co se používá ve studiích retinální genové terapie u lidí (např. 1× 1012 vg/ml16 nebo 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) a subhumánních primátů (např. 5× 1011–5 × 1012 vg/ml6). Stimulace vehikulem sloužila jako kontrola. Inkubace s šaržemi vektorů AAV8 a AAV2 nevedla k žádné detekovatelné expresi transgenu v pDC. Nicméně čtyři z osmi položek AAV8 (položky A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) a dvě z čtyři šarže AAV2 (šarže B-Sf9-1, B-Sf9-2) indukovaly reaktivní buněčnou proliferaci ve stimulovaných pDC (obr. 1a). To bylo doprovázeno uvolněním prozánětlivých cytokinů (IP-10, MIP-1 a TNF-) a IFN typu I (IFN-). Naopak, buněčná proliferace ani uvolňování cytokinů nebyly indukovány zbývajícími AAV8 (šarže A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) a šarže AAV2 (šarže C-HEK-1, C-HEK-2). Tyto výsledky byly potvrzeny ve třech až čtyřech nezávislých experimentech, z nichž každý byl proveden s buňkami jednoho individuálního dárce (obr. 1a–c a tabulka S1). Rozdíly v koncentracích cytokinů specifické pro šarže v těchto nezávislých experimentech byly statisticky analyzovány pomocí lineárního modelu se smíšeným efektem a post hoc Dunnettova testu (Q=2.6) porovnáním průměrů nejmenších čtverců různých šarží vektoru AAV s ovládání vozidla (tabulky S2 a S3). To prokázalo statisticky významné rozdíly v cytokinových odpovědích mezi „imunogenními“ šaržemi vektoru AAV (šarže AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} nebo AAV2 šarže B-Sf9-1, B-Sf9-2 v tomto pořadí) a kontrola, ale žádné významné rozdíly mezi "neimunogenními" šaržemi AAV vektoru (AAV8 šarže A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 nebo AAV2 šarže C-HEK-1, C-HEK-2 respektive) a kontrola (tabulka S3). Koncentrace zbytku měřených cytokinů zahrnutých v multiplexním testu byly buď pod rozsahem testu (tj. IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL{141}}, IL{142}}, IL-13, IL{144}}, GM-CSF, IFN-) nebo ani „imunogenní“, ani šarže "neimunogenních" vektorů vyvolaly jakékoli významné zvýšení jejich uvolňování (tj. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (obr. S2), což naznačuje stupeň specifičnosti v cytokinové odpovědi zprostředkované AAV. Ke zkoumání cytokinových odpovědí v dřívějším časovém bodě byly pDC stimulovány "imunogenním" vektorem AAV8 šarže A-HEK-1. Pozorovali jsme významné zvýšení koncentrace TNF- v supernatantu již 2 hodiny po stimulaci pDC. Tento vzorec odezvy by mohl být potvrzen ve třech experimentech, z nichž každý se provádí s buňkami jednoho individuálního dárce (obr. S3). Abychom prozkoumali, zda vyšší dávka "neimunogenní" šarže vektoru AAV8 byla schopna vyvolat imunitní odpověď, stimulovali jsme pDC s technicky maximální použitelnou MOI (1:4,61 × 106 vg). Je zajímavé, že ani reaktivní buněčná proliferace ani cytokinové reakce nebyly zjištěny po stimulaci s tímto zvýšeným titrem (obr. S4). Na rozdíl od naší hypotézy tyto výsledky ukazují, že vrozené imunitní reakce na AAV v pDC byly specifické pro šarži a nesouvisely se specifickým produkčním systémem nebo výrobcem/metodou čištění.
Tabulka 1. Různé šarže virových vektorů AAV8 a AAV2 použitých v této studii.
Obrázek 1. Indukce imunitních odpovědí specifických pro šarži AAV vektoru v lidských pDC. Lidské pDC byly stimulovány různými šaržemi AAV8-CMV-eGFP a AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1 × 106 vg) po dobu 18 hodin (a) Reprezentativní snímky světlého pole pDC stimulovaných pomocí kontrola vehikula (horní obrázek) nebo šarže imunogenního AAV vektoru (spodní obrázek). Měřítko je 100 μm. (b) Cytokinové uvolňování IP-10, MIP-1, TNF- a IFN- 2 pomocí AAV8-stimulovaných pDC. (C) Uvolňování cytokinů pomocí AAV{16}}stimulovaných pDC. Reprezentativní grafy jednoho ze tří až čtyř nezávislých experimentů. Protože při měření IFN- 2 (b,c) a měření TNF- (c) některé hodnoty spadly pod rozsah testu, byla ke všem naměřeným hodnotám IFN- 2 a TNF- pro prezentaci přidána konstanta 1 v semilogaritmickém grafu. Zobrazené jsou mediány a mezikvartilové rozsahy. Na štítcích jednotlivých šarží vektorů jsou tři výrobci reprezentováni písmeny A, B a C; Vektory odvozené z buněk HEK a vektory odvozené z buněk Sf{24}}jsou označeny „HEK a „Sf9“ a odpovídající šarže stejného výrobce a stejného produkčního systému jsou očíslovány „1, 2, 3“. Kruh: odvozeno od HEK vektorová šarže; trojúhelník: vektorová šarže odvozená od Sf{30}}; černá: vektorová šarže od výrobce A; oranžová: vektorová šarže od výrobce B; zelená: vektorová šarže od výrobce C.
Imunitní odpověď na stimulaci AAV v pDC není ovlivněna rozdíly v poměru kapsida/VG.
Preklinické studie ukázaly, že rozdíly v počtu plných a prázdných vektorových částic v suspenzích vektorů AAV mohou ovlivnit imunitní odpověď18. Abychom vyhodnotili, zda rozdíly v imunogenních vlastnostech mezi analyzovanými šaržemi vektorů byly způsobeny rozdíly v poměru plných a prázdných vektorových částic, stanovili jsme titr vektorových kapsid ve všech šaržích AAV pomocí AAV titrace ELISA a vypočítali jsme kapsid/VG poměr. Je zajímavé, že mezi všemi šaržemi AAV byly nalezeny velké rozdíly v poměru kapsida/vg (obr. 2). Přibližně dvakrát více kapsid než vg (2:1) bylo nalezeno v AAV8-CMV-eGFP šaržích A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } a AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; a čtyřikrát více (4:1) v šarži AAV8 A-Sf9-1. U zbytku šarží byl pozorován poměr 1:1. Nebyly však nalezeny žádné významné rozdíly mezi poměry kapsid/vg „imunogenních“ a „neimunogenních“ šarží vektorů AAV v AAV8 (P=0.27) ani v AAV2 (P=0.37) vektorové loty (obr. 2). To naznačuje, že rozdíly v imunogenních vlastnostech analyzovaných šarží AAV vektorů také nesouvisely s rozdíly v poměru plných a prázdných vektorových částic.
Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém
Rozpoznání "imunogenních" šarží vektoru AAV8 pomocí TLR9.
Bylo ukázáno, že vrozené imunitní rozpoznání AAV myšími a lidskými pDC je zprostředkováno DNA snímající TLR99. V souladu s tím jsme hodnotili, zda se TLR9 také podílel na rozpoznání našich "imunogenních" šarží vektoru AAV8. Za tímto účelem byly pDC naočkovány, jak je popsáno, a kultivovány s antagonistou TLR9 H154 (50 uM) s následnou stimulací "imunogenními" vektory AAV8 šarží A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 a A-Sf9-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Po 18 hodinách nebyly pozorovány žádné známky buněčné proliferace (obr. 3a) a bylo naměřeno významné snížení uvolňování IP-10, MIP-1, TNF- a IFN- (obr. 3b). To ukazuje, že imunitní reakce na "imunogenní" šarže vektoru AAV8 v lidských pDC jsou zprostředkovány signalizací TLR9.
Obrázek 2. Porovnání poměrů kapsid/vg mezi různými šaržemi vektorů AAV8-CMV-eGFP a AAV2-CMV-eGFP. Poměry kapsid/vg jsou odvozeny z měření absorbance (ELISA) a výsledků ddPCR (a) osmi šarží vektoru AAV8 a (b) čtyř šarží vektoru AAV2. Přerušované čáry oddělují "imunogenní" od "neimunogenní" šarže vektoru AAV. Sloupce označují průměry a standardní odchylky replikátů. Statistická významnost byla stanovena pomocí nepárového Studentova t-testu.
Obrázek 3. Rozpoznání "imunogenních" AAV8-CMV-eGFP vektorových šarží pomocí pDC je závislé na TLR9. Lidské pDC byly ošetřeny antagonistou TLR9 H154 (50uM) s následnou stimulací „imunogenními“ šaržemi vektoru AAV8 (MOI: 1:1×106 vg) po dobu 18 hodin. (a) Reprezentativní snímky světlého pole purifikovaných pDC ošetřených "imunogenními" šaržemi vektoru AAV (horní obrázek) nebo šaržemi "imunogenního" vektoru AAV a H154 (spodní obrázek). Měřítko je 100 μm. (b) Uvolňování cytokinů IP-10, MIP-1, TNF- a IFN- 2 stimulovanými pDC. Protože při měření IFN- 2 některé hodnoty spadly pod rozsah testu, byla ke všem naměřeným hodnotám IFN- 2 přidána konstanta 1 pro zobrazení v semilogaritmickém grafu. Jsou uvedeny průměry a standardní odchylky. Statistická významnost byla stanovena pomocí jednocestné ANOVA a Holm-Sidakovy post hoc analýzy. Hodnoty P: Menší nebo rovno 0,05: *; Menší nebo rovno 0,01: **; Menší nebo rovno 0,001: ***.
Ošetření DNázou snižuje imunitní reakce "imunogenních" šarží vektorů AAV8 a AAV2.
Zatímco "imunogenní" AAV8 vektory vyvolaly TLR9-závislou imunitní reakci v pDC, žádné takové reakce nebyly indukovány "neimunogenními" šaržemi. TLR9 je aktivován v reakci na DNA, zejména DNA obsahující nemethylované motivy CpG9. Důležité je, že naše měření ddPCR potvrdila, že stejné složky virové DNA byly přítomny v "imunogenních" i "neimunogenních" šaržích vektorů. Souhrnně to naznačuje, že nezabalená/volná DNA ve virové suspenzi spíše než intravirová DNA by mohla být původcem pozorovaných imunitních odpovědí na "imunogenní" šarže vektoru AAV. Pokud tedy byla ve virové suspenzi "imunogenních" šarží vektoru AAV8 přítomna zbytková volná DNA, vrozená imunitní odpověď by měla být oslabena DNázou. Pro testování této hypotézy byly "imunogenní" šarže vektorů AAV8 a AAV2 předem ošetřeny DNázou I (100 ug/ml) po dobu 30 minut před stimulací AAV. Aby se vyloučily nespecifické účinky ošetření DNázou na pDC nebo částice AAV, při stimulacích pouze s AAV byly vektory podrobeny ošetření DNasemock před stimulací pDC. V těchto simulovaných ošetřeních bez DNázy byly částice AAV inkubovány při 37 stupních v identickém médiu pro štěpení DNázou po stejnou dobu jako AAV ošetřené DNázou. Deset pDC bylo nasazeno a stimulováno šaržemi "imunogenních" vektorů AAV předem ošetřených DNázou nebo falešně ošetřenými (MOI: 1:1 x 106 vg). pDC, které byly inkubovány pouze s DNázou nebo falešně ošetřené vehikulem, sloužily jako kontroly. Je zajímavé, že ošetření DNázou "imunogenních" šarží vektorů AAV8 a AAV2 snížilo proliferaci reaktivních buněk (obr. 4a) a buď je zcela zrušilo (šarže AAV8 A-HEK-2 a A-Sf9-1; šarže AAV2 B-Sf9-1 a B-Sf9-2) nebo výrazně snížilo (AAV8 šarže A-HEK-1 a A-HEK-3) vydání IP{{40} }, MIP-1, TNF- a IFN- po stimulaci AAV (obr. 4b,c). Abychom potvrdili, že pozorovaný účinek DNázy byl skutečně způsoben štěpením extravirové DNA a nikoli účinkem DNázy na integritu vektoru, zkoumali jsme, zda ošetření šarží vektoru AAV DNázou ovlivnilo transdukční kapacitu AAV. Protože aplikace AAV nevedla k žádné detekovatelné transdukci pDC, byly pro tyto testy použity buňky HEK, protože buňky HEK jsou dobře známým buněčným modelem pro analýzu účinnosti transdukce po transdukci AAV19. Stimulovali jsme buňky HEK293T šaržemi vektorů AAV8 a AAV2 ošetřených DNázou a falešně ošetřenými (MOI: 1:8 × 104 vg) a hodnotili jsme účinnost transdukce fluorescenční mikroskopií 3 dny po aplikaci vektoru. Jak bylo popsáno, vektory AAV2 vykazovaly vyšší transdukční účinnost ve srovnání s vektory AAV8. Důležité navíc je, že předběžné ošetření DNázou nesnížilo účinnost transdukce v šaržích vektorů AAV8 a AAV2 derivovaných z HEK ani v Sf9-buňkách (obr. S5a,b). Tyto výsledky poskytují další důkaz, že účinek DNázy na imunogenní vlastnosti šarží vektorů je způsoben degradací extravirové DNA. Ačkoli antagonista TLR9 H154 v podstatě zrušil uvolňování prozánětlivých cytokinů pro všechny čtyři imunogenní šarže AAV8 (obr. 3), předběžné ošetření DNázou by také mohlo eliminovat prozánětlivou cytokinovou odpověď u šarží AAV8 A-HEK{{75} } a A-Sf9-1, zatímco u šarží AAV8 A-HEK-1 a A-HEK-3 ji zcela neodstranil (obr. 4). Abychom otestovali, zda zvýšená doba ošetření DNázou může zrušit tuto cytokinovou odpověď, zopakovali jsme simulační experimenty pDC po desetinásobném prodloužení inkubační doby DNázy u příslušných šarží (A-HEK-1 a A-HEK{{87} }). Pozorovali jsme, že po ošetření vektorů DNázou po dobu 5 hodin se průměrné koncentrace cytokinů v supernatantu buněk stimulovaných AAV dále snížily a již se významně nelišily od koncentrace vehikula. Tento vzorec odezvy by mohl být potvrzen ve třech experimentech, z nichž každý byl proveden s buňkami jednoho individuálního dárce (obr. S6). To naznačuje, že hlavní příčinou TLR9-zánětlivé imunitní odpovědi u pDC je skutečně extravirová DNA. Abychom otestovali, zda uvolňování intravirové DNA zvyšuje imunostimulační aktivitu AAV vektorů, záměrně jsme otevřeli virové kapsidy "imunogenní" AAV8 šarže A-HEK-1 tepelným zpracováním při 95 stupních po dobu 10 minut . Tepelně ošetřená vektorová šarže byla poté použita ke stimulaci pDC. Ačkoli nebyly žádné rozdíly v proliferaci reaktivních buněk po stimulaci A-HEK{103}} šarže AAV8 s tepelným ošetřením a bez něj, došlo k významnému zvýšení uvolňování IP{104}}, MIP{105}} TNF- a IFN- v podmínkách tepelného ošetření, což ukazuje, že uvolnění zapouzdřené virové DNA do vektorové suspenze může přispět k indukci imunitních odpovědí (obr. 5). Společně tato data naznačují, že AAV vektorové přípravky mohou obsahovat extravirové DNA kontaminanty, které mohou vyvolat v pDC specifické imunitní reakce. Tyto reakce jsou zprostředkovány signalizací TLR9 a lze je snížit/zrušit ošetřením šarží vektorů DNázou.
Obrázek 4. Předběžné ošetření DNázou snižuje imunitní reakce vyvolané "imunogenními" šaržemi vektorů AAV8-CMV-eGFP a AAV2-CMV-eGFP. Lidské pDC byly stimulovány "imunogenními" šaržemi vektoru AAV8 ošetřenými DNázou po dobu 18 hodin (MOI: 1:1 x 106 vg). (a) Reprezentativní snímky světlého pole purifikovaných pDC stimulovaných „imunogenními“ šaržemi vektoru AAV (horní obrázek) a šaržemi „imunogenního“ vektoru AAV předem ošetřenými 1{{30}}}0 ug/ml DNázy I (dolní obrázek). Měřítko je 500 μm. (b) Cytokinové uvolňování IP-10, MIP-1, TNF- a IFN- 2 pomocí AAV8-stimulovaných pDC. (c) Uvolňování cytokinů pomocí AAV{20}}stimulovaných pDC. Protože při měření IFN- 2 (bac) a měření TNF- (b) některé hodnoty spadly pod rozsah testu, byla ke všem naměřeným hodnotám IFN- 2 a TNF- pro prezentace v semilogaritmickém grafu. Jsou uvedeny průměry a standardní odchylky. Statistická významnost byla stanovena pomocí jednocestné ANOVA a Holm–Sidakovy post hoc analýzy. Hodnoty P: Menší nebo rovno 0,05: *; Menší nebo rovno 0,01: **; Menší nebo rovno 0,001: ***.
Průzkumná analýza extravirových kontaminantů DNA v preparátech vektorů AAV8.
Aby bylo možné provést první průzkumnou charakterizaci složek extravirové DNA v šaržích vektorů AAV, reprezentativní „imunogenní“ (A-HEK-1) a „neimunogenní“ (B-HEK-1) Byla analyzována šarže vektorů odvozených z HEK buněk. Tyto šarže byly buď ošetřeny DNázou v médiu pDC po dobu 30 minut při 37 stupních, jak je popsáno výše, nebo byly falešně ošetřeny a ultrafiltrovány pomocí 100 kDa cut-of filtračního zařízení, nebo byly ošetřeny pouze falešně (obr. S7a– G). Následná separace bioanalyzátoru LabChip a hodnocení purifikované DNA odhalilo přítomnost srovnatelných množství vektorové DNA (obr. S7b–g) v ošetřených a falešně ošetřených vzorcích každé šarže, což potvrzuje, že ani ultrafiltrace, ani ošetření DNázou neovlivnily obsah DNA uvnitř kapsidy. Navíc se ukázalo, že pouze „imunogenní“ (obr. S7a–d), ale nikoli „neimunogenní“ vektorová šarže (obr. S7a, e–g), obsahovala další molekuly DNA o velikosti od 100 do 450 bp (obr. S7c,dah). Důležité je, že tyto další molekuly DNA mohly být detekovány v falešně ošetřeném vzorku a ultrafiltrovaném vzorku, ale prakticky chyběly ve vzorku ošetřeném DNázou (obr. S7a–d). To ukazuje, že tyto molekuly DNA představují extravirové kontaminanty DNA, které mohou být degradovány DNázou, ale nemohou být odstraněny z vektorové suspenze ultrafiltrací. Financování, že tyto kontaminanty mohly být detekovány pouze v "imunogenní", ale ne v "neimunogenní" vektorové šarži, dokazuje, že výskyt těchto extravirových molekul DNA je specifický pro šarži a může navíc naznačovat, že tyto molekuly indukují nebo přispívají na imunostimulační vlastnosti vektoru. K posouzení potenciálního zdroje kontaminující DNA v „imunogenní“ (A-HEK-1) a „neimunogenní“ (B-HEK-1) řadě kvantitativní (q)PCR analýzy HEK byla provedena buněčná DNA, plazmidová DNA a AAV vektorová DNA. Templátová DNA ze vzorků ošetřených DNázou, falešně ošetřených a ultrafiltrovaných a pouze falešně ošetřených vzorků každé šarže byla použita pro amplifikaci Alu repetice, genu NPIP s více kopiemi jaderného genomu a mitochondriálních sekvencí genu 16S rRNA (mt16S) původem z HEK buněk pro amplifikaci amplikonu s invertovanou koncovou repeticí AAV8 (ITR2; vektor a transgenní plasmidový DNA původ) a pro amplifikaci amplikonu pro gen blah (ampicilinová rezistence) (Amp; původ plasmidové DNA) (tabulka S4). Porovnání poměrů hodnot ΔCt DNA-specifického amplikonu HEK buňky vs. ITR2 amplikonu (tj. Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 a mt16S vs. ITR2) a plazmidového DNA-specifického amplikonu versus ITR2 amplikonu (Amp vs. ITR2), v tomto pořadí ukazuje, že dvě šarže obsahují zanedbatelné množství jaderné a mitochondriální DNA buněk HEK. Na rozdíl od toho analýza odhalila slušné množství plazmidové DNA v „imunogenní“ i „neimunogenní“ šarži vektoru (asi 1/32 a 1/50, pokud jde o počet kopií vzhledem k AAV DNA), podíl, který je dobře v rozsahu hodnot uváděných pro jiné AAV vektory12 (obr. S7). Nicméně, tam byly žádné zjevné rozdíly v relativním podílu vektorové DNA plazmidu a HEK buněčné DNA mezi DNase-ošetřené a falešně ošetřené nebo ultra-filtrované a falešně ošetřené vzorky obou šarží vektoru (obr. S8). To může naznačovat, že nezabalená kontaminující DNA je podobná složením cílové sekvence jako sbalená DNA. Omezením analýzy qPCR je však velikost kontaminující DNA (100–450 bp), která bude obsahovat slušnou frakci fragmentů s neúplnou cílovou sekvencí.
Obrázek 5. Uvolnění intravirové DNA tepelným zpracováním vektorů zvyšuje prozánětlivé cytokinové reakce v pDC. Uvolnění cytokinů IP-10, MIP-1, TNF- a IFN- 2 pomocí pDC 18 hodin po stimulaci tepelně ošetřenou AAV8 šarže A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Vodorovné čáry označují průměry a standardní odchylky. Statisticky významné rozdíly mezi cytokinovými reakcemi indukovanými tepelně ošetřenými a neošetřenými vektory byly stanoveny pomocí Studentova t-testu. P value: Menší než nebo rovno 0.01: **; Menší nebo rovno 0,001: ***.
Diskuse
AAV vektory jsou jedním z nejslibnějších nástrojů v genové terapii. Hromadící se důkazy však zpochybňují názor, že imunogenicita AAV je zanedbatelná5. Ve světle toho je stále důležitější lépe porozumět mechanismům, kterými dochází k imunitní odpovědi na AAV. V této studii jsme prokázali, že (1) AAV8 a AAV2 indukují vrozené imunitní reakce specifické pro šarži v lidských pDC, které nejsou specifické ani pro poměr kapsid/vg, ani pro produkční platformu, ani pro metodu výrobce/purifikace; (2) vrozené imunitní reakce v pDC jsou závislé na signalizaci TLR9 a mohou být sníženy předběžnou léčbou DNázou; (3) ošetření DNázou neovlivňuje integritu vektorové částice, protože nesnižuje rychlost transdukce šarží vektorů AAV8 a AAV2 v buňkách HEK293T; a (4) šarže vektoru AAV mohou obsahovat extravirové molekuly DNA, které lze odstranit ošetřením šarže vektoru DNázou. To naznačuje, že přípravky AAV pocházející z HEK a Sf{15}}buněk mohou obsahovat extravirové nečistoty DNA, které stimulují vrozenou imunitní odpověď. V nedávné studii byla provedena srovnávací analýza s použitím AAV vektorů z různých druhů hostitelských buněk (buňky HEK a buňky Sf9)11. Autoři zjistili, že vektory odvozené od HEK a Sf{21}} se liší, pokud jde o jejich PTM a jejich reziduální proteinové nečistoty hostitelské buňky, napříč všemi sérotypy AAV a výrobci, které testovali. Dále analyzovali cytokinovou odpověď primárních lidských fibroblastů na AAV transdukci a zjistili, že vektory odvozené od HEK a Sf{23}} se mohou lišit ve svých imunogenních vlastnostech. V naší studii jsme také porovnávali tyto dva hlavní produkční systémy s použitím různých šarží stejného konstruktu AAV od různých výrobců a dvou různých sérotypů. Avšak vektorem indukované imunitní reakce, které jsme pozorovali v našem lidském pDC modelu, se specificky nevztahovaly k danému produkčnímu systému, výrobci nebo sérotypu, místo toho byly specifické pro šarži. Předchozí preklinické a klinické studie retinální genové terapie uvádějí, že imunitní reakce na AAV vektory, jako je oční zánět nebo infiltrace imunitních buněk, mohou být ovlivněny rozdíly v poměrech kapsid/vg18 nebo rozdíly v dávce5. Timmers et al.18 ukázali, že odstranění prázdných AAV kapsid z virové suspenze snížilo zánět a zlepšilo virovou transdukci v preklinické studii s nehumánními primáty. Naše výsledky však ukázaly, že zvýšené poměry kapsid/vg byly přítomny mezi „imunogenními“ i „neimunogenními“ šaržemi vektorů AAV, což znamená, že vyšší počet kapsid (prázdných kapsid) ve virové suspenzi nebyl zodpovědný za indukci imunitní odpovědi specifické pro šarži vektoru v našem modelu lidského pDC. Kromě toho jsme již dříve ukázali, že AAV8 indukuje imunitní reakce způsobem závislým na dávce u primátů kromě člověka6,8. Nicméně zvýšení dávky "neimunogenních" AAV vektorů v této studii nebylo dostatečné pro spuštění imunitní reakce v lidských pDC. Proto, abychom porozuměli příčině rozdílů v imunogenních vlastnostech vektorů, zkoumali jsme mechanismus zapojený do rozpoznávání "imunogenních" šarží AAV. Použití in vitro imunokompetentních buněčných modelů umožnilo vědcům přesněji studovat roli TLR drah ve vrozených imunitních odpovědích generovaných AAV vektory9,10. Zhu et al.9frst popsali, že pDC, ale ne konvenční DC nebo non-pDC, uvolňují velká množství IFN typu I a prozánětlivých cytokinů v reakci na stimulaci AAV a prokázali zapojení TLR9 dráhy do rozpoznávání AAV8 a AAV2 pomocí myších pDC. Autoři také pozorovali, že AAV2 indukoval TLR9-závislé imunitní reakce v lidských pDC. V naší studii s použitím jednoho z nejspecifičtějších antagonistů TLR9, H1549,21–24, jsme nepřímo ukázali, že nejen AAV2, ale také AAV8 vektory indukují TLR9-závislé vrozené imunitní reakce v lidských pDC, ale hodně specifickým způsobem. Protože TLR9 je DNA receptor, naznačuje to, že imunitní reakce na "imunogenní" šarže vektoru AAV byly indukovány složkami DNA. Nicméně, ačkoli naše měření ddPCR potvrdila, že stejné sbalené složky DNA byly přítomny v „imunogenních" i „neimunogenních" šaržích vektorů, „neimunogenní“ šarže nespustily imunitní reakce v pDC. Kromě toho ošetření DNázou buď snížilo nebo zrušilo imunostimulační vlastnosti „imunogenních“ šarží vektorů AAV, ale nesnížilo transdukční účinnost těchto vektorů v buňkách HEK, což naznačuje, že ošetření DNázou AAV cílilo na nezapouzdřenou extravirovou DNA v vektorovou suspenzi, ale neovlivnily integritu vektorového genomu v intaktní kapsidě. To bylo dále potvrzeno srovnávacími analýzami DNA reprezentativních šarží "imunogenních" a "neimunogenních" vektorů ošetřených DNázou a falešně ošetřených.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Souhrnně všechny tyto experimenty naznačují, že imunitní odpověď na „imunogenní“ šarže vektorů v pDC nebyla řízena DNA obsaženou v částicích AAV (tj. vektorový genom nebo potenciální nečistoty DNA sbalené v kapsidách AAV), ale dostupná extravirová DNA složky obsažené ve virových suspenzích (tj. DNA vně nebo nechráněné virovou kapsidou). Také jsme pozorovali, že když byla DNA obsažená ve virových kapsidách "imunogenní" šarže vektoru vystavena buňkám tepelným zpracováním vektoru, došlo ke zvýšení imunitní odpovědi. Není jasné, zda zvýšení imunostimulační aktivity po otevření kapsid bylo způsobeno jednořetězcovou DNA vektoru nebo potenciálními nečistotami sbalenými v kapsidách AAV, jako jsou reziduální nukleové kyseliny hostitelské buňky, reziduální sekvence pomocné DNA, páteřní sekvence fragmenty sbalené spolu s kazetou nebo reverzní priming z ITR, což vede k malým fragmentům páteře zabaleným do AAV12,25. Přesný mechanismus vychytávání extravirové DNA pDC zůstává neznámý. Citlivost pDC na CpG oligonukleotidy ukazuje, že pDC mohou reagovat na volnou DNA26. To naznačuje, že imunitní odpověď v pDC může být spuštěna vychytáváním volné kontaminující DNA obsažené v suspenzi vektoru. Navíc se ukázalo, že pDC mohou přijímat AAV vektory27 alternativně, což naznačuje, že potenciální DNA vázaná na kapsidu by mohla být transportována do buňky během vychytávání AAV částic. Přítomnost extravirové kontaminace DNA v preparátech vektorů AAV by mohla být buď vlastní vlastností příslušné šarže vektorů vyplývající z procesu produkce a čištění vektorů, nebo by mohla být způsobena uvolněním zapouzdřené DNA v důsledku nevhodných podmínek skladování. . Všechny šarže vektorů zkoumané v těchto experimentech byly získány během stejného časového období (5 z 8 zkoumaných šarží vektorů AAV8, z nichž dvě byly "imunogenní" (A-HEK-2; A-HEK-3) a tři byly „neimunogenní“ (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) byly dokonce vyrobeny paralelně speciálně pro tuto studii), šarže z každý výrobce byl odeslán ve stejných přepravních krabicích a po obdržení byly všechny šarže uloženy vedle sebe ve stejné zásuvce mrazáku s teplotním alarmem −80 stupňů, než byly alikvoty všech šarží současně rozmraženy a aplikovány na pDC v experimentech vedle sebe. To silně naznačuje, že za rozdíly v obsahu extravirové DNA a imunostimulačních vlastnostech těchto šarží byl zodpovědný spíše proces produkce a purifikace AAV než nevhodné skladování. V minulosti šarže AAV vektorů klinického stupně vyráběné pro genovou terapii (alipogene tiparvovec, Glybera) již nebyly registrovány kvůli vysokému množství nečistot včetně potenciálně imunogenní reziduální DNA hostitelské buňky28. Odstranění nečistot DNA z virových suspenzí se obvykle provádí během výrobního procesu. Zde se rutinně používá ošetření Benzonase29 nebo DNase30, aby se odstranila reziduální DNA z konečné virové suspenze. Toto ošetření v závislosti na protokolu trvá 30 minut až 3 hodiny a poté je enzym inaktivován chemikáliemi, jako jsou soli chloridu česného30. V našich experimentech bylo zjištěno, že čtyři z pěti šarží AAV8 pocházejících ze zařízení pro jádro virových vektorů University of Iowa a obě šarže vektorů AAV2 od společnosti Virovek jsou imunogenní v pDC. Jak je popsáno v části "Materiály a metody", proces čištění šarží vektorů od obou těchto výrobců zahrnuje několik kroků čištění, z nichž některé se od sebe značně liší. Proces čištění v Core Facility v Iowě tedy zahrnuje ošetření Turbonukleázou, následovanou ultracentrifugací s jodixanolovým gradientem, chromatografií na anexové koloně, flutterovou sterilizací a výměnou pufru za použití odstředivých filtrů. Naproti tomu Virovek aplikuje ošetření Benzonázou, ultracentrifugaci v CsCl s následným odsolením a filtrační sterilizací. Purifikační proces Vigene na druhé straně nezahrnuje ošetření DNázou, ale, jak je používáno Core Facility v Iowě, zahrnuje iodixanolovou gradientovou ultracentrifugaci. Překvapivě však žádná ze tří šarží vektorů odvozených od Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 a 2) neindukovala imunitní reakce v pDC, což naznačuje, že „neimunogenní "Vektorové šarže lze také generovat produkčními procesy, které nezahrnují ošetření DNázou.
Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém
Celkově zčásti podobné a zčásti odlišné purifikační kroky používané třemi výrobci znesnadňují spojení imunogenních vlastností vektorů pozorovaných v pDC k jedinému kroku ve výrobním procesu. Klinické studie používají vektory třídy správné výrobní praxe (GMP), které jsou podrobeny přísným kontrolám kvality. Žádný z vektorů od tří výrobců použitých v této studii není stupněm správné laboratorní praxe (GLP), a proto může mít nižší čistotu než vektory klinického stupně. Je tedy důležité si uvědomit, že vektory GMP používané v klinických studiích na lidech mohou nebo nemusí vykazovat rozdíly, které jsme pozorovali v této studii, a že význam našich zjištění pro klinické použití genových terapií není jasný. Podle našich vlastních zkušeností se však mohou značné rozdíly v koncentraci kontaminujících složek, jako jsou proteiny hostitelské buňky, vyskytovat i u vektorů stupně GMP, a dokonce ani u vektorů stupně GMP neexistují jednotně dohodnuté specifikace, jaké úrovně jsou přijatelné5. Souhrnně je zlepšení výrobního procesu AAV vektorů klíčem k zamezení přítomnosti zbytkových nečistot ve virových suspenzích, aby se minimalizoval potenciál pro nezamýšlené imunitní reakce. Závěrem jsme ukázali, že nečistoty extravirové DNA mohou ovlivnit imunogenní vlastnosti AAV vektorů v lidských pDC. K prozkoumání důsledků těchto zjištění pro bezpečnost genové terapie zprostředkované AAV na zvířecích modelech nebo lidských pacientech jsou zapotřebí další studie.
Reference
1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genomové inženýrství pomocí Adeno-asociovaného viru: Základní a klinický výzkum aplikace. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).
2. Garita-Hernandez, M. a kol. AAV-zprostředkované dodání genu do 3D retinálních organoidů pocházejících z lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).
3. Russell, S. a kol. Účinnost a bezpečnost voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) u pacientů s RPE65-zprostředkovanou dědičnou dystrofií sítnice: Randomizovaná, kontrolovaná, otevřená studie fáze 3. Lancet 390, 849–860 (2017).
4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Vyvíjející se terapeutika dodávaná AAV směrem ke konečným lékům. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).
5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Imunitní reakce na retinální genovou terapii pomocí adeno asociovaných virových vektorů – důsledky pro úspěch a bezpečnost léčby. Prog. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).
6. Reichel, FF a kol. AAV8 může indukovat vrozené a adaptivní imunitní reakce v oku primátů. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).
7. Boyd, RF a kol. Snížená retinální transdukce a zvýšená imunogenicita zaměřená na transgen s intravitreálním podáním rAAV po zadní vitrektomii u psů. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).
8. Rodríguez-Bocanegra, E. a kol. Podélné hodnocení hyper-refektivních ložisek v sítnici po subretinálním podání adeno asociovaného viru u primátů jiného než lidského původu. Přel. Vis. Sci. Technol. 10, 15 (2021).
9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9- Dráha MyD88 je kritická pro adaptivní imunitní odpovědi na vektory genové terapie adenoasociovaného viru u myší. J. Clin. Vyšetřování. 119, 2388–2398 (2009).
10. Hösel, M. a kol. Toll-like receptor 2- zprostředkovával vrozenou imunitní odpověď v lidských neparenchymálních jaterních buňkách vůči adeno asociovaným virovým vektorům. Hepatologie 55, 287–297 (2012).
11. Rumachik, NG a kol. Důležité metody: Standardní produkční platformy pro rekombinantní AAV produkují chemicky a funkčně odlišné vektory. Mol. Ter. Methods Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).
12. Wright, JF Nečistoty související s produktem v rekombinantních AAV vektorech klinického stupně: Charakterizace a hodnocení rizik. Biomedicína 2, 80–97 (2014).
13. Clément, N. & Grieger, JC Výroba rekombinantních adeno-asociovaných virových vektorů pro klinické zkoušky. Mol. Ter. Methods Clin. Dev. 3, 16002 (2016).
14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Farmakologie produkce rekombinantního adeno-asociovaného viru. Mol. Ter. Methods Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).
15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Biologie plazmocytoidních dendritických buněk a její role v imunitně zprostředkovaných onemocněních. Clin. Přel. Immunol. 9, e1139 (2020).
16. Fischer, MD a kol. Účinnost a bezpečnost retinální genové terapie s použitím adeno-asociovaného virového vektoru pro pacienty s choroiderémií: Randomizovaná klinická studie. JAMA Ophthalmol. 137, 1247–1254 (2019).
17. Weleber, RG a kol. Výsledky 2 roky po genové terapii pro RPE65-deficientní Leberovu vrozenou amaurózu a těžkou retinální dystrofii s nástupem v raném dětství. Oftalmologie 123, 1606–1620 (2016).
18. Timmers, AM a kol. Oční zánětlivá odpověď na intravitreální injekci vektoru adeno-asociovaného viru: Relativní příspěvek genomu a kapsidy. Hučení. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).
19. Ran, G. a kol. Místně řízená mutageneze zlepšuje účinnost transdukce rekombinantních AAV vektorů odvozených z kapsidové knihovny. Mol. Ter. Methods Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).
20. Ellis, BL a kol. Průzkum účinnosti transdukce ex vivo/in vitro savčích primárních buněk a buněčných linií s devíti přirozenými adeno-asociovanými viry (AAV1-9) a jedním umělým sérotypem adeno-asociovaného viru. Virol. J. 10, 1–10 (2013).
21. Yamada, H. a kol. Vliv supresivní DNA na CpG-indukovanou imunitní aktivaci. J. Immunol. 169, 5590-5594 (2002).
22. Zhang, P. a kol. Antagonista Toll-like receptoru 9 potlačuje humorální imunitu u experimentální autoimunitní myasthenia gravis. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).
23. Chan, YK a kol. Konstrukce adeno-asociovaných virových vektorů, aby se vyhnuly vrozeným imunitním a zánětlivým reakcím. Sci. Přel. Med. 13, eabd3438 (2021).
24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Struktura, mechanismus a terapeutické využití imunosupresivních oligonukleotidů. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).
25. Brimble, MA a kol. 547. AAV přípravky obsahují kontaminaci ze sekvencí DNA v produkčních plazmidech přímo mimo ITR. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).
26. Latz, E. a kol. TLR9 signalizuje po translokaci z ER do CpG DNA v lysozomu. Nat. Immunol. 5, 190-198 (2004).
27. Veron, P. a kol. Hlavní podskupiny lidských dendritických buněk jsou účinně transdukovány samokomplementárními adeno-asociovanými virovými vektory 1 a 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).
28. Zpráva o posouzení: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Zpřístupněno 3. března 2022 (2012)
29. Arden, E. & Metzger, J. Levný, sérotypově nezávislý protokol pro čištění nativního a bioinženýrského rekombinantního adeno-asociovaného viru. J. Biol. Metody 3, e38 (2016).
30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Výroba a charakterizace adeno-asociovaných virových vektorů. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).
31. Kimura, T. a kol. Produkce adenoasociovaných virových vektorů pro aplikace in vitro a in vivo. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).
32. Ayuso, E. a kol. Vysoká čistota vektoru AAV má za následek zvýšení účinnosti transdukce nezávislé na sérotypu a tkáni. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).
