Objasnění role syntézy bílkovin v konsolidaci paměti závislé na hippocampu ve dne i v noci

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní

Je široce uznáváno, že de novo syntéza proteinů je zásadní pro tvorbu a konsolidaci dlouhodobých vzpomínek. Zatímco bazální aktivita mnoha signálních kaskád, které modulují syntézu proteinů, kolísá cirkadiánním způsobem, není jasné, zda se časová dynamika konsolidace paměti závislé na syntéze proteinů liší v závislosti na denní době. Přesněji řečeno, není jasné, zda inhibice syntézy proteinů ovlivňuje konsolidaci paměti závislou na hippocampu u hlodavců rozdílně během dne (tj. neaktivní fáze s nadbytkem spánku) a noci (tj. aktivní fáze s malým spánkem). K vyřešení této otázky byli samci a samice myší C57Bl6/J trénováni v kontextuálním úkolu podmiňovat strach na začátku konce fáze světla. Zvířata obdržela jednu systémovou injekci inhibitoru syntézy proteinů anisomycin nebo vehikulum přímo, 4, 8 hodin nebo 11,5 hodin po tréninku, a paměť byla hodnocena po 24 hodinách. Zde ukazujeme, že inhibice syntézy proteinů narušila konsolidaci vzpomínek na kontext a strach selektivně, když byl inhibitor syntézy proteinů podán v prvních třech bodech, bez ohledu na načasování tréninku. I když bazální aktivita signálních drah regulujících de novo syntézu proteinů může kolísat v průběhu 24-hodinového cyklu, tyto výsledky naznačují, že časová dynamika konsolidace paměti závislé na syntéze proteinů je podobná pro denní i noční učení .

KLÍČOVÁ SLOVA anisomycin, hippocampus, paměť, myši, syntéza proteinů

desertliving cistanche doplněk: zlepšit paměť

1. ÚVOD

Schopnost vytvářet nové vzpomínky je zásadní pro adaptaci zvířat na složité a často se měnící prostředí (Bruel-Jungerman, Davis, & Laroche, 2007). Tvorba nových vzpomínek zahrnuje širokou škálu molekulárních a buněčných procesů (Asok, Leroy, Rayman, & Kandel, 2019; Nadel, Hupbach, Gomez, & Newman-Smith, 2012). Procesy paměti lze rozdělit do různých fází a zahrnují následující: (a) získávání nových informací, (b) konsolidace krátkodobých do dlouhodobých pamětí a (c) získávání uložených informací (Abel & Lattal, 2001). Tyto procesy probíhají v různých časových rámcích a závisí na různých molekulárních mechanismech, i když některé základní mechanismy se mohou překrývat (Abel & Lattal, 2001; Akkerman, Blokland, & Prickaerts, 2016).

Počáteční získávání senzorického vstupu probíhá v okamžiku, kdy je prezentována nová informace a zahrnuje zakódování těchto informací (Abel & Lattal, 2001; Tonegawa, Pignatelli, Roy, & Ryan, 2015). Konsolidace paměti začíná bezprostředně po akvizici (Abel & Lattal, 2001; Havekes, Meerlo, & Abel, 2015). Během tohoto procesu se počáteční labilní paměť stabilizuje na paměť dlouhodobou a tento proces je citlivý na narušení (Abel & Lattal, 2001; Havekes et al., 2015). Následně, je-li to nutné, lze k uloženým informacím přistupovat a vyvolat je během vyhledávání (Abel & Lattal, 2001; Havekes et al., 2015).

Hipokampus kriticky přispívá k utváření deklarativních a epizodických vzpomínek včetně prostorových a kontextových (Daumas, Halley, Frances & Lassalle, 2005; Eichenbaum & Cohen, 2014; Morris, Garrud, Rawlins & O'Keefe, 1982; Moser & Moser, 1998; Nadel a Moscovitch, 1997; Oliveira, Hawk, Abel a Havekes, 2010; Phillips & LeDoux, 1992; Scoville a Milner, 1957; Squire, 1992). Často používaným paradigmatem k objasnění molekulárních základů kontextově specifických vzpomínek je úloha kontextového podmiňování strachu (CFC), která se opírá jak o hippocampus, tak o amygdalu (Daumas a kol., 2005; Havekes, Park, Tolentino a kol. , 2016a; Kochi, Thompson, Fricke, Postle a Quinn, 2015; Parsons, Gafford, Baruch, Riedner a Helmstetter, 2006; Phillips & LeDoux, 1992; Rudy, Barrientos a O'Reilly, 2002). Nácvik tohoto paradigmatu vede ke spojení kontextu-strachu podmiňovacího boxu (podmíněný stimul, CS) s neočekávaným nepříznivým stimulem, často mírným šokem do nohy (nepodmíněný stimul, US).

Po opětovném vystavení stejnému kontextu myši, které se úspěšně naučily spojovat CS s USA, vykazují vysoké úrovně zmrazení (tj. úplný nedostatek pohybu s výjimkou respiračního chování), což ukazuje na kontext-strachovou paměť. Vzhledem k tomu, že k vytvoření robustní kontextové paměti strachu je zapotřebí pouze jediné školení, je tento test ideální pro zkoumání molekulárních mechanismů přispívajících k různým fázím paměti. Konsolidace stabilních, přirozeně obnovitelných dlouhodobých vzpomínek, včetně těch závislých na správné funkci hipokampu, vyžaduje de novo syntézu proteinů (Bourtchouladze et al., 1998; Davis & Squire, 1984; Jarome & Helmstetter, 2014; Lattal, Honarvar a Abel, 2004; Ryan, Roy, Pignatelli, Arons a Tonegawa, 2015). Blokování syntézy proteinů pomocí inhibitorů syntézy proteinů totiž zeslabuje tvorbu objektových pamětí (Rossato et al., 2007), prostorových pamětí (Artinian et al., 2008) a asociací kontextu a strachu (Bourtchouladze et al., 1998). Je zajímavé, že regulace procesů zapojených do učení a paměti, jako je syntéza proteinů, se může během dne a noci lišit (Aten a kol., 2018; Frank, 2016; Gerstner & Yin, 2010; Jilg a kol., 2010; Kim a kol., 2019; Nakanishi a kol., 1997; Ramm & Smith, 1990; Rawashdeh, Jilg, Maronde, Fahrenkrug a Stehle, 2016; Snider, Sullivan a Obrietan, 2018). Například hladiny hipokampálního cAMP, stejně jako fosforylace mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) a proteinu vázajícího prvek cAMP (CREB) vykazují denní oscilace, což může naznačovat cirkadiánní regulaci cAMP/MAPK/CREB drah (Eckel- Mahan a kol., 2008; Mizuno & Giese, 2005; Rawashdeh a kol., 2016; Snider a kol., 2018; Trifilieff a kol., 2006).

Důležité je, že regulace signální dráhy savčího cíle rapamycinového komplexu 1 (mTORC1), která je klíčová pro syntézu proteinů iniciací translace, také vykazuje denní oscilace (Jouffe et al., 2013; Robles, Humphrey, & Mann, 2017; Saraf, Luo, Morris a Storm, 2014). Nedávno se ukázalo, že akumulace Per2, proteinu jádrových hodin, vede k inaktivaci mTORC1, což snižuje translaci proteinů (Wu et al., 2019). Regulace procesů, které jsou důležité pro učení a paměť, tedy vykazuje oscilace ve dne i v noci. Navzdory těmto pozorováním není jasné, zda tyto denní oscilace v bazální aktivitě signálních drah kritických pro učení a paměť ovlivňují časovou dynamiku konsolidace paměti závislé na syntéze proteinů. Jinými slovy, znamená denní kolísání bazální aktivity těchto drah, že se zpracování a ukládání nových informací, které závisí na syntéze proteinů, také mění v průběhu dne? Abychom na tuto otázku odpověděli, hodnotili jsme u myší, zda inhibice syntézy proteinů ovlivňuje konsolidaci paměti podobně během světlé fáze (klidová fáze) a tmavé fáze (aktivní fáze). Zvířata byla trénována na začátku nebo na konci světelné fáze a inhibitor syntézy proteinů anisomycin nebo vehikulum byly systémově podávány v různých časových bodech po tréninku v úloze kontextového podmiňování strachu závislém na hippocampu.

extrakt z cistanche: zlepšuje paměť

2. MATERIÁLY A METODY

Subjekty Celkem 64 samců a 64 samic myší C57BL/6J bylo získáno ve věku 6 týdnů (Janvier Labs) a během experimentu byly umístěny v párech stejného pohlaví. Klece obsahovaly kartonovou roli, standardní podestýlku a hnízdní materiál. Jídlo a voda byly k dispozici ad libitum. Během experimentu byly myši umístěny při konstantní teplotě (21 stupňů) a v režimu 12-h světlo/12-h tma se světly v 10:00 pro zvířata, která byla trénována na začátku fáze světla a světla se rozsvítí ve 22 hodin pro zvířata trénovaná na konci fáze světla (viz další odstavec). Experimenty byly prováděny, když byla zvířata stará 12–16 týdnů. Všechny popsané postupy byly schváleny národním ústředním orgánem pro vědecké postupy na zvířatech (CCD) a institucionálním orgánem pro dobré životní podmínky zvířat (IvD, University of Groningen, Nizozemsko).

2.2 Experimentální design

Tato studie se skládala ze 16 skupin myší, každá s celkem 7–8 zvířaty (stejní samci a samice), a zvířata byla náhodně rozdělena do skupin. Polovina skupin byla trénována v úloze CFC na začátku fáze světla, to znamená na začátku jejich cirkadiánní klidové fáze, a polovina zvířat byla trénována v poslední hodině fáze světla, tj. před začátkem jejich aktivní fáze. Druhý časový bod byl zvolen proto, aby nebylo nutné tato zvířata vystavovat světlu, když by normálně nevnímala, což by byl případ, kdyby zvířata byla trénována na začátku ve fázi tmy. Oběma skupinám myší byl injekčně podán inhibitor syntézy proteinů (viz níže) nebo roztok vehikula buď přímo ("T0"), 4 hodiny po tréninku ("T4"), 8 hodin po tréninku ("T8") nebo 11,5 hodiny po tréninku ("T11.5"). Ve všech případech proběhl test CFC 24 hodin po úvodním tréninku. Přehled experimentálního designu viz obrázek 1.

2.3 Přivykání a podmiňování strachu

Tři po sobě jdoucí dny před úkolem CFC byla zvířata transportována do experimentální místnosti a experimentátor s nimi manipuloval 2 minuty denně. Poslední den zvykání byla zvířata zvážena a obdržela značku na ocasu s černým permanentním značkovačem pro identifikaci. Kromě toho, den před tréninkem CFC myši také dostaly subkutánní falešnou injekci 50 ul 0,9 procenta fyziologického roztoku, aby si na tento postup zvykly. Zvířata byla trénována v úloze CFC pomocí protokolu pro kondicionování popředí (Havekes et al., 2012; Havekes, Park, Tolentino, et al., 2016a). V tréninkový den byly myši umístěny do boxu pro kondicionování strachu (Ugo Basile). Po 2,5 minutách byly myši vystaveny jedinému 2-s šoku do nohy 0,75 mA. Třicet sekund po šoku byly myši vráceny do ustájovací komory a dostaly subkutánní injekci anisomycinu nebo vehikula ve specifickém časovém bodě, jak je znázorněno na obrázku 1. Dvacet čtyři hodin po tréninku byla zvířata znovu vystavena kondicionačnímu boxu. 5 po sobě jdoucích minut, bez výboje. Před tréninkem a testovací relací každé nové myši byl box pro úpravu strachu vyčištěn 70% etanolem. Podmiňování strachu bylo hodnoceno hodnocením mrazivého chování, definovaného jako úplný nedostatek pohybu s výjimkou respiračního chování, které bylo stanoveno pomocí softwaru EthoVision XT (Noldus Information Technology). Tento software poskytuje spolehlivá měření chování při zamrzání (Pham, Cabrera, Sanchis-Segura, & Wood, 2009).

2.4 Léčba drogami

Zvířatům byl subkutánně injikován anisomycin (150 mg/kg; A&E Scientific, Marcq, Belgie) k dočasné inhibici syntézy proteinů nebo ekvivalentní objem roztoku vehikula (0,9% fyziologický roztok). Anisomycin byl rozpuštěn v 0,9% solném roztoku za použití 3,7% HC1, načež bylo pH upraveno na 7,4 pomocí 4% NaOH. V použité koncentraci anisomycin inhibuje syntézu cerebrálních proteinů u myší po dobu 15–45 minut (Davis & Squire, 1984). Injekce byly prováděny v ubytovně experimentátorem odlišným od toho, který prováděl behaviorální úkol.

2.5 Statistika

Úrovně zmrazování delta byly získány normalizací chování zvířete při zmrazování během testu na základní úrovně (= před šokem) úrovně zmrazování. Rozdíly v chování normalizovaného zmrazení mezi myšmi s injekcí anisomycinu a kontrolními myšmi na fázi a časový bod byly vypočteny pomocí ANOVA. Jednocestná ANOVA byla použita k výpočtu rozdílů mezi časovými body pro zvířata, kterým bylo aplikováno vehikulum, na fázi. K testování účinku sexu byla použita jednocestná ANCOVA mezi subjekty. Kromě toho, abychom vypočítali relativní rozdíly mezi zvířaty s injekcí anisomycinu a vehikulem, nejprve jsme zprůměrovali myši, kterým bylo injikováno vehikulum na časový bod, na fázi. Poté jsme odečetli všechny jednotlivé datové body anisomycinu od jejich odpovídajícího průměru vehikula. Byla provedena dvoucestná ANOVA využívající časový bod a fázi jako nezávislé a anisomycin normalizovaný na hladiny zmrazení vehikula jako závislého, aby se zjistilo, zda účinek anisomycinu na zmrazení závisí na časovém bodu injekce, (2) světlé nebo tmavé fázi a (3) zda došlo k interakčnímu účinku časového bodu a fáze.

Pět zvířat vykazovalo během předšokového tréninkového intervalu velmi vysoké hladiny mrazu, tj. více než 2 SD nad průměrem skupiny, a byla proto z analýzy vyloučena (analýza extrémních hodnot SPSS). Těchto pět zvířat patřilo do skupin: Light phase, T0, Anisomycin; Tmavá fáze, T4, Anisomycin; Temná fáze, T8, Vozidlo; tmavá fáze, T8, anisomycin; a temná fáze, T11.5, anisomycin. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM, včetně pirátského grafu ukazujícího rozložení jednotlivých datových bodů. Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 25.0 (IBM Corp). Data byla vytvořena v R (Boston, MA, USA) pomocí yardového balíčku (Phillips, 2017). Rozdíly byly považovány za statisticky významné, když p <>

cistanche doplněk: zlepšení paměti

3 VÝSLEDKY

Nejprve jsme zkoumali, ve kterých časových bodech inhibice syntézy proteinů narušila konsolidaci paměti závislou na hippocampu, když byla zvířata trénována na začátku fáze světla (obrázek 1). Zvířata dostávala subkutánní vehikulum nebo injekce anisomycinu po kontextovém podmiňování strachu a 24 hodin po tréninku byla zvířata znovu vystavena CFC komoře a byly měřeny úrovně zmrazení. Nebyly zjištěny žádné rozdíly v úrovních zmrazení před šokem během tréninku na začátku fáze světla (T0: kontrola 0,9 ± 0,3 procenta (n {{1 0}}), anisomycin 0,7 ± 0,3 procenta (n=7), ANOVA F < 1;="" t4:="" kontrola="" {{2{{25}="" }}},7="" ±="" 0,2="" procenta="" (n="8)," anisomycin="" 1,7="" ±="" 0,7="" procenta="" (n="8)," anova="" f="1" 0,7;="" t8:="" kontrola="" 1,3="" ±="" 0,3="" procenta="" (n="8)," anisomycin="" 1,2="" ±="" 0,4="" procenta="" (n="" {{40}}),="" anova="" f="">< 1;="" t11.5:="" kontrola="" 1,6="" ±="" 0,4="" procenta="" (n="8)," anisomycin="" 0,8="" ±="" 0,2="" procenta="" (n="8)," anova="" f="2,9;" viz="" také="" obrázek="" s1a).="" následně="" jsme="" vypočítali="" úrovně="" delta="" zmrazování="" normalizací="" chování="" zvířete="" při="" zmrazování="" během="" testu="" na="" základní="" (před="" šokem)="" úrovně="">

Jak je znázorněno na obrázku 2, anisomycin úspěšně inhiboval konsolidaci paměti CFC, když byl injikován přímo, 4 hodiny a 8 hodin po tréninku (F1,14=24.6, p <.001; f1,15="6.4" ,="" p="">< 0,05;="" f1,="" 15="11" 0,2,="" p="">< 0,01;="" obrázek="" 2a).="" anisomycin="" však="" nezhoršil="" konsolidaci="" paměti,="" když="" byl="" injikován="" 11,5="" hodiny="" po="" tréninku="" (f1,="" 15="0.1," p=""> 0.5; obrázek 2a). Důležité je, že mezi různými časovými body u zvířat, kterým bylo aplikováno vehikulum, nebyl žádný rozdíl v úrovních zmrazení (F3, 31=0.9, p > 0,1; obrázek 2a). Inhibice syntézy proteinů přímo po tréninku nebo 4 a 8 hodin po tréninku tedy účinně narušila konsolidaci paměti v lehké fázi. Naproti tomu podání inhibitoru syntézy proteinů 11,5 hodiny po tréninku neovlivnilo konsolidaci vzpomínek na kontext a strach.

V další sadě studií jsme zkoumali, zda inhibice syntézy proteinů narušila konsolidaci paměti ve stejných časových bodech po tréninku, když byl trénink prováděn těsně před nástupem fáze tmy, tedy aktivní fáze zvířat (obrázek 1). Zvířata se opět nelišila v úrovních zmrazení před šokem během tréninku na konci fáze světla (T0: kontrola 2,4 ± 0,6 procenta (n=8), Anisomycin 2,3 ± {{10}},6 procent (n=8), ANOVA F < 1;="" t4:="" kontrola="" 2,7="" ±="" 0,8="" procent="" (n="8" ),="" anisomycin="" 4,6="" ±="" 0,7="" procenta="" (n="7)," anova="" f="2,9;" t8:="" kontrola="" {{30}},8="" ±="" {{="" 44}},2="" procenta="" (n="7)," anisomycin="" 1,6="" ±="" 0,5="" procenta="" (n="7)," anova="" f="1,5;" t11,5:="" kontrola="" 1,1="" ±="" 0,3="" procenta="" (n="8)," anisomycin="" 0,8="" ±="" 0,2="" procenta="" (n="7)," anova="" f="">< 1;="" viz="" také="" obrázek="" s1b).="" jak="" je="" vidět="" na="" obrázku="" 2b,="" podání="" anisomycinu="" přímo,="" 4="" a="" 8="" hodin="" po="" tréninku="" během="" temné="" fáze,="" inhibovalo="" konsolidaci="" paměti="" cfc,="" v="" tomto="" pořadí="" (f1,15="14.8," p=""><.01; f1,{{62="" }},4,="" p="">< 0,05;="" f1,="" 13="23,9," p="">< 0,001;="" obrázek="" 2b).="" nicméně,="" když="" byl="" anisomycin="" aplikován="" 11,5="" hodiny="" po="" tréninku,="" nevedl="" k="" deficitu="" paměti="" (f1,15="1.0," p=""> 0.1; obrázek 2b).

Kromě toho zvířata s injekcí vehikula nevykazovala žádný rozdíl v úrovních zmrazení mezi různými časovými body injekce (F3, 30=1.1, p > 0.1; obrázek 2b). Tyto údaje tedy naznačují, že inhibice syntézy proteinů přímo po tréninku, stejně jako 4 a 8 hodin po tréninku, zeslabuje konsolidaci paměti, v tmavé a světlé fázi podobným způsobem. Kromě toho jsme vypočítali relativní rozdíly mezi zvířaty s injekcí anisomycinu a vehikula tak, že jsme nejprve zprůměrovali myši, kterým bylo injikováno vehikulum, za časový bod, na fázi.

Poté jsme odečetli všechny jednotlivé datové body anisomycinu od jejich odpovídajících průměrů vehikula a vynesli to do grafu pro světlou i tmavou fázi (obrázek 2c). V souladu s předchozími zjištěními existuje významný vliv časového bodu injekce, což naznačuje, že účinek anisomycinu na hladiny zmrazení závisí na době podání (F3, 52=10 0,1, p < 0,001;="" obrázek="">

Kromě toho neexistuje žádný obecný účinek fáze, což naznačuje, že úrovně zmrazování delta se mezi světlou a tmavou fází neliší (F1,52=3.2, p > .05; obrázek 2c) . Kromě toho neexistuje žádný interakční účinek mezi fází a časovým bodem injekce (F3, 52=1 0,0, p < 0,1;="" obrázek="" 2c).="" celkově="" tyto="" dodatečné="" analýzy="" naznačují,="" že="" účinek="" anisomycinu="" na="" hladiny="" delta="" zmrazení="" závisí="" pouze="" na="" časovém="" bodu="" injekce,="" bez="" ohledu="" na="" fázi,="" což="" je="" v="" souladu="" s="" naším="" závěrem="" založeným="" na="" analýzách="">

Nakonec jsme hodnotili, zda rozdíly mezi pohlavími ovlivnily úrovně zmrazení a odpověď na inhibici syntézy proteinů. Nejprve jsme provedli jednosměrnou ANCOVA mezi subjekty, abychom prozkoumali účinek inhibice proteinu na hladiny zmrazení během testovací fáze (tj. 24 hodin po tréninku) kontrolující účinek sexu. Analýza ukázala, že pohlaví významně nesouvisí s úrovněmi zmrazení (F1, 120=2 0,7, p > 0,1; data oddělená pro pohlaví nejsou uvedena). Celkově inhibice syntézy proteinů snížila hladiny zmrazení v obou fázích podobným způsobem nezávisle na pohlaví.

cistanche

4. DISKUZE

Cílem této studie bylo získat vhled do role syntézy proteinů při konsolidaci vzpomínek závislých na hipokampu v různých fázích 24-hodinového cyklu. Za tímto účelem jsme trénovali myši v úloze CFC buď na začátku nebo na konci fáze světla a inhibovali syntézu proteinů v různých časových bodech po tréninku. Zjistili jsme, že inhibice syntézy proteinů narušila konsolidaci paměti CFC nezávisle na načasování tréninku, přímo, 4 a 8 hodin po tréninku. Tato data podtrhují důležitost de novo syntézy proteinů pro konsolidaci kontextových vzpomínek na strach a naznačují, že časová dynamika konsolidace kontextových vzpomínek strachu v závislosti na syntéze proteinů je podobná ve světlé a tmavé fázi.

Je zajímavé, že jsme zjistili, že blokování syntézy proteinů 8 hodin po tréninku CFC na začátku fáze světla narušilo konsolidaci paměti. Toto zjištění je poněkud překvapivé, protože předchozí práce odhalila, že paměť CFC je selektivně ovlivněna inhibicí syntézy proteinů buď přímo, nebo 4 hodiny, ale ne 8 hodin po tréninku (Bourtchouladze et al., 1998). Pokud jde o tento rozpor, je třeba poznamenat, že Bourtchouladze a jeho kolegové používali kondicionování na pozadí spíše než protokol kondicionování popředí. Během kondicionování na pozadí je US spárován s tónem, který funguje jako druhý CS navíc k tréninkovému kontextu.

Jemné rozdíly v tréninkovém protokolu CFC (v tomto případě přítomnost nebo absence tónu během výboje) tedy mohou změnit časovou dynamiku konsolidace paměti závislé na syntéze proteinů. Použití robustnějšího protokolu kondičního tréninku na pozadí (tj. s více výboji) má za následek konsolidaci vzpomínek na kontext a strach, které jsou narušeny léčbou anisomycinem bezprostředně po tréninku, ale ne v časovém bodě čtyř hodin (Bourtchouladze et al., 1998). Nicméně v souladu s našimi pozorováními Trifilieff et al. ukázaly, že trénink CFC vede k aktivaci dráhy ERK/CREB v oblasti CA1 hipokampu přibližně devět hodin po tréninku (Trifilieff et al., 2006).

Tato aktivace může přispět k de novo syntéze proteinů, které jsou klíčové pro konsolidaci kontextových vzpomínek na strach. V budoucích studiích by bylo zajímavé prozkoumat, jak jemné změny v CFC tréninkových protokolech ovlivňují časovou dynamiku konsolidace paměti závislé na syntéze proteinů a aktivační vzorce souvisejících signálních drah.

Jak již bylo zmíněno dříve, aktivita signálních drah zahrnujících MAPK, cAMP a PKA je kritická pro učení a paměť a mění se v průběhu cirkadiánního cyklu (Eckel-Mahan et al., 2008). Zatímco některé studie zkoumaly základní cirkadiánní rytmy signálních drah, jiné studie se zaměřily na plasticitu indukovanou učením. Kondicionování na pozadí je například spojeno s jedinou fází aktivace dráhy ERK/CREB v oblasti CA1 hippocampu přímo po tréninku. Zrušení párování tónu a US – to znamená, když je tón dán pseudonáhodně, nikoli společně s rázy – vede k paradigmatu, které je více srovnatelné s podmíněním popředí a protokolem, který byl použit v této studii.

To má za následek dvě odlišné vlny aktivace ERK/CREB v oblasti CA1: jedna přímo po tréninku a druhá přibližně devět hodin po tréninku (Trifilieff et al., 2006). Inhibice ERK/CREB během kterékoli z těchto fází byla dostatečná ke zhoršení tvorby paměti po nepárovém podmiňování strachu. Jak bylo uvedeno v předchozím odstavci, načasování těchto dvou vln aktivace ERK/CREB se zdá být srovnatelné s časovými body přímo a osm hodin po kontextuálním tréninku strachu v této studii, kdy konsolidace kontextových vzpomínek strachu závisí na de novo syntéza proteinů.

Signalizace ERK/CREB tedy může přispívat k de novo syntéze proteinů, které jsou klíčové pro konsolidaci kontextových vzpomínek na strach přímo nebo 8–9 hodin po tréninku. Syntéza proteinu v 4-h časovém bodě může být řízena jinými mechanismy nezávislými na ERK, jako je dráha PKA-CREB. Intrahippokampální injekce Rp-cAMP (inhibitor PKA) 4 hodiny po podmiňování strachu skutečně zhoršuje konsolidaci vzpomínek na kontext a strach (Bourtchouladze et al., 1998). Představu dvou vln syntézy proteinů podporuje další studie, která používala paradigma motorického učení (Peng & Li, 2009).

Je důležité si uvědomit, že je náročné oddělit cirkadiánní a/nebo denní vliv na konsolidaci paměti od změn v cyklu spánku/bdění (Snider et al., 2018). Spánek má silný vliv na paměťové procesy a vzpomínky závislé na hippocampu jsou náchylné ke ztrátě spánku (Graves, Heller, Pack, & Abel, 2003; Havekes a kol., 2014; Havekes, Park, Tudor a kol., 2016b; Raven, Zee, Meerlo a Havekes, 2017; Vecsey a kol., 2009). Například 5–6 hodin spánkové deprivace (SD) přímo po CFC tréninku zhoršuje konsolidaci paměti u myší i potkanů ​​(Graves et al., 2003; Hagewoud et al., 2010; Kreutzmann, Havekes, Abel, & Meerlo, 2015 Vecsey a kol., 2009). Důležité je, že tyto studie byly prováděny ve fázi světla, což je hlavní klidová fáze fáze spánku laboratorních potkanů ​​a myší.

Naproti tomu šest hodin spánkové deprivace přímo následující trénink na začátku fáze tmy, aktivní fáze, ve které hlodavci spí mnohem méně, konsolidaci paměti nenarušilo (Hagewoud et al., 2010). Pouze když byla zvířata zbavena spánku po dobu dvanácti hodin, pokrývajících celé temné období, bránilo to vytváření dlouhodobých CFC vzpomínek (Hagewoud et al., 2010). I když tato zjištění naznačují, že časová regulace molekulárních procesů, které jsou základem konsolidace paměti závislé na hippocampu, se může v aktivní a neaktivní fázi lišit v závislosti na množství spánku v těchto fázích, vyvolávají otázku, jak je možné, že syntéza proteinů inhibice ovlivňuje konsolidaci paměti nezávisle na denní době. Znamená to, že negativní důsledky ztráty spánku jsou alespoň částečně nezávislé na syntéze proteinů? Aby paměť mohla existovat, musí být vytvořena počáteční paměťová stopa z de novo proteinů, případně tvořících aktinová vlákna

vytváření nových páteří, tedy vytváření nových synaptických spojení. Proto inhibice syntézy proteinů přímo brání konsolidaci paměti, protože nové paměti nelze vytvořit. Tento proces zahrnuje a je citlivý na mnoho molekulárních konstruktorů modulujících tvorbu nových synapsí. Jedním příkladem takového molekulárního konstruktoru je kofilin. Kofilin je protein destabilizující aktin a po aktivaci rozkládá aktinová vlákna, což způsobuje ztrátu dendritických trnů (Bamburg & Wiggan, 2002; Bernstein & Bamburg, 2010). Krátká perioda SD ve světlé fázi zvyšuje aktivaci kofilinu, což nakonec způsobí ztrátu páteře (Havekes, Park, Tudor, et al., 2016b). Kromě toho SD snižuje signalizaci aktivity mTORC1 v hippocampu, ovlivňuje translaci, čímž také nepřímo snižuje syntézu proteinů, což může mít za následek poruchy paměti (Tudor et al., 2016).

Společně SD narušuje důležité molekulární mediátory synaptické plasticity, čímž nepřímo ovlivňuje ukládání paměti. To by mohlo vysvětlovat, proč SD zhoršuje paměť pouze ve fázi světla, kdy je tlak spánku vysoký, a zaměřuje se na konstruktéry místo na základní stavební bloky samotných pamětí (obrázek 3). Vzhledem k tomu, že ztráta spánku má silný vliv na učení a paměť (Havekes & Abel, 2017; Raven et al., 2017), lze se ptát, zda účinky anisomycinu na tvorbu paměti nejsou přímo způsobeny pouze inhibicí syntézy proteinů, ale možná částečně nepřímo ovlivněním spánku. Přestože jsme v naší studii v průběhu experimentu neměřili EEG ani pohyb, literatura ukazuje, že anisomycin může mít jemné účinky na spánek. Například zatímco spánek s nerychlými pohyby očí (NREM) je častěji uváděn jako neovlivněný, injekce anisomycinu mohou snížit spánek s rychlým pohybem očí (REM) (Drucker-Colin, Zamora, Bernal-Pedraza & Sosa, 1979; Gutwein , Shiromani a Fishbein, 1980; Rojas-Ramirez, Aguilar-Jimenez, Posadas-Andrews, Bernal-Pedraza a Drucker-Colin, 1977). Není však jisté, zda jsou tyto účinky na spánek dostatečně silné, aby vysvětlily deficity paměti v naší studii.

Navíc takový nepřímý účinek anisomycinu na paměť prostřednictvím změn spánku není podporován výsledky injekcí na konci fáze tmy, těsně před začátkem hlavní cirkadiánní fáze spánku. Pokud by anisomycin měl velké účinky na spánek, který by mohl narušit tvorbu paměti, dalo by se očekávat, že k tomu došlo i u injekcí v té době, což nebyl tento případ. Ačkoli, jak již bylo zmíněno dříve, nepřímé účinky anisomycinu na paměť jsou z velké části neznámé, zůstává jedním z nejrozšířenějších nástrojů pro manipulaci s proteinovou syntézou za účelem zkoumání paměťových procesů (Davis & Squire, 1984; Gold, 2008; Rudy, Biedenkapp , Moineau, & Bolding, 2006). Pomocí anisomycinu vědci zjistili, že syntéza proteinů je nezbytná pro udržení dlouhodobých vzpomínek. Bylo provedeno několik studií aplikujících anisomycin lokálně a tím zvýšení prostorového rozlišení v kombinaci s jeho již výhodným časovým rozlišením. Nedávno Ryan a spol. (2015) ukázali, že anisomycin narušil paměť, ale že tato amnézie mohla být obnovena, což znamená, že syntéza proteinů je důležitá pro strukturální posílení synapse, což je nezbytné při získávání paměti (Ryan et al., 2015). Jednou nevýhodou anisomycinu je, že je také schopen narušit základní neurobiologické funkce, například tím, že způsobí apoptózu (Iordanov et al., 1997), která může ovlivnit pohodu neuronů a tím přispět k poruchám paměti.

cistanche kapsle: zlepšují paměť

OBRÁZEK ​​2 Inhibice syntézy proteinů zeslabuje konsolidaci vzpomínek na kontext a strach v určitých časových bodech po tréninku, bez ohledu na denní dobu. Zvířata byla trénována v kontextuálním paradigmatu podmiňování strachu buď na začátku konce fáze světla. Injekce byly podávány buď přímo (T0), 4 hodiny (T4), 8 hodin (T8) nebo 11,5 hodiny (T11,5) po tréninku. Zvířata byla znovu vystavena stejnému kontextu 24 hodin po tréninku, během kterého byly měřeny úrovně zmrazení. Poté byly vypočteny hladiny zmrazování delta normalizací úrovní zmrazování během testu na základní linii (před šokem). (a) Úrovně zmrazování delta po kontextuálním tréninku strachu na začátku fáze světla a léčbě drogami během fáze světla. T0: vozidlo n=8, Anisomycin n=7 (p < .001);="" t4:="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="8" (p="0,024);" t8:="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="8" (p="0,005);" t11.5:="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="8" (p="0,912)." (b)="" úrovně="" zmrazování="" delta="" po="" kontextuálním="" tréninku="" strachu="" na="" konci="" fáze="" světla="" a="" léčbě="" drogami="" během="" fáze="" tmy.="" t0:="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="8" (p="0,002);" t4:="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="7" (p="0,017);" t8:="" vehikulum="" n="7," anisomycin="" n="7" (p="">< 0,001);="" t11,5;="" vehikulum="" n="8," anisomycin="" n="7" (p="0,168)." (c)="" úrovně="" zmrazování="" delta="" u="" zvířat="" ošetřených="" anisomycinem="" ve="" srovnání="" se="" zvířaty="" ošetřenými="" vehikulem.="" t0:="" světlá="" fáze="" n="7," temná="" fáze="" n="8;" t4:="" světlá="" fáze="" n="8," temná="" fáze="" n="7;" t8:="" světlá="" fáze="" n="8," temná="" fáze="" n="7;" t11.5:="" světlá="" fáze="" n="8," temná="" fáze="" n="7." panel="" a="" &="" b:="" data="" jsou="" vyjádřena="" jako="" průměr,="" plocha="" (pás)="" kolem="" průměru="" označuje="" sem,="" vyhlazená="" křivka="" hustoty="" (fazole)="" ukazuje="" úplnou="" distribuci="" dat="" a="" tečky="" označují="" jednotlivé="" datové="" body.="" chování="" při="" zamrzání="" bylo="" hodnoceno="" během="" 300="" s.="" *="" p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" podle="" výpočtu="" anova.="" panel="" c:="" všechna="" data="" jsou="" vyjádřena="" jako="" průměr="" ±="" sem.="" chování="" při="" zamrzání="" bylo="" hodnoceno="" během="" 300="" s.="" časový="" bod="" ***p="">< 0,001,="" fáze="" p="0,081," účinek="" interakce="" p="0,386," jak="" bylo="" vypočteno="" pomocí="" dvoucestné="" analýzy="">

Několik studií například ukázalo, že anisomycin narušuje základní membránové vlastnosti hipokampálních neuronů (Scavuzzo et al., 2019; Sharma, Nargang, & Dickson, 2012). Poruchy paměti pozorované po injekcích anisomycinu by proto mohly být ovlivněny anisomycinem vyvolanými změnami v nervové aktivitě. V naší studii jsme však v posledním časovém bodě nepozorovali žádné účinky anisomycinu, což naznačuje, že pokud anisomycin snížil základní buněčné vlastnosti, jsou tyto účinky v našem paradigmatu kontextuální úlohy podmiňování strachu téměř zanedbatelné. Přesto se doporučuje použití jiných specifičtějších inhibitorů, jako je rapamycin, který se specificky zaměřuje na mTORC1, aby se do značné míry vyloučily jakékoli účinky na základní fungování buněk.

Znalost dynamiky konsolidace paměti ve dne i v noci je velmi důležitá pro všechny studie, jejichž cílem je odhalit molekulární mechanismy, které jsou základem formování paměti. Budoucí výzkum by měl prozkoumat, zda jiné molekulární mechanismy podporující paměť, o nichž je známo, že jsou náchylné k SD, jsou rozdílně ovlivněny ve dne a v noci. Ty mohou zahrnovat transkripci, translaci, vazbu RNA a ubikvitinaci, jak odhalila genomická analýza (Vecsey et al., 2012). Kromě toho mohou budoucí studie využívat nové a sofistikovanější techniky, jako je optogenetika k označování neuronů způsobem závislým na aktivitě, aby se zjistilo, jak a kdy se určité vzpomínky vytvářejí a uchovávají v čase (Ryan et al., 2015; Tonegawa et al., 2015). Tyto technologické pokroky mohou vést k lepšímu pochopení molekulárních základů konsolidace paměti závislé na hippocampu ve dne i v noci.