Zkoumání terapeutických účinků a mechanismu odvaru Yishen Tonglong na benigní hyperplazii prostaty u potkanů ​​prostřednictvím signální dráhy IL-6/STAT3

 

Abstraktní

Objektivní:Prozkoumat prostřednictvím signální dráhy interleukin (IL)-6/signál a aktivátor transkripce (STAT)3 zlepšující účinky a mechanismus odvaru Yiqi Wenshen Tonglong Decoction (zde zkráceně jako Yishen Tonglong Decoction) na benigní hyperplazii prostaty (BPH) u potkanů.

Metody:Samci krys Sprague–Dawley (SD) byli kastrováni a poté jim byl subkutánně injikován testosteron propionát, aby se vytvořil model BPH. Potkani byli náhodně rozděleni do následujících skupin (n=12/skupina): model; Yishen Tonglong Decoction skupiny s nízkou a vysokou dávkou (15 a 30 g/kg); skupina aktivátoru STAT3 (kolivelin, 1 mg/kg); a kombinovaná skupina s vysokou dávkou Yishen Tonglong Decoction (30 g/kg) + Colivelin (1 mg/kg). Dalších 12 samců SD potkanů ​​sloužilo jako skupina s falešnou operací. Po skupinově specifické léčbě odvarem Yishen Tonglong a/nebo Colivelinem jsme hodnotili index prostaty (PI) a poměr estradiol (E2)/testosteron (T); hodnotili histomorfologii prostaty a fibrózu s hematoxylinem-eosinem (HE) a Massonovým trichromem; měřena exprese Ki-67 imunohistochemicky; kvantifikované hladiny IL-6 a IL-1 ve tkáni prostaty a v séru pomocí ELISA; a detekoval kolagen I/III a proteiny související s dráhou IL-6/STAT3 pomocí Western blotu.

Výsledky:Ve srovnání se simulací vykazovala modelová skupina výraznou hyperplazii prostaty a fibrózu s významným zvýšením PI, optické hustoty Ki-67, tkáně/séra IL-6 a IL-1, kolagenu I/III, IL-6 proteinu a p-STAT3/STAT3, spolu s významným poklesem E2/T (všechny P < 0,05). Oproti modelové skupině, nízké i vysoké dávky Yishen Tonglong Decoction zmírnily hyperplazii a fibrózu, snížily PI, Ki-67, IL-6, IL-1, kolagen I/III, IL-6 protein a p-STAT3/STAT3 a zvýšily E2/T (všechny P < 0,05). Odvar s vysokou dávkou poskytl větší zlepšení než nízká dávka (P < 0,05). Colivelin samotný exacerboval hyperplazii a fibrózu a dále zvýšil PI, Ki-67, IL-6, IL-1, kolagen I/III, IL-6 a p-STAT3/STAT3 při současném snížení E2/T (P < 0,05). Současné podávání Colivelinu zeslabilo přínosy odvaru ve vysokých dávkách a významně zhoršilo všechny výše uvedené indexy ve srovnání se samotným odvarem ve vysokých dávkách (P < 0,05).

Závěr:Yishen Tonglong Decoction zmírňuje zánět a zlepšuje patologii BPH u potkanů, alespoň částečně potlačením aktivace signální dráhy IL-6/STAT3.

klíčová slova:IL-6/STAT3 signalizace; Yishen Tonglong odvar; benigní hyperplazie prostaty; bylina na léčení problémů s prostatitidou

 

Bylinné doplňky Cistanche

 

 

 

Další podrobnosti o nové tcm bylince pro zdraví prostaty

 

 

 

Zavedení

Benigní hyperplazie prostaty (BPH) je běžné obstrukční onemocnění dolních močových cest u mužů středního a staršího věku, charakterizované epiteliální a stromální proliferací a zvětšením prostaty, což vede k váhavosti, frekvenci a urgenci moči, které významně zhoršují kvalitu života [1,2]. Zánět je klíčovou hnací silou patogeneze BPH; podporuje proliferaci epiteliálních a stromálních hladkých svalů a fibrotickou remodelaci. Antiinfekční a protizánětlivé strategie jsou proto účinné pro prevenci a léčbu BPH [3,4].

IL-6 je pleiotropní prozánětlivý cytokin široce exprimovaný v tkáňových buňkách. Aktivuje STAT3 ke spuštění zánětlivých programů [5]. Inhibice aktivace IL-6/STAT3 snižuje downstream prozánětlivé mediátory, přerušuje zánětlivé kaskády, snižuje imunitní infiltraci a fibrózu spojenou s hypertrofií a nakonec zpomaluje progresi BPH [6,7]. Proto je IL-6/STAT3 racionálním terapeutickým cílem u BPH.

Yishen Tonglong Decoction je klasická čínská bylinná receptura s tradiční funkcí vyživování jinu a podpory jangu, tonizující Qi a ledviny a podporující krevní oběh s úlevou od vlhkosti. Klinicky se používá při dysurii v důsledku vlhkého tepla a stáze krve s nedostatkem Qi v ledvinách a bylo hlášeno, že zmírňuje zánět prostaty a hyperplastické změny BPH [8]. Kromě BPH inhibuje proliferaci buněk lidského karcinomu prostaty, podporuje apoptózu a potlačuje invazi a migraci [9]. Farmakologie sítě a molekulární dokování naznačují, že mezi klíčové cíle relevantní pro modulaci onemocnění prostaty patří mimo jiné AKT1, IL-6 a VEGFA [10]. Na základě tohoto teoretického zdůvodnění a předchozích důkazů jsme předpokládali, že odvar Yishen Tonglong zlepšuje BPH potlačením signalizace IL-6/STAT3. Tuto hypotézu jsme testovali na potkaním modelu BPH.

Materiály a metody

Zvířata

Samci krys SD, stupeň SPF, 200–230 g, staří 6–7 týdnů, byli získáni od Daoke Pharmaceutical Technology (Guangdong) Co., Ltd. (SCXK [Yue] 2022-0060). Potkani byli chováni v počtu méně než nebo rovných 4 na klec při 12hodinových cyklech světlo/tma, 50–60% vlhkosti a 23–25 stupňů.

 

Reagencie a nástroje

 

Surové byliny z odvaru Yishen Tonglong: Anemarrhena asphodeloides (Zhi Mu), Phellodendron chinense (Huang Bai), Cinnamomum cassia (Rou Gui), připravený kořen Rehmannia glutinosa (Shu Di Huang), Cornus officinalis (Shan Zhu Yu), Dioscorea opposita (Shanoo cosue), Poriao coshan Yauu kůra suffruticosa (Mu Dan Pi), Achyranthes bidentata (Niu Xi), Aconitum carmichaeli zpracovaný postranní kořen (Fu Zi), Sparganium stoloniferum (San Leng), Curcuma zedoaria (E Zhu), semeno Prunus persica (Tao Ren), semena Vaccaria segetalis Xingautic (Wange-Algaism) Xie). Pochází od společnosti Beijing Tongrentang (Anguo) Chinese Herbal Slices Co., Ltd.

Colivelin (HY-P1061), MCE (USA).

Testosteron propionát (čistota 98 ​​%, T7260); Soupravy ELISA pro potkaní IL‑1 (SEKR-0002), E2 (SEKR-0107), T (SEKSM-0003), Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

HE barvicí souprava (ab245880), anti-p-STAT3 (ab76315), Massonova sada (ab150669), anti-STAT3 (ab68153), anti-kolagen I (ab270993), anti-Ki-67 (ab16667), anti-kolagen III (ab18493key), H1849RP-33, H184999 anti-králičí sekundární (ab205722), potkaní IL-6 ELISA (ab234570), Abcam (USA).

Anti‑aktin (AF5003), Beyotime (Shanghai).

Parafínový mikrotom HS‑2205 (Olabao, Jinan), mikroskop KP‑PH100S (Shenzhen KEPUS), čtečka mikrodestiček UMR‑9600 (Hangzhou Youmi), PowerPac Basic 1645050 a zdroje PROTEAN (Bio‑Rad, USA).

Model a seskupení BPH

Krysy byly anestetizovány pentobarbitalem sodným (45 mg/kg, 3 % hmotn./obj., intraperitoneálně), varlata byla vyjmuta a chirurgicky odstraněna. Po 3 dnech zotavení krysy dostávaly denně subkutánní injekce testosteron propionátu (5 mg/kg v olivovém oleji) po dobu 21 dnů. Hrubé zvětšení a histopatologická hyperplazie potvrdily úspěch modelování BPH [11]. Falešné krysy podstoupily incizi šourku bez orchidektomie a dostaly vehikulum olivový olej.

 

Příprava a administrace

Jeden předpis odvaru Yishen Tonglong obsahoval: Zhi Mu, Huang Bai, Shan Zhu Yu, Shan Yao, Fu Ling, Mu Dan Pi, Wang Bu Liu Xing, Ze Xie (každý 15 g); Niu Xi, Shu Di Huang, Tao Ren (každý 20 g); Fu Zi, San Leng, E Zhu, Rou Gui (každý 10 g). Byliny se dvakrát odvařily vodou, filtráty se spojily a zakoncentrovaly na 1,5 nebo 3,0 g/ml. Kolivelin byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku na 0,1 mg/ml.

Skupiny s nízkou a vysokou dávkou odvaru: žaludeční sondou 15 nebo 30 g/kg (10 ml/kg při 1,5 nebo 3,0 g/ml), plus intraperitoneální fyziologický roztok (10 ml/kg).

Skupina colivinu: fyziologický roztok žaludeční sondou (10 ml/kg) plus intraperitoneální kolivelin 1 mg/kg (10 ml/kg 0,1 mg/ml).

Skupina s vysokou dávkou + Colivelin: žaludeční sonda 30 g/kg odvar plus Colivelin 1 mg/kg ip

Simulované a modelové skupiny: fyziologický roztok žaludeční sondou a ip fyziologický roztok (10 ml/kg).
Všechny léčby byly jednou denně po dobu 21 dnů.

 

index prostaty a E2/T; Sbírka vzorků

Dvacet čtyři hodin po posledním ošetření byly krysy anestetizovány (jak je uvedeno výše). Tělesná hmotnost a vlhká hmotnost prostaty byly zaznamenány pro výpočet PI=vlhká hmotnost prostaty/tělesná hmotnost. Byla odebrána krev z břišní aorty, odstředěna (2000 ot./min, 15 minut), čímž bylo získáno sérum. E2 a T byly měřeny pomocí ELISA a vypočteny E2/T; zbývající sérum bylo skladováno při -80 stupních. Přibližně 0,7 g tkáně prostaty bylo bleskově zmraženo v kapalném dusíku pro proteinové testy; zbytek byl fixován, dehydratován, zalitý do parafínu a nařezán na ~5 μm.

ON a Massonovo barvení

Po deparafinizaci v xylenu a odstupňovaných ethanolech (100%, 90%, 80%, 75%) následovala hydratace. Řezy byly obarveny soupravami HE a Masson's podle pokynů výrobce (každé 3 sklíčka), poté promyty, dehydratovány, vyčištěny a upevněny pro mikroskopii.

 

Imunohistochemie pro buněčnou proliferaci

Po deparafinizaci/hydrataci byly řezy ošetřeny 3% H2O2, blokovány kozím sérem a inkubovány přes noc s anti-Ki-67 (1:150). K detekci byla použita souprava SP s DAB chromogenem. Snímky byly získány a optická hustota Ki-67 kvantifikována pomocí ImageJ.

 

ELISA na IL-6 a IL-1 v prostatě a séru

Zmrazená tkáň prostaty byla rozemleta, homogenizována v RIPA pufru a odstředěna (3000 otáček za minutu, 20 minut), aby se získaly celkové proteinové lyzáty. Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí BCA. Alikvoty (0,2 ml) tkáňového lyzátu a rozmraženého séra byly analyzovány na IL-6 a IL-1 pomocí ELISA.

Western blot pro kolagen I/III a proteiny dráhy IL-6/STAT3
Denaturované vzorky (100 stupňů) byly separovány pomocí SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózu. Membrány byly rozděleny podle molekulové hmotnosti pro kolagen I, kolagen III, ‑aktin, IL‑6, STAT3 a p‑STAT3. Po 3% blokaci BSA byly aplikovány primární protilátky a následně sekundární protilátka konjugovaná s HRP. Pásy byly vizualizovány chemiluminiscencí a kvantifikovány pomocí ImageJ.

 

Statistika

Data byla analyzována pomocí SPSS 26.0 s jednocestnými testy ANOVA a SNK-q post hoc.

 

Výsledky

 

Úspěšnost modelování BPH: Ve srovnání se simulací vykazovala modelová skupina zjevné zvýšení velikosti prostaty a histologické hyperplazie a fibrózy. PI, Ki‑67 optická hustota, prostatický/sérový IL‑6 a IL‑1, kolagen I/III, IL‑6 a p‑STAT3/STAT3 byly všechny významně zvýšeny, zatímco E2/T bylo sníženo (P < 0,05).

Terapeutické účinky odvaru Yishen Tonglong: Dávky 15 i 30 g/kg zmírnily zvětšení prostaty a fibrózu. Tato léčba významně snížila PI, Ki-67, IL-6, IL-1, kolagen I/III, protein IL-6 a p-STAT3/STAT3 a zvýšila E2/T (P < 0,05). Vysoká dávka vyvolala lepší účinky než nízká dávka (P < 0,05).

Účinky aktivace STAT3: Colivelin zhoršil hyperplazii a fibrózu prostaty a dále zvýšil zánětlivé a fibrotické markery při současném snížení E2/T oproti modelu (P < 0,05).

Antagonismus Colivelinem: Současná léčba Colivelinem oslabila přínosy odvaru z vysokých dávek, zvýšila zánětlivé/fibrotické indexy a snížila E2/T ve srovnání se samotným odvarem ve vysokých dávkách (P < 0,05).

 

Diskuse

Mechanické zdůvodnění: Osa IL‑6/STAT3 je centrální zánětlivá dráha, která se podílí na remodelaci tkáně prostaty. Vazba IL‑6 aktivuje signalizaci JAK/STAT3, řídí transkripci prozánětlivých a profibrotických genů, podporuje epiteliální/stromální proliferaci, infiltraci imunitních buněk a ukládání extracelulární matrix. Naše zjištění – zlepšení pomocí bylinné receptury a zhoršení kvality pomocí aktivátoru STAT3 – podporují kauzální mechanickou souvislost, pomocí které odvar Yishen Tonglong zmírňuje BPH tlumením aktivace IL-6/STAT3.

 

Perspektiva bylinné formule (bylina na léčení problémů s prostatitidou): Složky bylin poskytují doplňkové účinky související s BPH a zánětem podobným prostatitidě:

Čištění vlhkého tepla a protizánětlivé: Zhi Mu (Anemarrhena), Huang Bai (Phellodendron), Mu Dan Pi (kůra Paeonia), Ze Xie (Alisma).

Tonifikace Qi/ledvin a endokrinní modulace: Shu Di Huang (Rehmannia), Shan Zhu Yu (Cornus), Shan Yao (Dioscorea), Fu Ling (Poria).

Aktivace krve a antifibrotický potenciál: San Leng (Sparganium), E Zhu (Zedoary), Tao Ren (jádro broskve), Wang Bu Liu Xing (Vaccaria).

Zahřívání Yang a zlepšení mikrocirkulace: Rou Gui (skořice), Fu Zi (Aconite, zpracované).

Podpora šlach/kostí a pánevní oběh: Niu Xi (Achyranthes).

Tato synergie může společně snížit zánětlivé cytokiny (IL-6, IL-1), proliferaci (Ki-67) a fibrózu (kolagen I/III), což je v souladu se supresí signalizace IL-6/STAT3 pozorovanou u Western blotů. Nárůst E2/T naznačuje částečnou rebalancování prostředí pohlavních steroidů, což může také ovlivnit dynamiku růstu prostaty.

Klinický překlad a omezení: I když jsou tato preklinická data slibná pro BPH a potenciálně pro zánět podobný prostatitidě, extrapolace na člověka vyžaduje opatrnost. Konverze dávek, kontrola kvality přípravků obsahujících více bylin a interakce bylina-lék vyžadují další studium. Nicméně důkazy zaměřené na dráhu (prospěch s odvarem, poškození aktivací STAT3 a výsledky dráhy) posilují teoretický základ pro klinické zkoumání tohoto bylinného přístupu k léčení problémů s prostatitidou a BPH.

 

Závěr

Yishen Tonglong Decoction zmírňuje hyperplazii prostaty a fibrózu u BPH potkanů ​​inhibicí aktivace IL-6/STAT3 a snížením zánětlivé a profibrotické signalizace s účinností závislou na dávce. Tyto nálezy poskytují mechanickou podporu pro jeho tradiční použití a moderní zdůvodnění na základě cesty pro další vývoj jako bylinné terapie pro BPH a stavy související s prostatitidou.

 

Reference

[1–13] Jak je uvedeno v původním textu.