Účinky extraktu Sargassum Thunbergii na bělení pleti a proti vráskám prostřednictvím inhibice TRP-1 a MMP

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Da-Hye Gam 1, Jae-Hyun Park 1, Ji-Woo Hong 1, Seong-Jin Jeon 1, Jun-Hee Kim 1 a Jin-Woo Kim 1,2,*

Abstraktní: Sargassum thunbergiise tradičně používá jako jedlý a léčivý materiál v inorientálních zemích. Nicméně,bělení kůžeaproti vráskámúčinky S. thunbergii nebyly dosud zkoumány. Tato studie byla provedena za účelem stanovení optimálních extrakčních podmínek pro produkci bioaktivních sloučenin s antioxidační aktivitou, stejně jako s bělícím a protivráskovým efektem pomocí ultrazvukem asistované extrakce (UAE) u S. thunbergii. Doba extrakce (5,30~18,7 min), teplota extrakce (22,4~79,6 ◦C) a koncentrace ethanolu (0.0~99,5 procenta), což jsou hlavní proměnné SAE, byly optimalizovány pomocí centrálního kompozitního designu. Kvadratické regresní rovnice byly odvozeny na základě experimentálních dat a vykazovaly vysoký koeficient determinace (R2 > 0,85), což prokazuje vhodnost pro predikci. Optimální podmínka SAE pro maximalizaci všech závislých proměnných, včetně aktivity vychytávání radikálů (RSA), inhibiční aktivity tyrosinázy (TIA) a inhibiční aktivity kolagenázy (CIA), byla identifikována jako doba extrakce 12,0 min, extrakční teplota 65,2 ◦C a ethanol 53,5 procenta. Za těchto podmínek byly RSA, TIA a CIA extraktu S. thunbergii 86,5 procenta, 88,3 procenta a 91,4 procenta, v tomto pořadí. Také jsme potvrdili, že extrakt S. thunbergii měl inhibiční účinky na expresi mRNA proteinu souvisejícího s tyrosinázou-1, matrix metaloproteinázy-1 a matrix metaloproteinázy-9, což jsou hlavní geny syntézy melaninu a hydrolýzy kolagenu . K identifikaci hlavních fenolických sloučenin v extraktu S. thunbergii byla použita kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie a kyselina kávová byla identifikována jako hlavní pík, což dokazuje, že složky s vysokou přidanou hodnotoubělení kůžeaproti vráskámefekty lze získat ze S. thunbergii a použít pro vývoj kosmetických materiálů.

klíčová slova: S. thunbergii; optimalizace;bělení kůže; proti vráskám; TRP-1; MMP-1; MMP-9

Kliknutím získáte výhody extraktu z cistanche pro bělení pokožky

1. Úvod

Melanogeneze je fyziologický proces, který vede k syntéze melaninových pigmentů [1]. Melanin je černý nebo hnědý pigment vylučovaný z melanocytů přítomných v bazální vrstvě epidermis a určuje barvu kůže, očí a vlasů [2]. Nadměrná tvorba melaninových pigmentů však může vést k onemocněním souvisejícím s hyperpigmentací, jako jsou maligní melanomy [3]. Tyrosináza, hlavní enzym v cestě biosyntézy melaninu, podporuje hydroxylaci L-tyrosinu na L-DOPA (L-3,4-dihydroxyfenylalanin) a poté podporuje oxidaci L-DOPA na dopachrom adopachinon, který syntetizuje melanin prostřednictvím autooxidačního procesu proteiny souvisejícími s tyrosinázou (TRP-1 a 2) v několika fázích [4–6]. Doposud se v kosmetickém průmyslu pro vývoj činidel pro bělení kůže široce používají metody inhibice tvorby melaninu inhibicí proteinů souvisejících s tyrosinázou [7,8]. Obvykle se však používají kyselina kojová, kyselina azelaová a hydrochinonbělení kůžeingrediencí, bylo hlášeno, že vyvolávají alergie a také způsobují kožní toxicitu a rakovinu [9]. Proto je výroba bezpečnějšího a účinnějšího bělícího prostředku na bázi přírodních složek považována za nezbytnost [10].

Kolagen je protein extracelulární matrix (ECM), který chrání pokožku tím, že jí dodává pevnost a napětí; pomáhá také oddálit proces stárnutí tím, že zabraňuje vráskám a ztrátě vlhkosti. ECM lze rozložit matricovými metaloproteinázami (MMP) [11]. MMP-1, běžně známá jako kolagenáza, částečně rozkládá kolagen typu 1, který tvoří kůži, zatímco MMP-9, známá jako želatináza, navíc depolymerizuje kolagen hydrolyzovaný MMP-1 [12]. Kromě toho bylo publikováno, že oxidační stres vyvolaný reaktivními formami kyslíku (ROS) urychluje syntézu těchto enzymů, což vede k degradaci ECM a v konečném důsledku k tvorbě vrásek [13]. Proto je nutné najít přírodní ingredience, které mohou inhibovat expresi TRP a MMP a které obsahují antioxidanty, které mohou odstraňovat reaktivní formy kyslíku, aby se zabránilo stárnutí pokožky snížením pigmentace a vrásek pokožky [14]. V poslední době, kdy se funkční přísady pro kosmetiku vyvíjely především v suchozemských rostlinách, se začala objevovat omezení při objevování nových druhů a stabilním přísunu přírodních přísad [15]. V důsledku toho vzrostl zájem o přírodní složky pocházející z mořských rostlin a poptávka po nich a z mořských zdrojů byla identifikována řada nových složek [16].

Sargassum thunbergiije druh hnědé makrořasy patřící do čeledi perníkovitých a pochází z pobřeží Koreje a Číny [17]. Je uznáván jako látka znečišťující moře, která způsobuje poškození mořských řas a rybích farem tím, že vyčerpává rozpuštěný kyslík [18]. Několik z nich se používá jako anthelmintická léčiva v tradiční terapii nebo jako kompost [19]. extrakt v roce 1995; od té doby si získala pozornost jako makrořasa s vysokým potenciálem pro použití při výrobě nových bioaktivních sloučenin [20]. Extrakce bioaktivních sloučenin pomocí konvenčních procesů, včetně mechanického vypuzování, superkritické extrakce, mikrovlnné extrakce a ultravysokotlaké extrakce, je spojena s omezeními, jako je nutnost použití přebytečného rozpouštědla, nízký výtěžek extrakce a vysoká spotřeba energie [21]. Vývoj nových extrakčních metod je jednou z hlavních výzev v technologických inovacích k zajištění bioaktivních sloučenin z makrořas [22]. Mezi konvenčními extrakčními procesy je ultrazvukem asistovaná extrakce (UAE) obzvláště atraktivní díky své jednoduchosti, nízkým nákladům na zařízení, vysokému výtěžku extrakce z různých matric, nízké spotřebě energie, menšímu množství potřebného rozpouštědla a kratší době [23]. Je známo, že SAE zahrnují vysokofrekvenční zvukové vlny 20–100 kHz [24]. Výtěžek extrakce je zvýšen pomocí ultrazvuku, což je přičítáno rozrušení rostlinných tkání, zmenšení velikosti částic a zvýšenému přenosu hmoty extraktů do rozpouštědla způsobeného kolapsem bublin, které vznikají opakovanou akustickou kavitací [25,26]. . Díky těmto výhodám jsou Spojené arabské emiráty uznávány jako levný, obnovitelný a účinný proces, který je široce používán v potravinářském průmyslu k extrakci funkčních složek ze suchozemské a vodní biomasy [27].

V této studii jsme tedy použili SAE k extrakci bioaktivních sloučenin z S. thunbergii a odvodili jsme optimální podmínky SAE, které umožňují maximální extrakci antioxidantů a takébělení kůžea přísady proti vráskám využívající statisticky založenou optimalizaci a různé inhibiční účinky exprese genů TRP-1, MMP-1 a MMP-9extraktem S. thunbergii byly vyhodnoceny za účelem ověření pleti - bělení aproti vráskámúčinky odvozených bioaktivních látek a potvrzují možnost využití extraktu S. thunbergii jako funkční kosmetické složky.

extrakt z cistanche

2. Výsledky a diskuse

2.1. Návrh experimentu

Přizpůsobení modelu je zásadní pro interpretaci přesnosti matematického modelu metodologie povrchu odezvy (RSM) pro predikci aktivity zachycující radikály (RSA), inhibiční aktivity tyrozinázy (TIA) a inhibiční aktivity kolagenázy (CIA).S. thunbergiivýpis. Centrální kompozitní design (CCD) RSM je experimentální návrhová metoda, která statisticky analyzuje odezvu vytvořenou nezávisle nebo interakcí dvou nezávislých proměnných ovlivňujících odezvy. CCD má výhodu efektivního odhadu zakřivení pomocí středového bodu a více axiálních bodů k předpovědi optimálních podmínek [28–30]. V této studii byl CCD použit k predikci optimálních podmínek UAE pro maximalizaci odpovědí, včetně RSA, TIA a CIA, extraktu S. thunbergii. Bylo kódováno 5 úrovní (− , −1, 0, 1, ) a bylo provedeno 17 experimentálních běhů jako základ na CCD (tabulka 1). Na základě našich předchozích studií byly vybrány 3 klíčové nezávislé proměnné, včetně doby extrakce (5,30~18,7 min), teploty extrakce (22,4~79,6 ◦C) a koncentrace ethanolu (0~99,5 procenta), aby se získala maximální úroveň závislých proměnných. [31]. Při vývoji kvadratického regresního modelu byly experimentální proměnné kódovány podle následující rovnice.

xi {{0}} (Xi − X0)/∆X (1)

kde xi je kódovaná hodnota proměnné Xi; X0 je hodnota X ve středu a ∆X je hodnota skokové změny.

Experimentální hodnoty pro 17 podmínek s rozdíly v době extrakce, extrakční teplotě a koncentraci ethanolu jsou uvedeny v tabulce 2.

2.2. Účinky podmínek SAE na RSA

Podle 17 podmínek platných pro těžbuS. thunbergiipři použití SAE, RSA byla 2,37~89,9 procenta s maximální hodnotou 12.0 min doba extrakce, 51.0 ◦C teplota extrakce a 50.{{11} } procenta koncentrace etanolu a minimální hodnota při 12.0 min doba extrakce, 51.0 ◦C teplota extrakce a koncentrace 99,5 procenta etanolu; to znamená, že koncentrace ethanolu měla největší vliv na RSA (tabulka 2). Jak navrhoval software Design-Expert, byla vybrána kvadratická regresní rovnice a přizpůsobena pro všechny tři nezávislé proměnné a odezvy. Pokud jde o kódované hodnoty, předpokládané odpovědi pro RSA, TIA a CIA mohly být vyjádřeny pomocí kvadratických regresních rovnic pomocí vícenásobné regresní analýzy (tabulka 3). Koeficienty CCD modelu byly validovány pomocí analýzy rozptylu (ANOVA) pro proměnné odezvy kvadratických regresních modelů shrnutých v tabulce 4. Pokud se koeficient determinace (R2), který představuje shodu mezi experimentálními a predikovanými hodnotami, blíží 1, znamená to přijatelný dobrý stav [32]. R2 rovnice kvadratické regrese pro predikci optimálních podmínek UAE s RSA byla 0,8554, což znamená, že lze zcela vysvětlit větší nebo rovnou 85,5 procenta výsledné předpokládané hodnoty, čímž se uznává vhodnost rovnice kvadratické regrese (Tabulka 3).

Významnost každé modelové proměnné byla stanovena pomocí hodnot p; p-hodnota<0.05 indicates="" significance="" whereas="" a="" p-value="" of="">0.05 označuje nevýznamnost na RSA [33]. Výsledky ANOVA optimalizační studie ukázaly, že model byl významný (p=0,0283), což bylo méně než nastavená hladina významnosti, což naznačuje, že významnost byla rozpoznána v rozmezí 5 procent. Výsledky tedy naznačují, že modely by mohly účinně předpovídat RSA, TIA a CIA extraktu S. thunbergii, když byly nezávislé proměnné v rozmezích zde uvedených. Při kontrole významnosti každé nezávislé proměnné jsme zjistili, že koncentrace ethanolu měla největší vliv na RSA (p=0,0025), zatímco vlivy doby extrakce (p=0,7418) a teploty (p=0.1622) byly nevýznamné (tabulka 4).

Abychom vyhodnotili účinek každé nezávislé proměnné na závisle proměnnou, vyjádřili jsme změnu RSA podle doby extrakce, extrakční teploty a koncentrace ethanolu jako poruchový graf (obrázek 1A).

V důsledku toho se nejvyšší hodnota objevila po 14,1 minutě doby extrakce a poté se snížila; maximální hodnota byla potvrzena při 60,7 ◦C a 46,2 procenta pro extrakční teplotu a koncentraci ethanolu, v daném pořadí. Při vizualizaci rychlosti změny RSA v důsledku interakcí mezi proměnnými pomocí trojrozměrné povrchové křivky odezvy však měla změna doby extrakce a teploty na RSA malý vliv, zatímco koncentrace ethanolu měla významný vliv (obrázek 2A, B).

To bylo podobné výsledkům studie Kim et al. identifikace vlivu koncentrace rozpouštědla na RSA extraktu Gynostemma pentaphyllum [34]. RSA měla tendenci se zvyšovat na maximum a pak klesat s koncentrací ethanolu, přičemž maximální hodnota byla 48,1 procenta koncentrace ethanolu. Změna polarity extrakčního roztoku v důsledku smíchání destilované vody a etanolu vede ke zvýšení antioxidačního účinku G. extrakty pentaphyllum a S. thunbergii. Kromě toho je to v souladu s výsledky, které uvádějí, že ve vodě rozpustné bioaktivní sloučeniny vyrobené extrakcí z řas horkou vodou vykazují nižší antioxidační aktivitu a že extrakty, které používají 50 procent ethanolu, vykazovaly vyšší antioxidační aktivitu, což naznačuje, že použití binárního rozpouštědla (voda a ethanol) produkující bioaktivní sloučeniny je přínosem pro zvýšení výtěžku extrakce [35,36].

2.3. Účinky podmínek SAE na TIA

TIA zS. thunbergiiextrakty podle 17 podmínek SAE použitých v experimentu jsou uvedeny v tabulce 2. Maximální hodnota TIA 92,6 procenta byla identifikována při 12.0 min, 79,6 stupni a 50.{{13} } procent a minimální hodnota 55,3 procenta byla předpovězena při 12.0 min, 51.{16}} stupni a 0.{{20}} procentech extrakce doba extrakce, teplota extrakce a koncentrace ethanolu. Následně bylo potvrzeno, že teplota extrakce a koncentrace ethanolu mají významný vliv na TIA. Na základě experimentálních výsledků jsme odvodili kvadratickou regresní rovnici pomocí CCD a použili ji k predikci optimálních podmínek SAE (tabulka 3). R2 bylo 0,8591, což ukazuje na 85,91 procentní shodu mezi hodnotami předpovězeného modelu a experimentálními daty a naznačuje, že kvadratická regresní rovnice byla vhodná pro predikci TIA. Pro odpovědi RSA, TIA a CIA byly modely vysoce významné, když vypočtené F-hodnoty byly vyšší než tabelované F-hodnoty a hodnoty pravděpodobnosti byly nízké (p < 0,001);="" to="" ukazuje,="" že="" jednotlivé="" termíny="" v="" každém="" modelu="" odpovědi="" byly="" významné="" z="" hlediska="" interakčního="" účinku="" [37].="" pro="" statistické="" vyhodnocení="" významného="" účinku="" kvadratické="" regresní="" rovnice="" byla="" použita="" anova.="" experimentální="" model="" byl="" významný="" (p="0" 0,0262),="" což="" ukazuje="" na="" hladinu="" významnosti="" do="" 5="" procent="" (tabulka="">

Když jsme vizualizovali rychlost změny TIA se změnou jedné proměnné při stanovení hodnot jiných proměnných, variace TIA v důsledku koncentrace ethanolu byla největší, přičemž maximální TIA bylo zjištěno při koncentraci ethanolu 76,8 % (obrázek 1B). Interakce nezávislých proměnných jsou vizualizovány pomocí trojrozměrné křivky povrchu odezvy při současné změně dvou proměnných (obrázek 3).

Jak se teplota a čas extrakce zvyšují, TIA se zpočátku zvyšuje; rozsah variací však není velký, takže jsme znovu potvrdili, že interaktivní účinek extrakční teploty a času není významný, jak bylo stanoveno pomocí ANOVA (obrázek 3A). Naopak TIA se zvyšovala a opět snižovala s koncentrací ethanolu, přičemž maximální TIA byla předpovězena při 75,6% koncentraci ethanolu (obrázek 3B). Tento výsledek je v souladu s výsledky studie Park, et al., která ukázala, že 70~80% koncentrace etanolu vede k vyšší TIA než voda při extrakci bioaktivních sloučenin z extraktu divoké rýže [38]. Tato studie uvádí, že koncentrace ethanolu byla hlavní proměnnou v TIA a má tendenci se měnit úměrně s koncentrací ethanolu.

2.4. Účinky podmínek SAE na CIA

Když jsme měřili CIA za každé ze 17 podmínek, zjistili jsme, že maximální hodnota CIA byla 92,3 procenta při 16.0 min, 63.0 stupních a 80.{{{{101} 12}} procent a minimální CIA byla 48,1 procent při 12.0 min, 51.{15}} stupni a 0.0 procentech doby extrakce, teplota extrakce, a koncentrace ethanolu, v daném pořadí (tabulka 2). Kvadratická regresní rovnice vytvořená podle doby extrakce, teploty a koncentrace ethanolu měla R2 0,9237, což znamená, že variace vzorku 92,37 procenta byla přisouzena nezávislým proměnným a pouze 7,63 procenta z celkových variací nebylo možné vysvětlit pomocí model (tabulka 3). To ukazuje na dobrý stupeň korelace mezi předpokládanými a experimentálními hodnotami CIA a uznává její vhodnost pro predikci experimentálního modelu [39]. ANOVA prokázala statistickou významnost (p=0,0037) pod hladinou významnosti 1 procento a potvrdila, že teplota extrakce (p=0,0030) a koncentrace etanolu (p=0,0006) mezi lineárními členy byly nezávislé proměnné, které významně ovlivnily CIA (tabulka 4).

Abychom vyhodnotili účinky každé nezávislé proměnné na CIA, porovnali jsme CIA se změnou v jedné proměnné pomocí grafu poruch (obrázek 1C). Jak se nezávislá proměnná zvyšovala, CIA se zpočátku zvýšila na maximální hodnotu a bylo zjištěno, že koncentrace ethanolu je nejvlivnější. Trojrozměrná povrchová křivka odezvy představovala změnu CIA v důsledku interaktivních účinků nezávislých proměnných, které měly tendenci se zvyšovat a snižovat s dobou extrakce a koncentrací ethanolu. CIA se zvyšovala se zvyšující se dobou extrakce a koncentrací ethanolu, což ukazuje maximální CIA při 12,1 minutě doby extrakce a koncentraci ethanolu 73,6 %. Změny v CIA s teplotou extrakce a koncentrací ethanolu při konstantní době extrakce také měly tendenci být stejné; nicméně se potvrdilo, že variace v CIA s koncentrací ethanolu jsou významnější (obrázek 4B).

Maximální hodnota CIA předpokládaná pomocí CCD byla 93,8 procenta s dobou extrakce 14,5 min, extrakční teplotou 65,1 ◦C a koncentrací ethanolu 69,3 procenta. To bylo více než dvakrát vyšší než 39,4 procenta a 40,3 procenta CIA pro extrakty ze zeleného čaje a bílého čaje z horké vody zjištěné v předchozí studii [40]. Na závěr,S. thunbergiiextrakt byl považován za schopný být použit jako funkční kosmetická přísada k redukci vrásek, protože omezuje aktivitu kolagenázy.

2.5. Optimalizace procesu SAE

Identifikovat optimální podmínky SAE pro extrakcibělení kůžea bioaktivních sloučenin proti vráskám z extraktu S. thunbergii jsme získali optimální bod, který maximalizuje závislé proměnné překrýváním jednotlivých povrchů odezvy RSA, TIA a CIA (obrázek 5).

Když byl rozsah nezávislých proměnných omezen na dobu extrakce 5,30~18,7 min, extrakční teplotu 22,4~79,6 ◦C a koncentraci ethanolu 0~99,5 procenta, byly předpovězeny optimální podmínky UAE doba extrakce 12,0 min, teplota extrakce 65,2 °C a koncentrace ethanolu 53,5 %. Optimální podmínky pro Spojené arabské emiráty byly odvozeny na základě kritéria minimalizace doby extrakce, protože krátká doba procesu je přínosem pro snížení nákladů na proces. Za optimálních odvozených podmínek SAE bylo předpovězeno 86,5 procenta, 88,3 procenta a 91,4 procenta RSA, TIA a CIA. V předchozích studiích Yuan et al. uvedli, že optimální podmínky pro extrakci bioaktivních sloučenin ze S. thunbergii byly následující: poměr kapaliny k pevné látce 120 ml/g, doba extrakce 210 min a teplota extrakce 97 °C [41]. Zatímco Yuan a spol. optimalizoval podmínky extrakce horkou vodou pro extrakci bioaktivních sloučenin, v této studii byly optimalizovány podmínky SAE pro extrakci bioaktivních sloučenin. Proto se ukázalo, že podmínky SAE při krátké době extrakce a nízké teplotě jsou účinným extrakčním procesem pro bioaktivní sloučeniny ve srovnání s předchozími procesy extrakce horkou vodou.

Pro ověření výsledků byl proveden potvrzovací experiment se třemi replikáty za optimálních podmínek, jak předpověděl model CCD. Když byly experimentální hodnoty RSA, TIA a CIA vyhodnoceny za optimálních podmínek, byly 88,9 procenta ± 3,11 procenta , 85,1 procenta ± 2,76 procenta a 89,7 procenta ± 4.09 procent a vykázaly hodnotu silná shoda s hodnotami prediktivního modelu (p > 0,05). Proto byly experimentální hodnoty v dobré shodě s předpokládanými hodnotami, což dokazuje spolehlivost výsledků optimalizace SAE.

2.6. Exprese mRNA TRP-1, MMP-1 a MMP-9

TRP-1 funguje jako oxidáza 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylové kyseliny, o které je známo, že je hlavní příčinou pigmentace kůže, která působí stimulací tyrosinázy a eumelaninsyntézou v epiteliálních buňkách [42]. Naproti tomu MMP-1 a MMP-9 rozkládají kolagen typu 1, který tvoří 90 procent dermální vrstvy, a tím způsobuje degradaci kolagenu, ztrátu elasticity a stárnutí kůže [43].

V této studii,S. thunbergiiextrakt byl vyroben za použití optimálních podmínek SAE stanovených pomocí statisticky založené optimalizace a extrakt byl testován na buněčných liniích B{{0}}F0, aby bylo možné vyhodnotitbělení kůžeaproti vráskámvlastnosti jejich porovnáním úrovní exprese RNA TRP{{0}}, MMP-1 a MMP-9. Bylo zjištěno, že hladina exprese TRP-1, hlavního genu souvisejícího se syntézou melaninu, je uS závislá na koncentraci. thunbergii a významně se snížily po ošetření 1 a 2 mg/ml extraktu ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,05)="" (obrázek="">

Také jsme zjistili, že exprese MMP{{{{10}}}} a MMP-9 klesaly úměrně s koncentrací extraktu S. thunbergii (obrázek 6B, C). Zejména hladiny exprese MMP-1 a MMP-9 byly inhibovány o 58,6 procenta a 78,8 procenta, v daném pořadí, ve skupině léčené 2 mg/ml extraktu S. thunbergii ve srovnání s kontrolními skupinami (p < 0,05).="" z="" výše="" uvedených="" výsledků="" bylo="" potvrzeno,="" že="" extrakt="" s.="" thunbergii="" produkovaný="" za="" optimálních="" podmínek="" uae="" může="" účinně="" inhibovat="" mrna="" expresi="" trp-1,="" mmp-1="" a="" mmp-9="" inb16-="" f0="" buněčné="" linie,="" čímž="" inhibuje="" produkci="" melaninu="" a="" rozklad="">

2.7. Identifikace kyseliny kávové v extraktu S. thunbergii

V předchozím experimentu SAE podmínky pro maximalizaci antioxidantu, bělení kůže aproti vráskámbyly optimalizovány účinky extraktu S. thunbergii; byly však zapotřebí další studie k prozkoumání bioaktivních složek v extraktu. Proto fenolické sloučeniny zS. thunbergiiextrakty byly identifikovány pomocí kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS), protože tato technologie umožňuje přesnou identifikaci fenolických sloučenin se strukturní charakterizací a detekci malých molekul v přírodních zdrojích. Identifikace píku byla založena na retenčním čase (RT), prekurzorových iontech a příbuzných fragmentových iontech standardů. V systému LC-MS/MS vykazovala kyselina kávová pík při 1,95 min RT (obrázek 7).

V režimu záporných iontů iont m/z 179,10, který vykazoval jeden ze dvou iontových píků v hmotnostním spektru, odpovídá molekulovému vzorci kyseliny kávové a oddělenému fragmentovému iontu m/z 135,56. Obecně po disociaci vyvolané kolizí fenolové sloučeniny produkují fragmentový iont charakterizovaný ztrátou C02 (44 Da) ze skupiny karboxylové kyseliny. V důsledku této ztráty, následné odštěpení 44-Da CO2 z iontu při m/z 179,10 dalo iontu při m/z 135,56. Kyselina kávová je C6-C3 fenolová sloučenina produkovaná rostlinami z fenylalaninu nebo tyrosinu prostřednictvím šikimátové dráhy sekundárního metabolismu a je zástupcem třídy kyseliny skořicové (nebo fenylpropanoidu). Do lidské stravy se dostává prostřednictvím několika druhů zeleniny a ovoce [44]. V posledních letech četné studie ukázaly, že konzumace kyseliny kávové má četné zdravotní přínosy díky antioxidačním vlastnostem, které pomáhají předcházet různým onemocněním spojeným s oxidačním stresem [45]. Tato studie o fenolových sloučeninách je tedy velmi užitečná a může hrát důležitou roli v procesu kontroly kvality a budoucím průzkumu S. thunbergiias složky sbělení kůžeaproti vráskámvlastnosti.

3. Materiály a metody

3.1. Materiály a činidla

S. thunbergiishromážděný z jižního pobřeží ostrova Jeju v Koreji v říjnu 2019 bylo zakoupeno v Para Jeju (Jeju, Korea). Před experimentem byla S. thunbergii rozdrcena na prášek pod 0,42 mm pomocí mlýnku (HMF-3000S, Hanil Co., Wonju, Korea) a skladována v chladničce při -5°C. Ethanol pro extrakci rozpouštědlem byl zakoupen od SamchunChemical Co. (95,0 v/v procent, Pyungtaek, Korea). Kyselina askorbová (vitamín C), arbutin a kyselina kojová použité jako standardy pro kontrolní testy byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA). Všechny ostatní chemikálie použité v tomto experimentu byly analytické čistoty.

3.2. Proces SAE

Sušený prášek vzorku (1 g) byl umístěn do tlakové nádoby (XF100, AntonPaar Co., Ltd., Graz, Rakousko) s 10 ml rozpouštědla a míchá se pomocí vortexového mixéru (VM-10, Daihan sci. Co., Wonju, Korea) po dobu 1 minuty. Tyto vzorky byly extrahovány za 17 jednotlivých podmínek SAE odvozených z CCD s dobou extrakce 5,30~18,7 min, extrakční teplotou 22,4~79,6 °C a koncentrací ethanolu 0,0~99,5 procenta. Spojené arabské emiráty byly provedeny pomocí ultrazvukového zařízení (SD-D250H, Sungdong Co., Soul, Korea) s elektrickým výkonem 200 W a frekvencí 40 kHz vybaveného digitálním časovačem a regulátorem teploty. Po extrakci byl supernatant separován při 10,000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut pomocí centrifugy (1236R, Labogene Co., Daejeon, Korea). Poté byl roztok zfiltrován přes diskový filtr z acetátu celulózy s porozitou 0,45 um a použit pro analýzy RSA, TIA a CIA (obrázek 8).

3.3. Návrh experimentu

K maximalizaci extrakce bioaktivních sloučenin zS. thunbergiiprostřednictvím optimalizace podmínek SAE pomocí CCD. Jako nezávislé proměnné byly vybrány klíčové proměnné včetně doby extrakce (X1), teploty extrakce (X2) a koncentrace ethanolu (X3) a byly kódovány do 5 úrovní (−1,68, −1, 0, 1, 1,68). , jak je uvedeno v tabulce 1. RSA, TIA a CIA byly nastaveny jako závislé proměnné ovlivněné hlavními nezávislými proměnnými. Experimentální hodnoty byly získány za 17 podmínek generovaných CCD a korelace každé nezávislé a závislé proměnné byla kvantifikována pomocí kvadratické regresní rovnice [46]. K výpočtu hodnot závislých proměnných podle změn v nezávislých proměnných byla použita následující rovnice kvadratické regrese:

Y = β0 + k ∑ i = 1 βiXi + k ∑ i = 1 βiiX 2 i + k ∑ i>1 ijXiXj(2)

kde Y představuje závislé proměnné (RSA, TIA, CIA), 0 je konstantní koeficient a k je testovací proměnná. i, ii a ij jsou regresní koeficienty pro lineární, kvadratické a interakční členy.

Pro vyhodnocení předpokládaného modelu na nezávislé proměnné byla provedena analýza rozptylu (ANOVA) s 95procentní úrovní spolehlivosti, aby se vyhodnotil účinek každé proměnné včetně extrakční teploty, času a koncentrace ethanolu. Kromě toho byl ke stanovení způsobilosti regresního modelu použit regresní koeficient (R2), p-hodnota regresního modelu [47].

3.4. Test aktivity zachycování radikálů (RSA).

Antioxidační účinekS. thunbergiiextrakt byl hodnocen na základě jejich scavengingové aktivity na 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylových (DPPH, Sigma-Aldrich) volných radikálech pomocí modifikovaného testu DPPH [48]. Zásobní roztok byl připraven rozpuštěním 0,1 M DPPH v methanolu a poté skladován při teplotě místnosti. Zředěný roztok DPPH s methanolem byl připraven k získání absorbance 1.0 ± 0.02 při 517 nm pomocí UV-visspektrofotometru (Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea) . 1,25 ml alikvot roztoku DPPH byl smíchán s 0,25 ml zředěného extraktu S. thunbergii (50–500 mg/ml) a ponechán stát při pokojové teplotě ve tmě po dobu 20 minut. Změna absorbance byla monitorována při 517 nm a RSA byla vypočtena pomocí následujícího vzorce:

RSA ( procento )={1 −Abs (vzorek) / Abs (kontrola)} × 100 (3)

kde Abs (kontrola) je absorbance kontroly a Abs (vzorek) je absorbance extraktu. Stejná koncentrace kyseliny askorbové (50–500 mg/ml) byla použita jako pozitivní kontrola.

3.5. Test inhibiční aktivity tyrosinázy (TIA).

TIA byla měřena podle metody popsané Yagi [49]. Reakční směs obsahovala 0,4 ml pufru fosforečnanu sodného (67 mM, pH 6,8), 0,2 ml 10 mM3, {{10}} dihydroxyfenylalanin (L-DOPA, Sigma-Aldrich), 0,2 ml houbové tyrosinázy (125 jednotek/ml, Sigma-Aldrich) a 0,2 ml roztoku extraktu. Reakce byla prováděna při 25 °C po dobu 30 minut. Po reakci byla měřena absorbance při 475 nm a výsledky byly porovnány s kontrolou. TIA byla vypočtena podle níže uvedené rovnice:

TIA ( procento )={1 −Abs (vzorek) / Abs (kontrola)}× 100 (4)

kde Abs (kontrola) je absorbance kontroly a Abs (vzorek) je absorbance extraktu.

cistanche snižují aktivitu tyrosinázy

3.6. Test inhibiční aktivity Collagemase (CIA).

Test CIA byl proveden podle metody popsané Wünschem a Heindrichem [50]. Kolagenáza (0,2 mg/ml, Sigma-Aldrich) byla rozpuštěna v 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Substrát, 4-fenylazobenzyloxykarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0,4 mg/ml, Sigma-Aldrich), byl rozpuštěn v 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) obsahující 4 mM CaCl2. Reakční směs pro hodnocení hydrolýzy kolagenu obsahovala kolagenázu (75 ul), vzorek (50 ul) a roztoky substrátu (125 ul). U kontrolní skupiny bylo do reakční směsi místo extraktu přidáno 50 ul destilované vody. Směs byla ponechána inkubovat při 37 °C po dobu 30 minut a bylo přidáno 0,25 ml 25 mM kyseliny citrónové pro ukončení enzymových reakcí. Po smíchání s ethylacetátem se supernatant oddělil a změřila se absorbance při 320 nm. Procento inhibice bylo vypočteno podle následujícího vzorce:

CIA ( procenta ) ={1 −Abs (vzorek)/Abs (kontrola)}× 100 (5)

kde Abs (kontrola) je absorbance kontroly a Abs (vzorek) je absorbance extraktu.

3.7. Validace modelu

Optimalizované podmínky pro SAE (doba extrakce, teplota extrakce a koncentrace ethanolu) byly validovány in vitro hodnocením antioxidační aktivity,bělení kůžea účinky proti vráskám (RSA, TIA a CIA) podle hodnot získaných z CCD. Všechny odezvy byly opět stanoveny za optimalizovaných podmínek SAE. Experimentální hodnoty byly porovnány s hodnotami predikovanými modelem za účelem posouzení jeho platnosti. LC-MS/MS analýza byla provedena na extraktech generovaných za optimálních podmínek pro nalezení hlavních složek vS. thunbergiivýpis.

3.8. Buněčná kultura

Buňky melanomu B{0}}F0 byly zakoupeny od Korean Cell Line Bank Co. (KCLB, Soul, Korea) a byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM, Gibco BRL Co., Ltd., Gaithersburg , MD, USA) s obsahem 10 procent fetálního hovězího séra a 1 procenta penicilinu (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). Buňky byly inkubovány při 37 °C s 5 procenty CO2 (MCO-5AC, Sanyo Co., Ltd., Tokio, Japonsko) a pěstovány jako monovrstva v kultivačních nádobách o objemu 25 cm2. Když buněčná linie dosáhla přibližně 80 procent konfluence, byla provedena subkultivace ošetřením trypsin-EDTA, aby se získaly jednotlivé buňky pro zajištění správného růstu a zdraví buněk.

3.9. Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR)

Pro provedení RT-PCR bylo naneseno 1.0 × 106 buněk na jamku 24-jamkové destičky. TotalRNA byla extrahována z buněk pomocí univerzální sady pro extrakci RNA AccuPrep (BioneerCo., Daejeon, Korea). Reverzní transkripce byla provedena s 0,5 ug celkové syntézy RNA forcDNA s použitím amfiRivert cDNA syntézy platinové master mix (GenDEPOTCo., TX, USA). cDNA byla amplifikována s každým primerem, jako je TRP-1, MMP-1, MMP-9 a -aktin (tabulka 5). PCR byla provedena v objemu 20 ul obsahujícím 1 ul cDNA, 10 ul LTaq Premix (Genet bio, Daejeon, Korea) a 9 ul diethylpyrokarbonátu (DEPC). Podmínky PCR byly následující: 94 ◦C po dobu 5 minut, následovalo 25 cyklů při 95 ◦C po dobu 5 s, 60 ◦C po dobu 31 s (pro TRP-1) nebo 55 ◦C po dobu 30 s (pro MMP{ {26}}) nebo 59 ◦C po dobu 30 s (pro MMP-9) a 72 ◦C po dobu 30 s. Každý produkt PCR byl podroben elektroforéze na 1% agarózovém gelu a vizualizován pomocí systému Gel Doc TM XR plus a softwaru množství jedna (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA). -Aktin jako provozní gen byl použit k normalizaci hladin exprese TRP-1, MMP-1 a MMP-9.

3.10. LC-MS/MS analýza

Chromatografická separace extraktu S. thunbergii byla provedena pomocí Finni gan Surveyor Plus HPLC System (Thermo Electron Corporation, San Jose). Separace bylo dosaženo použitím kolony ROC C18 s délkou kolony 150 mm, vnitřním průměrem 3 mm a velikostí částic 3 µm (RESTEK Co., Bellefonte, PA, USA) při použití gradientové eluce 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě (mobilní fáze A) a 0,1 procenta kyseliny mravenčí v acetonitrilu (mobilní fáze B) při průtoku 0,2 ml/min, následovně: 5 procent až 100 procent mobilní fáze B po dobu 11 minut, 100 procent až 5 procent mobilní fáze B po dobu 4 minut, 37 procent mobilní fáze B po dobu 2 minut, 37 procent až 10 procent mobilní fáze B po dobu 0,1 minuty a 10 procent mobilní fáze B po dobu 2,4 minuty . Nástřikový objem byl 10 ul a kolona byla udržována při 30 °C. Hmotnostní spektrometrické experimenty byly provedeny za použití Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra EMR trojitého kvadrupolemasového spektrometru (Thermo Fisher Sci. Inc., Waltham, MA, USA). Extrakt S. thunbergii byl analyzován negativní iontovou elektrosprejovou ionizací za použití elektrosprejové ionizace (ESI), konkrétně s využitím turbo iontového sprejového režimu. Nastavení zdroje ESI pro ionizaci extrakce S. thunbergii v negativním módu bylo následující: teplota plynu, 270 ◦C; průtok plynu, 19 l/min; teplota plynu v plášti, 400 ◦C; průtok pláště plynu, 10 l/min; kapilární napětí, 3000 V; napětí trysky, 1000 V. Hmotnostní spektra byla zaznamenána v negativním iontovém módu mezi 100 a 500 m/z za použití dusíku jako srážkového plynu. Analýza hlavních komponent vS. thunbergiiExtrakt byl proveden porovnáním získaných molekulárních a fragmentačních vzorů výsledků LC-MS/MS s daty z literatury a s hmotnostní knihovnou pro standardní sloučeniny.

4. závěr

Tato studie navrhla optimální podmínky pro proces SAE, který může maximalizovat antioxidační,bělení kůže, aproti vráskámúčinky na produkci bioaktivních sloučenin s přidanou hodnotou ze S. thunbergii, které jsou rozšířené na subtropickém pobřeží jihovýchodní Asie a způsobují znečištění moří a ekologické narušení. Nejvlivnější proměnnou při provádění optimalizace SAE byla koncentrace ethanolu, která potvrdila, že použití a stanovení koncentrace binárních rozpouštědel sestávajících z vody a ethanolu bylo v SAE důležitým faktorem. Při překrytí každé reakční plochy pro současnou optimalizaci RSA, TIA a CIA byla předpovězena doba extrakce 12.0 min, teplota extrakce 65,2 ◦C a koncentrace etanolu 53,5 procenta, za jakých podmínek RSA byly identifikovány hodnoty 86,5 procenta, hodnoty TIA 88,3 procenta a hodnoty CIA 91,4 procenta.

Když byly účinky TRP-1, MMP-1 a MMP-9 na expresi hodnoceny na úrovni mRNA pomocí extraktu S. thunbergii vyrobeného za optimálních podmínek SAE, bylo potvrzeno, že extrakt S. thunbergii může snížit hladiny mRNA TRP-1, MMP{4}} a MMP-9, a tím zabránit produkci melaninu a také rozkladu kožního kolagenu.

Tím pádem,S. thunbergiiOčekává se, že extrakt bude široce využíván jako nový zdroj z mořské biomasy při výrobě funkčních přísad pro kosmetiku, potraviny a léky. Kromě toho se předpokládá, že proces extrakce bioaktivních sloučenin pomocí SAE poskytuje základní údaje o vývoji procesu a přispívá k stanovení optimálních extrakčních podmínek při výrobě nových funkčních složek z S.thunbergii a dalších makrořas.